INTRODUCCIÓN

El sistema de almacenaje denominado silo bolsa constituye una alternativa para los granos de cereales y oleaginosas. Las bolsas tienen un alto grado de hermeticidad a los gases (O₂ y CO₂) por lo que el incremento del CO₂ producto de la respiración reduce el desarrollo de los insectos y hongos evitando el deterioro de los granos (^{Bartosik, 2012}).

El maíz es susceptible a la infección fúngica y a la contaminación con micotoxinas durante el cultivo y en el almacenamiento. Este evento es regido por factores extrínsecos, factores intrínsecos, y factores implícitos (^{Torres et al., 2003}; ^{Hammond et al., 2004}; ^{Marín et al., 2004}; ^{Sanchis et al., 2007}; ^{Giorni et al., 2009}; ^{Castellari, 2017}).

Las especies micotoxigénicas aisladas de granos de maíz con mayor frecuencia pertenecen a los géneros Fusarium y Aspergillus (^{Gregori et al., 2013}) mientras que las especies de Penicillium y Talaromyces son las que se aíslan con mayor frecuencia entre las poblaciones no micotoxigénicas (^{Castellari et al., 2015}). Los resultados del análisis de micotoxinas en maíz revelaron que entre el 90 y 100% de las muestras están contaminadas con fumonisinas (FB) (^{Pacin et al., 2009}) el 10% con zearalenona y deoxinivalenol, y entre el 10 y 50% con aflatoxinas (AF) (^{Garrido et al., 2012}).

De las especies de Fusarium, F. verticillioides productora de FB es aislada con mayor frecuencia en maíz cultivado en regiones templadas de Argentina y otros países (^{Marín et al., 2013}). Diversos estudios evaluaron la ocurrencia de la especie en diferentes etapas del cultivo (^{Martínez et al., 2010}; ^{Picot et al., 2011}), de la cosecha y el almacenamiento de los granos (^{Marcos Valle, 2015}). En regiones agrícolas con temperaturas cálidas, el maíz es contaminado con mayor frecuencia por A. flavus, por lo que su ocurrencia es estudiada en la región centro y norte de la Argentina (^{Chulze et al., 1989}; ^{Pacin et al., 2001}a; Pacin et al., 2001b; ^{Mutti et al., 2009}; ^{González Pereyra et al., 2011}) y en otros países con características climáticas similares (^{Sekiyama et al., 2005}; ^{García y Heredia, 2006}; ^{Giorni et al., 2007}).

El estudio de las relaciones entre las especies fúngicas asociadas a distintas matrices, donde no existen limitaciones en el intercambio gaseoso, reveló diferentes estrategias de competencia (^{Benhamound y Brodeur, 2000}; ^{Baig et al., 2012}; ^{Quiroz-Sarmiento et al., 2008}; Leggieri et al., 2919). Sin embargo, las interacciones entre especies micotoxigénicas en ambientes herméticos, como en los silos bolsa que almacenan granos, no fue estudiada y se cree que niveles de O₂ menores a 5% afectarían las estrategias de competencia y colonización. El objetivo del trabajo fue estudiar las interacciones entre F. verticillioides, A. flavus y T. funiculosus, in vitro, en ambientes herméticos con diferente composición inicial de O₂ y CO₂, y determinar cambios en el crecimiento y alteraciones en las estructuras somáticas y reproductivas que afecten la colonización y la persistencia.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamientos fúngicos

Se evaluaron 18 aislamientos de F. verticillioides, A. flavus y T. funiculosus, seis de cada especie, obtenidos de granos de maíz almacenados en silos bolsa, ubicados en tres localidades (Balcarce, General Alvarado y Tandil) de la zona sudeste de la provincia de Buenos Aires (37°45' S; 58°18' W; 130 msnm), Argentina. Las muestras de granos de maíz se tomaron en dos tiempos del almacenamiento: al inicio (T1: 10 días) y al final (T2: 150 días), coincidiendo con las estaciones de invierno (año 2010) y verano (año 2011). La identificación se realizó empleando la taxonomía convencional (^{Nelson et al., 1983}; ^{Summerell et al., 2003}; ^{Pitt y Hocking, 2009}) y la molecular para confirmar F. verticillioides y A. flavus (Cheverri y Samuels, 2003)

En ambos tiempos de muestreo se registraron las concentraciones de O₂ y CO₂ en las bolsas (in situ) con un medidor de gases portátil (Check Point, PBI, DanSensor, Dinamarca) y el pH de los granos de las muestras, en el laboratorio con un peachímetro digital y portátil (Oakton modelo PH11, N° serie 203852), según protocolo de ^{Castellari et al. (2015}).

Obtención de inóculos

Cada aislamiento fúngico fue sembrado en placas de Petri de 90 mm de diámetro con medio agar papa glucosa (2%) (APG) (Britania^®) al que se le adicionó cloranfenicol (Sigma^®) al 0,02%. Las placas se incubaron siete días a 25°C, en oscuridad. El micelio y los conidios de cada placa fueron extraídos con 2 mL de una solución de glicerol (Biopak^®) estéril (35% v/v), colocados en tubos eppendorf de 1,5 mL y conservados en freezer a -20°C. Los aislamientos están depositados y disponibles en el cepario del Laboratorio de Microbiología de Suelos y Alimentos de la Unidad Integrada Balcarce (EEA INTA Balcarce-Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Mar del Plata (UNMdP), Argentina).

Determinación de la tasa de crecimiento

El inóculo de cada aislamiento fue ajustado en 10⁶ propágulos mL^-1, en solución de NaCl (0,8%) y 3 |jL del stock se sembró en cuatro placas de Petri conteniendo medio APG (Britania®) con dos niveles de pH: 6,5 (pH de los granos en T1) y 5,6 (pH de los granos en T2). Las placas se incubaron sin restricción de O₂, a 25°C y a partir del tercer día y durante siete días se registró el diámetro de las colonias (mm). Se midieron dos diámetros de cada colonia, se obtuvo el promedio de cada una y por especie y, se calculó la tasa de crecimiento (mm día^-1).

Los datos fueron analizados empleando el paquete Rcmder (R Core Team, 2012). Se realizó un análisis de la varianza (ANOVA) considerando el efecto del pH sobre el diámetro de las colonias. Las diferencias entre las medias se determinaron con el test de comparaciones múltiples del paquete agricolae (Tukey, 5%) (R Core Team, 2012).

Detección de la inhibición del crecimiento confrontado entre A. flavus, F. verticillioides y T. funiculosus

Todos los aislamientos fueron inoculados de a pares en los extremos opuestos de placas de Petri con medio APG (Britania®) ajustado con dos niveles de pH: 6,5 y 5,6. Cada par de aislamientos fue evaluado por cuadruplicado. Paralelamente, cada aislamiento fue sembrado individualmente en el mismo medio de cultivo con el objeto de medir el crecimiento en ausencia del antagonista.

Las placas se incubaron a 25°C en oscuridad, durante siete días, o hasta que el micelio del aislamiento que creció solo cubrió por completo la superficie del medio de cultivo. A los siete días se midió el radio de la colonia de cada uno de los aislamientos, creciendo confrontados y solos. Se calculó el promedio de la medición de tres radios para cada aislamiento y para cada especie (mm ± SD), por cada nivel de pH. Se determinó el porcentaje de inhibición del crecimiento de ambas especies confrontadas, respecto de cada una de ellas creciendo sola.

Los datos se analizaron por medio de un ANOVA y se determinó el efecto del crecimiento confrontado y del pH del medio de cultivo sobre el radio de crecimiento de la colonia.

Las interacciones entre los pares de aislamientos se caracterizaron macroscópicamente utilizando un microscopio estereoscópico (ZEISS 47526, f = 100, Alemania) y se determinó el tipo de interacción de acuerdo con ^{Magan y Lacey (1984}).

Ambiente hermético de crecimiento confrontado entre A. flavus, F. verticillioides y T. funiculosus

El efecto del ambiente hermético sobre las interacciones entre las hifas de las tres especies se evaluó con la técnica de microcultivos de ^{Paul (1999}) modificada, ya que no se utilizó formaldehído para fijar las estructuras y, en su reemplazo, se retiró el cubreobjeto, dejando secar el portaobjeto en cercanía de la llama de un mechero. Para describir las interacciones se utilizó la escala de ^{Magan y Lacey (1984}). Paralelamente, se caracterizó en el tiempo la composición de gases del ambiente hermético en el interior de frascos (de 1,550 cm³ de capacidad) donde crecieron confrontadas las tres especies. Las composiciones iniciales de gases en el interior de los frascos fueron: T1: 21% de O₂ y 0% de CO₂; y T2: 5% de O₂ y 15% CO₂ (las concentraciones correspondieron a las registradas en las bolsas herméticas que almacenaron maíz en T1 y T2, respectivamente). Se confeccionaron cuatro frascos por cada composición de gases. La mezcla 2 fue adquirida a la Empresa Air Liquide Argentina S.A., en cilindros de aluminio de 1 L (volumen de agua) con balance nitrógeno. El regulador utilizado fue un regulador Alphagaz, cuerpo inoxidable y presión de salida de 0 a 8 bar. Para el llenado de los frascos, una vez colocadas las placas con los microcultivos se utilizó la técnica de vacío: bomba de vacío DVL 150, de vacío máximo 0,030 mm Hg; desplazamiento 50 Hz - 150 L min^-1. La presión de trabajo de vacío fue de 68 mm Hg min^-1 y el tiempo para lograr el vacío fue de 2 min. La presión de trabajo de llenado con la mezcla fue de 5 L min^-1, logrando el llenado con 4 min de trabajo, aproximadamente.

Para lograr la hermeticidad del frasco luego del llenado se utilizó sellador universal de silicona 3M^® en el septo, colocado en la tapa. Se registró diariamente la evolución de la concentración de O₂ y CO₂ con un medidor de gases portátil (Check Point, PBI, DanSensor, Dinamarca). Las mediciones finalizaron cuando se registraron tres lecturas consecutivas diarias de 0% de O₂. Los pares de datos se presentaron en gráficos que permitieron observar la evolución diaria de las concentraciones de O₂ y CO₂ conforme avanzó el crecimiento confrontado de las especies.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Caracterización del crecimiento de A. flavus, F. verticillioides y T. funiculosus en ambiente sin restricción de O ₂

Los diámetros de las colonias de A. flavus a los siete días de incubación fueron de 73,9 (± 4,60) mm y 77,3 (± 3,40) mm para niveles de pH de 5,6 y 6,5, respectivamente. Se detectó un efecto del tiempo (P < 0,001) y pH (P < 0,001), sobre el diámetro de las colonias, el que se incrementó diariamente y en el medio de cultivo con menor acidez (pH 6,5). Las velocidades promedio de crecimiento observadas para esta especie fueron de 4,41 mm día^-1 y 4,58 mm día^-1, para los niveles de pH 5,6 y 6,5, respectivamente.

La velocidad de crecimiento de F. verticillioides fue menor que la registrada para A. flavus. Los diámetros de las colonias a los siete días de incubación fueron de 53,4 (± 10,07) mm y 71,1 (± 10,36) mm para niveles de pH de 5,6 y 6,5, respectivamente. Se detectó un efecto (P = 0,0117) de interacción entre pH y tiempo. A partir del tercer día de incubación los diámetros de las colonias desarrolladas en pH 6,5 se incrementaron significativamente (P < 0,05). No se observó incremento significativo (P > 0,05) de los diámetros, para ambos niveles de pH entre el sexto y séptimo día de incubación. Las velocidades de crecimiento promedio fueron de 2,28 mm día^-1 y de 3,2 mm día^-1 para los pH de 5,6 y 6,5, respectivamente.

T. funiculosus no fue afectada (P > 0,05) por el pH del medio de cultivo para crecer en condiciones sin restricción de O₂. Sólo se observó un efecto del tiempo de incubación (P < 0,001) sobre el diámetro de las colonias. Para ambos niveles de pH, los diámetros se incrementaron significativamente (P < 0,05) entre el primer y séptimo día, desde el inicio de las mediciones. Las velocidades de crecimiento para T. funiculosus fueron de 3,60 mm día^-1 y 3,48 mm día^-1 para los niveles de pH de 5,6 y 6,5, respectivamente.

Antagonismo entre A. flavus, F. verticillioides y T. funiculosus en ambientes sin restricción de O ₂

La reducción de los diámetros de las colonias se observó cuando las especies crecieron confrontadas. A. flavus ejerció un efecto inhibitorio mayor sobre F. verticillioides, que éste sobre A. flavus (Tabla 1). El pH del medio de cultivo no afectó (P > 0,05) el desarrollo de ambas especies creciendo en confrontación (A. flavus: P = 0,455; F. verticillioides: P = 0,8722). Para el caso de A. flavus creciendo con F. verticillioides, las hifas presentaron una interacción de tipo A (mezcla de hifas en el encuentro) de acuerdo con la clasificación de ^{Magan y Lacey (1984}).

El pH no afectó (P > 0,05) el crecimiento de T. funiculosus en cultivo puro; sin embargo, este factor sí afectó el crecimiento de las colonias de T.

Tabla 1 Inhibición de A. flavus y F. verticillioides creciendo en confrontación en ambiente sin restricción de O₂. Table 1. Inhibition of A. flavus and F. verticillioides in confrontation, in an environment without O₂ restriction. 

funiculosus (P = 0,018) y también de F. verticillioides (P = 0,0036) creciendo en confrontación. Los mayores radios de crecimiento para T. funiculosus se observaron en el medio con pH 5,6, mientras que para F. verticillioides los mayores radios de crecimiento se registraron en el medio con pH 6,5 (Tabla 2).

T. funiculosus, en presencia de F. verticillioides, presentó una esporulación que cubrió rápidamente la superficie de placa de crecimiento a los tres días de incubación, e inhibió el crecimiento de F. verticillioides.

Al examinar los aislamientos de A. flavus creciendo en confrontación con los de T. funiculosus, se observó que los primeros fueron limitados en su crecimiento, ya que la superficie de la placa fue cubierta con microcolonias de T. funiculosus originadas por una rápida esporulación. Este evento, influyó negativamente (P < 0,05) en el desarrollo de A. flavus, respecto de los mismos aislamientos creciendo en cultivo puro (Tabla 3).

Los resultados indican que A. flavus y F. verticillioides presentaron un comportamiento de crecimiento similar, caracterizado por la extensión de sus hifas y escasa esporulación. Una situación diferente fue observada para T. funiculosus, que inhibió el crecimiento de ambas especies micotoxigénicas, utilizando la estrategia de rápida esporulación de la superficie. La

Tabla 2 Inhibición del crecimiento de F. verticillioides y T. funiculosus creciendo en confrontación en ambiente sin restricción de O_2. Table 2. Growth inhibition of F. verticillioides and T. funiculosus in confrontation, in an environment without O₂ restriction.  

Tabla 3 Inhibición del crecimiento de las especies A. flavus y T. funiculosus creciendo en confrontación, en ambiente sin restricción de O_2. Table 3. Inhibition growth of A. flavus and T. funiculosus in confrontation, in an environment without O₂ restriction. 

dispersión exagerada de las esporas en tiempo y espacio puede estar relacionada con una estrategia de competencia, de acuerdo con ^{Wyatt et al. (2013}).

La interacción de las hifas de cada una de las especies micotoxigénicas (A. flavus y F. verticillioides) creciendo en confrontación con T. funiculosus fue descripta como una inhibición por contacto tipo B, de acuerdo con la escala de ^{Magan y Lacey (1984}). Además, en la zona de contacto entre las hifas se observó una coloración roja intensa ocasionada posiblemente por la síntesis de un extrolito de T. funiculosus del cual no se tiene información detallada de su estructura química ni tampoco de su función (^{Yilmaz et al., 2014}).

Características microscópicas de la interacción entre A. flavus, F. verticillioides y T. funiculosus en ambiente hermético

Cuando las cepas de A. flavus y F. verticillioides crecieron confrontadas con T. funiculosus en el ambiente T1 y sus hifas tomaron contacto, se observaron dos eventos relevantes. El primero fue la presencia de hifas y conidios teñidos de color rojo por T. funiculosus y su posterior lisis; el segundo fue la formación de apresorios por un aislamiento de T. funiculosus en las hifas de ambas especies micotoxigénicas, evidenciando una estrategia de parasitismo.

Cuando el contenido de O₂ en el ambiente T2 se redujo a 5% y se incrementó la concentración de CO₂, ambas especies micotoxigénicas mostraron sus hifas con engrosamiento, vacuolización, estructuras globosas y una mayor ramificación en la zona de contacto con T. funiculosus. En coincidencia con la rápida reducción del O₂ del ambiente T2, todos los aislamientos de T. funiculosus produjeron apresorios en las hifas de A. flavus.

Cuando se estudió microscópicamente la interacción entre las hifas, el hallazgo de alteraciones morfológicas en Aspergillus coincidieron con otras descripciones (^{Quiroz-Sarmiento et al., 2008}). Las hifas de F. verticillioides y A. flavus presentaron una ramificación exagerada pudiendo constituir una estrategia para colonizar rápidamente el espacio. En cambio, T. funiculosus produjo apresorios y lisis celular en A. flavus y F. verticillioides, lo que también podría ser considerado como estrategia de adaptación y supervivencia de esta especie.

Composición de O₂ y CO₂ en ambientes herméticos durante el crecimiento confrontado

En el ambiente T1, a los siete días de incubación de las cepas de F. verticillioides y A. flavus creciendo confrontadas, no se registró O₂ y la concentración de CO₂ fue de 16,95%. En el ambiente T2, el O₂ se consumió completamente en cinco días, mientras que el CO₂ se incrementó a valores del 18% (Fig. 1).

La Fig. 2 muestra la evolución de los niveles de gases cuando F. verticillioides y T. funiculosus crecieron en confrontación. En el ambiente T1 no se detectó O₂ a los seis días de incubación y el CO₂ se incrementó a valores de 17,50%, en ese tiempo. En el ambiente T2 el O₂ se redujo a valores inferiores a 1% luego de 23 días de incubación, tiempo en el que el CO₂ se incrementó a niveles que superaron el 18%.

Fig. 1 Evolución de las concentraciones (%) de O₂ y CO₂ en los ambientes T1 (izquierda) y T2 (derecha), donde crecieron F. verticillioides y A. flavus en confrontación. Fig. 1. Evolution of O₂ and CO₂ concentrations (%) in environments T1 (left) and T2 (right), F. verticillioides and A. flavus in confrontation. 

Cuando A. flavus y T. funiculosus crecieron en confrontación en el ambiente T1, se detectó O₂ hasta el día 24 de incubación, mientras que en el ambiente T2 no se detectó O₂ en el sistema a los seis días de iniciado el ensayo (Fig. 3).

El estudio de la evolución de las concentraciones de O₂ y CO₂ de los ambientes herméticos donde crecieron confrontadas y de a pares las tres especies, mostró que el nivel de CO₂ inicial en el ambiente hermético influyó en el consumo de O₂ de A. flavus y F. verticillioides y como consecuencia, en su tasa de crecimiento.

^{Castellari et al. (2014}) determinaron que la tasa de crecimiento de F. verticillioides en el ambiente T1 fue de 1,59 mm d^-1, un 30% inferior a la registrada en condiciones sin restricción de O₂, y la tasa de crecimiento de A. flavus en el mismo ambiente fue de 2,11 mm d^-1, un 52% menor a la registrada en condiciones de cultivo con intercambio de O₂.

F. verticillioides fue la especie que consumió en menor tiempo el O₂ disponible en el ambiente hermético T1, cuando creció con A. flavus y T. funiculosus, influenciado posiblemente por la ausencia de CO₂. Por otro lado, de las Figs. 1, 2 y 3 se deduce que A. flavus fue responsable de la

Fig. 2 Evolución de las concentraciones (%) de 0₂ y C0₂ en los ambientes TI (izquierda) y T2 (derecha), donde crecieron F. verticillioides y T. funiculosus en confrontación. Fig. 2. Evolution of0₂ and C0₂ concentrations (%) in environmentsTl(left) and T2(right), in F. verticillioides and T. funiculosus in confrontation. 

Fig. 3 Evolución de las concentraciones (%) de O2 y CO2 en los ambientes T1 (izquierda) y T2 (derecha), donde crecieron A. flavus y T. funículosus en confrontación. Fig. 3. Evolution of O2 and CO2 concentrations (%) in environments T1 (left) and T2 (right), in A. flavus and T. funiculosus in confrontation.  

reducción del O₂, en el ambiente con un nivel inicial de 5% (T2), cuando creció con F. verticillioides y T. funiculosus, infiriendo que el nivel de CO₂ superior a 15% afectaría negativamente la tasa de crecimiento de estas especies. Las tres especies modificaron en forma diferente los niveles de O₂ y CO₂ de cada uno de los ambientes herméticos durante su crecimiento, evidenciado por un consumo distinto de O₂ en función del tiempo.

CONCLUSIONES

El crecimiento de las especies micotoxigénicas F. verticillioides y A. flavus y de T. funiculosus (no micotoxigénica) fue afectado por el ambiente hermético y por la presencia de otras especies. El ambiente hermético alteró la morfología de estructuras somáticas y reproductivas asexuales de las especies micotoxigénicas. T. funiculosus inhibió el crecimiento de ambas especies micotoxigénicas a través de una esporulación rápida de sus colonias. Asimismo, el número de aislamientos de esta especie con actividad parasítica se incrementó cuando la concentración inicial de O₂ en el ambiente hermético fue menor a 5%. La evolución de las concentraciones de O₂ y CO₂ en ambientes de crecimiento hermético varió según las especies fúngicas presentes.

Este trabajo proporcionó evidencia que indica que evaluar la composición fúngica micotoxigénica y no micotoxigénica asociada a granos almacenados en ambientes herméticos, constituye un factor implícito de relevancia a considerar cuando se pretenden planificar estrategias para evitar el deterioro de los granos y la producción de micotoxinas durante el tiempo en que éstos están acopiados.