Introducción:

Las células musculares cardiacas o cardiomiocitos llevan a cabo la función de contracción del corazón. En cada latido, el corazón se encuentra sometido a un proceso de estiramiento mecánico, donde las fuerzas internas de contracción y relajación, o la deformación de la membrana celular, son sensadas a través de receptores llamados mecanosensores, los que transforman la señal mecánica en química, permitiendo su integración río abajo para regular varios procesos celulares, entre ellos la sobrevida celular^1-4.

Un estiramiento sostenido o mayor al fisiológico se define como estrés mecánico (EM). El EM es capaz de modular, a su vez, el crecimiento, remodelamiento y cambios en la expresión génica que derivan en variaciones en el metabolismo y la sobrevida o la muerte de los cardiomiocitos^1,3,5. De hecho, el EM ha sido señalado como una de las primeras causas del daño y desarrollo de la hipertrofia cardiaca⁶ y del aumento de la muerte de los cardiomiocitos durante el infarto agudo de miocardio (IAM)⁷, en el cual el EM es producido por el aumento del volumen celular durante la reperfusión⁸. Controversialmente, algunos estudios sugieren que, si el EM es desarrollado previo al IAM, este confiere protección al tejido cardiaco⁹. Diferentes estudios han propuesto a las integrinas, las cadherinas, los canales activados por estiramiento, la Policistina-1 y algunas proteínas G como mecanosensores en el tejido cardiaco^1,5-6. Pese a la importancia que parecería tener el EM en el corazón, se desconoce a cabalidad la identidad de los mecanosensores expresados en los cardiomiocitos, al igual que las vías de señalización que éstos regulan.

Las policistinas son una familia de proteínas transmembrana cuyos principales representantes son la Policistina-1 (PC1) y la Policistina-2 (PC2). Mientras que PC2 es un canal de Ca2+ no específico, PC1 es un mecanosensor capaz de regular la función de la PC2 o de ejercer su función en forma independiente^2,10. Se expresan en diferentes tejidos, entre ellos el cardiaco; sin embargo, su función ha sido caracterizada, principalmente, en los cilios primarios de las células renales^10-11, donde la PC1 sensa el flujo de orina activando canales de Ca2+ 2,10. Se ha reportado, además, que estaría implicada en la proliferación, adhesión y diferenciación celular, pero las vías de señalización son poco claras¹². A nivel cardiaco, nuestro laboratorio ha reportado que la PC1 es un mecanosensor presente en los cardiomiocitos, vital para la función contráctil del corazón y que se encuentra involucrada en el desarrollo de la hipertrofia cardiaca inducida por EM in vitro (estrés hiposmótico) e in vivo (constricción aórtica transversa)¹¹. A pesar de que la PC1 tiene una función vital en la función cardiaca, se desconoce hasta el momento los mecanismos asociados a dicha regulación.

La muerte y pérdida de los cardiomiocitos por necrosis o apoptosis, lleva a la disminución de la función cardiaca y al remodelamiento¹³, siendo este un punto clave en el desarrollo de diferentes patologías post IAM, como la insuficiencia cardiaca¹³. En células renales, se encuentra descrito que la PC1 es clave para evitar el aumento de la muerte celular por apoptosis a través de la estabilización de los niveles proteicos de BCL-2¹⁴; sin embargo, se desconoce el papel de la PC1 en la muerte de los cardiomiocitos.

BCL-2 es una familia de proteínas caracterizadas por presentar dominios de homología llamadas BCL-2. Estas proteínas tienen una función principal en la regulación de la apoptosis, ya sea a través de su promoción, por aumento de la expresión de algunos de sus miembros como BCL-2 o BCL-XL, o a través de su inhibición, por la inducción de la expresión de BAX, BAK o BCL-Xs, entre otros¹⁵. Además de lo anterior, está demostrado que un subgrupo de la familia de proteínas BCL-2, llamado “BNIP” (BNIP1, BNIP2, BNIP3, y BNIP 3L o NIX), son capaces de inducir la muerte celular, ya sea por apoptosis o necrosis^16-17. Mientras BNIP3 es inducido por hipoxia y participa en la muerte celular ante isquemia cardiaca^18-19, la proteína NIX parece estar más asociada con señales de hipertrofia patológica, como la inducida por sobrecarga de presión o estrés mecánico^19-20.

Así, la muerte celular, la fibrosis y el remodelamiento y la falla cardíaca, se encuentran relacionados tanto a una disminución de la expresión de NIX20, como a la disminución de la expresión de BCL-2 y BCL-XL¹⁹. De acuerdo con lo anterior, el objetivo de este trabajo fue estudiar la relación entre la presencia de la PC1 y la muerte de los cardiomiocitos durante el EM y su asociación con la expresión de BCL-2 y NIX.

Materiales y Métodos

Cultivo de miocitos ventriculares de ratas neonatas (NRVM) y transfecciones La mantención y manipulación de los animales se realizó de acuerdo con las normas éticas establecidas para animales de experimentación “Guide for the care and use of laboratory animals” (National Institutes of Health, EEUU, 2011).

Para la obtención de los NRVM se utilizaron ratas neonatas Sprague-Dawley (1 a 3 días de edad), de ambos sexos, según lo descrito previamente¹¹.

Para disminuir la expresión de PC1 en los NRVM, los mismos fueron transfectados durante toda la noche con un siRNA de secuencia específica (siPC1, Sigma- Aldrich, 120 nM), de acuerdo con lo descrito previamente¹¹.

Análisis estadístico

Los resultados se muestran como el promedio ± S.E.M. de los experimentos independientes realizados (n) y se analizaron utilizando t-test o ANOVA de una vía seguido de un pos-test de Dunnet. Las diferencias se consideraron significativas con p<0,05. Resultados La expresión deficiente de PC1 aumenta la necrosis de los NRVM durante el estrés mecánico, sin cambios en la muerte por apoptosis. Los NRVM controles y deficientes para la expresión de PC1 (siPC1), se expusieron por 48 horas a una solución hiposmótica (HS), utilizada como modelo de estrés mecánico y, posteriormente, se midieron los niveles de necrosis y apoptosis de las muestras. El estímulo de HS solo induce un aumento de la muerte por necrosis en los NRVM siPC1 (Figura 1A).

Figura 1A 

Por otra parte, el estímulo con HS induce un aumento de la apoptosis celular basal, independiente de la presencia de la PC1 (Figura 1B). El conjunto de nuestros datos sugiere que la PC1 actuaría evitando el aumento de la necrosis de los NRVM someti dos a estrés mecánico por HS.

Figura 1B Efecto de la deficiencia de la Policistina-1 en la muerte de los cardiomiocitos durante estrés mecánico. Cardiomiocitos controles y deficientes para la expresión de la PC1 (siPC1), se expusieron a solución hiposmótica (HS) como modelo de estrés mecánico y se midió: A) Liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) al medio de cultivo como índice de necrosis, expresado como el porcentaje de la actividad total (n= 7-9) y B) Índice de células apoptóticas expresado como porcentaje (n= 3 en duplicado). Los valores se muestran como promedios ±SEM y fueron analizados mediante ANOVA de una vía seguido por un post-test de Dunnet. *P<0,05 vs. control. 

El estrés mecánico induce el aumento proteico de NIX en NRVM deficientes para la expresión de PC1. Se midieron los niveles proteicos de NIX y BLC-2 en NRVM controles y siPC1 expuestos a HS. Mientras el HS o la deficiencia de la PC1 no induce cambios en el contenido de NIX, las células siPC1 estimuladas con HS presentan un aumento de sus niveles proteicos (Figura 2A). Por otra parte, el estímulo con HS induce una disminución del contenido proteico de BCL-2, el cual es independiente de la presencia de la PC1 (Figura 2B). Además, la relación BCL-2/NIX disminuye en los NRVM estimulados con HS, independiente de la presencia de la PC1 (Figura 2C).

Figura 2A 

Figura 2C Cambios en los niveles proteicos de NIX y BCL-2 en cardiomiocitos deficientes para la expresión de la Policistina-1 (siPC1) expuestos a solución hiposmótica (HS). En la parte superior se observan western blots representativos para NIX (A) y BCL-2 (B). GAPDH se utilizó como control de carga. En la parte inferior se muestran los gráficos de barras correspondientes, expresando la relación NIX/GAPDH para cada situación (n= 5-6). En C) se muestra la relación BCL-2/NIX. Los valores se muestran como promedio ±SEM, analizados mediante ANOVA de una vía seguido por un post-test de Dunnet. *P<0,05 vs. control. 

Estos datos en su conjunto sugieren que la presencia de la PC1 en los cardiomiocitos evita el aumento del contenido proteico de NIX durante el estrés mecánico, sin relevancia en las variaciones de la proteína anti-apoptótica BCL-2.

Discusión

El presente trabajo investigó el papel de la Policistina-1 (PC1) de los cardiomiocitos como regulador de la sobrevida celular durante el estrés mecánico. En cada diástole, las células cardiacas sufren un estiramiento mecánico dentro de límites fisiológicos, lo que activa diferentes vías de señalización relacionadas con procesos celulares, como la diferenciación y la sobrevida celular²². Sin embargo, cuando el estiramiento supera los límites fisiológicos se produce un estrés mecánico que activa vías de señalización diferentes a las anteriores, que puede llevar a cambios en el metabolismo o la expresión de genes y conducir a la muerte celular por necrosis o apoptosis^22-23. Reportes previos de nuestro laboratorio indican que la PC1 es un mecanosensor presente en el cardiomiocito, vital para el funcionamiento contráctil del miocardio¹¹; sin embargo, se desconocen los mecanismos involucrados en dicha función o el papel que dicho mecanosensor podría tener durante el estrés mecánico de los cardiomiocitos. Nuestros resultados muestran que la presencia de la PC1 en el cardiomiocito, estimulado con solución hiposmótica (HS) como modelo de estrés mecánico, evita la muerte por necrosis, sin que su expresión deficiente altere los niveles basales de muerte celular. Por otro lado, los datos sugieren que la PC1 no tiene un papel protector en la muerte por apoptosis inducida por la HS. Estos resultados están en concordancia con estudios realizados en células renales, donde la PC1 actúa como un protector de la muerte por necrosis inducida durante estímulos de isquemia/reperfusión²⁴. Sin embargo, mientras que en dichos estudios la deficiencia de PC1 también se encuentra relacionada a un aumento de la apoptosis, al igual que en otros reportes, en nuestro modelo la apoptosis es independiente de la PC1^24-25. Estos resultados discordantes podrían deberse a la diferencia del tipo celular o al estímulo utilizado en los estudios, así como a limitaciones técnicas para la medición de apoptosis Si bien realizamos una co-tinción para diferenciar células apoptóticas de necróticas, otras técnicas deberían utilizarse para validar los resultados encontrados.

Debido a que los cardiomiocitos son células terminalmente diferenciadas, con poca o nula capacidad proliferativa, la muerte de estos redunda en el desarrollo de diferentes patologías cardiacas⁴. Nuestros resultados sugieren entonces a la PC1 como una proteína importante para prevenir el aumento del daño del tejido cardiaco, debido a la muerte de los cardiomiocitos.

Además de la clasificación clásica de muerte celular en apoptosis, autofagia y necrosis, actualmente se reconocen otros tipos de muerte centradas en los aspectos moleculares del proceso, como por ejemplo, la necrosis regulada o programada, la cual es iniciada por alteraciones específicas del microambiente intracelular, como el estrés oxidativo y la sobrecarga citosólica de Ca2+ ²⁶. En este tipo de muerte, la activación de una o más vías de señalización conducen frecuentemente a la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (MPTP), que interrumpe la función respiratoria mitocondrial y desencadena finalmente la necrosis²⁶.

En cuanto al mecanismo que subyace a la muerte evidenciada, el estrés mecánico induce el aumento proteico de NIX cuando los cardiomiocitos son deficientes en la expresión de PC1. Debido a que NIX es una proteína involucrada, tanto en el aumento de la muerte por necrosis programada, como por apoptosis^17,27, nuestros datos sugieren que NIX podría ser parte de la vía responsable de activar la necrosis de los cardiomiocitos bajo estas condiciones. Así, en condiciones de estrés mecánico, la PC1 estaría inhibiendo el aumento de NIX y evitando el aumento de la muerte inducida por el estrés mecánico. Futuros estudios son necesarios para corroborar el tipo de necrosis (programada o no programada) en el cual está implicado el rol protector de la PC1 y la importancia de la vía que involucra a Nix en este proceso.

Si bien BCL-2 ha sido descrita, principalmente, como anti-apoptótica, en los últimos tiempos se la ha descrito como vía común para la inhibición de diferentes tipos de muerte, como el de la autofagia y el de la necrosis programada²⁸. Aun cuando en trabajos previos realizados en células renales se muestra que la ausencia de la PC1 induce la degradación de BCL-2, originando la apoptosis²⁵, en nuestro modelo el estrés mecánico reduce el contenido proteico de BCL-2 en los cardiomiocitos de manera independiente a la expresión de la PC1. Así, es posible que el estrés mecánico induzca más de un tipo de muerte en los cardiomiocitos y que la PC1 esté implicada en la protección de sólo algunos de ellos, pero no de todos, como el de la apoptosis y que la disminución de BCL-2 esté más bien ligada a este tipo de muerte celular. Se requieren experimentos complementarios para definir el papel de la PC1 en la muerte por necrosis programada y la implicancia de BCL-2 en la misma en nuestro modelo.

El conjunto de nuestros hallazgos indica, por primera vez, que la PC1 es una proteína protectora ante la necrosis de los cardiomiocitos inducida por el estrés mecánico. El mecanismo implicaría, aunque sea en parte, la inhibición del aumento del contenido proteico de la proteína NIX. Futuros experimentos son necesarios para confirmar el mecanismo a través del cual la PC1 es capaz de regular la expresión de esta proteína