Rev. Otorrinolaringol. Cir. Cabeza Cuello 2010; 70:195-204

ARTICULO DE INVESTIGACIÓN

Perfil de producción de citoquinas en linfocitos T de sangre periférica de pacientes con poliposis nasal y asma bronquial en respuesta a la estimulación con enterotoxina estafilocócica B

Cytokine production profile in peripheral blood T lymphocytes from patients with nasal poliposis and bronchial asthma in response to staphylococcal enterotoxin B

 

Juan Pablo Gormaz B¹², Pilar Gajardo 0², Alejandro Escobar A², Christian Olavarría L¹, Patricia Schönffeldt G³, Homero Sariego R⁴, Diego Catalán M²⁵, Juan Carlos Aguillón G²⁵.

1 Servicio de Otorrinolaringología, Hospital Clínico de la Universidad de Chile.

2 Laboratorio de Enfermedades Autoinmunes e Inflamatorias, Programa Disciplinario de Inmunología, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.

3 Laboratorio de Fisiopatología, Instituto Nacional del Tórax.

4 Unidad de Otoneurología, Instituto de Neurocirugía Dr. A. Asenjo.

5 Núcleo Milenio en Inmunología e Inmunoterapia, P07/088-F.

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RESUMEN

Introducción: La poliposis nasal (PN) se presenta frecuentemente asociada a asma bronquial (AB). La enterotoxina estafilocócica B (SEB) jugaría un papel en su patogenia. No se ha estudiado si el perfil de citoquinas inducido por SEB en linfocitos T (LT) de pacientes con PNyAB difiere del de controles sanos.

Objetivo: Comparar el perfil de citoquinas de LT de sangre periférica de pacientes con PN-AByde controles, estimulados con SEB o concanavalina A (ConA).

Material y método: Células mononucleares de sangre periférica de 9 pacientes con PN-AB y de 6 controles se estimularon con SEB o ConA. El porcentaje LT CD4+ productores de interferón (IFN)-y, interleuquina (IL) IL-4, IL-5, IL-17 e IL-21 se determinó mediante citometrfa de flujo.

Resultados: El grupo PN-AB presentó un menor porcentaje de LT productores de IL-5 que los controles al estimularse con SEB y con ConA. No hubo diferencia en las otras citoquinas estudiadas.

Discusión: Nuestros resultados en sangre periférica difieren de lo descrito en tejido de pólipos nasales.

Conclusión: Se sugiere que la respuesta inflamatoria de la PN se originaría /ocalmente ya que los LT de sangre de pacientes con PN-AB no muestran una polarización hacia perfiles proinflamatorios con los estímulos utilizados.

Palabras clave: Poliposis nasal, asma bronquial, linfocitos, citoquinas, enterotoxina estafilocócica B.

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ABSTRACT

Introduction: Nasal poliposis (NP) is frequently associated with bronchial asthma (BA) and its pathogenesis is still unknown. Staphylococcal enterotoxin B (SEB) has been implicated in the development of NP, however if the SEB-induced cytoklne profile of peripheral blood T lymphocytes (TL) of PN-BA patients differs from that of normal controls has not been studied.

Aim: To compare the cytoklne profile of CD4+ TL from NP-BA and controls stimulated with SEB or concanavalin A (ConA).

Material and method: Peripheral blood mononuclear cells from 9 NP-BA patients and from 6 controls were stimulated with SEB or ConA. The percentage of interferon (IFN)-y, interleukin {II) 11-4,11-5,11-17, and 11-21 producing TL was analyzed by flow cytometry

Results: The percentage of SEB and ConA stimulated CD4+ IL-5-producing TLs was lower in the NP-BA group compared to the control group. There were no differences in the other cytokine-producing populations.

Discussion: Unlike what is described in nasal polyp tissue, our findings show a diminished production of IL-5 by peripheral TL from the NP-AB group.

Conclusion: A local sinonasal origin of the chronic inflammation is suggested since peripheral blood TL of NP-BA patients do not show a pro-inflammatory polarization with the tested stimuli.

Key words: Nasal polyposls, bronchial asthma, lymphocytes, cytokines, staphylococcal enterotoxin B.

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INTRODUCCIÓN

La fisiopatología de la Inflamación crónica de la mucosa de la cavidad nasal y de las cavidades perinasales presente en la poliposis nasal (PN) es aún controvertida, con múltiples tipos celulares y mediadores inflamatorios involucrados.

Los pólipos nasales (pn) son estructuras pedlculadas que histológicamente están compuestos por tejido conectivo laxo, edema, glándulas, capilares y células inflamatorias, entre las cuales los linfocltos son unos de los tipos celulares predominantes¹². Se postula que los linfocitos T (LT), al ser orquestadores de la respuesta Inflamatoria y formar parte Importante del Infiltrado celular de los pn, jugarían un papel protagónlco en el desarrollo de la Inflamación crónica que caracteriza a esta enfermedad.

Los LT ayudadores CD4+ son fundamentales en la Iniciación de la respuesta Inmune, Interviniendo sobre otras células. Los LT ayudadores CD4+ clásicamente han sido subdlvldldos en 2 subgrupos, los Th1 y los Th2, caracterizados por un perfil de cltoqulnas y funciones efectoras distintas³. Los LT Th1 producen ¡nterferón (IFN)-y y activan una respuesta Inmune adaptatlva celular, mientras los LT Th2 sintetizan principalmente ¡nterleuqulna (IL) IL-4, IL-5 e IL-13, las que son esenciales para la generación de anticuerpos y de una respuesta Inmune humoral. Recientemente se ha descrito un tercer subgrupo de LT ayudadores, los Th17, productores de IL-17 e IL-21 y cuyo un rol fisiológico es aún poco claro⁴.

El perfil de producción de cltoqulnas de los llnfocltos de pn ha sido descrito por varios autores, tanto en la era pre como posTh17, con resultados discordantes. Se ha descrito un predominio del perfil Th1 como también un perfil Inflamatorio de tipo mixtoTh1 y Th2⁵⁶. Reportes recientes que han Investigado la respuesta Th17 en PN también muestran resultados disímiles⁷-¹¹.

La enterotoxlna estafllocóclca B (SEB), producida por la bacteria Staphylococcus aureus (S. aureus), se ha postulado como un probable agente causante y/o perpetuador de la PN basado en las siguientes observaciones: 1) Alta tasa de portación de S. aureus en la cavidad nasal de pacientes portadores de PN¹², con un alto porcentaje de cepas productoras de SEB¹³; 2) Presencia de SEB en mucus y tejido de pn¹⁴; 3) Alta prevalence de IgE específica contra SEB en tejido de pn¹²; 4) Selección de dominios variables 13 (VI3) del receptor antlgénlco de LT (TCR) que ligan SEB en pn¹³¹⁵; 5) Correlación entre la expansión de LT con TCRs con dominios VI3 específicos en tejido de pn e IgE anti SEB sérica en los mismos pacientes⁶¹⁶. El tejido de pn produce cltoqulnas Th1, Th2 y Th17 al estimularse con SEB¹⁷.

Existe evidencia que el SEB podría estar Involucrado en la flslopatología del asma bronquial (AB) asociada a rlnoslnusltls crónica (RSC). Es así como Llu et al. describen una mayor producción de IL-4 por células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con RSC y AB al ser estimulados con un antígeno al cual se encontraban previamente sensibilizados y SEB simultáneamente, siendo mayor que en pacientes con AB sin RSC y controles sanos, lo que no se observó con IFN-y¹⁸.

El objetivo del presente estudio es comparar el perfil de producción de cltoqulnas Th1, Th2 y Th17 de LT CD4+ de sangre periférica de pacientes con PN-AB y de controles sanos en respuesta a la estimulación con SEB.

MATERIAL Y MÉTODO

Pacientes y controles

Se reclutaron 9 pacientes chilenos (90% hombres, edad promedio 53 años, rango de 24 a 73 años; Tabla 1) con el diagnóstico PN y AB de quienes se obtuvo una muestra de 50 mL de sangre venosa periférica previo consentimiento Informado aprobado por los Comités de Ética Científica del Hospital Clínico de la Universidad de Chile y del Servicio de Salud Metropolitano Oriente.

El diagnóstico de PN y AB se realizó siguiendo las guías EPOS 2007¹⁹ y la guía clínica para asma bronquial en adultos del Ministerio de Salud de Chile 2008²⁰, respectivamente. La confirmación del diagnóstico de AB se efectuó mediante una espirometría pre y posbroncodllatador y una prueba de provocación bronquial con metacollna siguiendo las recomendaciones del manual de espirometría de la Sociedad Chilena de Enfermedades Respiratorias 2006²¹ y de la American Thoracic Society²². Para ambas pruebas se utilizó un espirómetro Medgraphics con el programa Breezze 6.1 A {Medical Graphics Corporation, St. Paul, MN, USA). Se evaluó la sensibilización a alérgenos Inhalantes de los pacientes con PN y AB mediante prick test. Esta prueba se llevó a cabo por una enfermera entrenada, siguiendo la técnica descrita por Pepys²³. Se utilizó como control negativo una solución gllcerosallna fenolada al 50% y como control positivo una solución de fosfato de hlstamlna 10 mg/mL en base a gllcerosallna al 50% {GreerLaboratories Inc., Lenoir, NC, USA). Se utilizaron un total de 26 extractos alergénlcos estandarizados: 6 pastos, 5 malezas, 11 árboles, 3 hongos y 5 Inhalantes ¡ntradomlclllarlos (todos de Greer Laboratories Inc., Lenoir, NC, USA). Se midió la reacción a los 15 minutos y se consideraron como reacciones positivas aquellas con una pápula de un diámetro mayor o Igual a 3 mm sobre el control negativo.

Además, a cada paciente se le aplicó la encuesta SNOT-20²⁴ para determinar la severidad de sus síntomas rlnoslnusales, se le realizó una evaluación endoscóplca rlnoslnusal etaplflcándola según el score de Lund-Mckay²⁵ para determinar la extensión de su PN y se registró el antecedente de tabaquismo, considerándose como positivo el consumo de al menos 1 paquete año.

Como controles se reclutaron 6 pacientes chilenos (50% hombres, edad promedio 42 años, rango de 26 a 68 años), sin historia de alergia respiratoria ni cutánea y sin antecedentes de enfermedades rlnoslnusales ni bronquiales, confirmado mediante una encuesta de síntomas nasales²⁶ y otra de síntomas de AB²⁷. Todos ellos tenían un examen otorrlnolarlngológlco, Incluyendo endoscopía nasal, y broncopulmonar normal. De ellos se obtuvo una muestra de sangre venosa periférica de 50 mL.

Obtención y cultivo úe células mononucleares úe sangre periférica (CMSP)

La sangre venosa periférica obtenida de los pacientes con PN y AB y de los controles sanos se recolectó en tubos heparlnlzados y las CMSP se obtuvieron mediante separación en una gradiente de Ficoll-Hypaque {Axis-Shield, Noruega), siendo congeladas y almacenadas en nitrógeno líquido hasta su utilización. Para su procesamiento, las células obtenidas se descongelaron y distribuyeron en tres partes ¡guales, Incubando cada alícuota a una concentración de 2 x 10⁶ células/mL en medio RPMI/ suero fetal bovino (SFB) al 5% a 37°C, 5% de C0₂ en placas de 96 pocilios (BD Biosciences, San José, CA, USA), ya sea en presencia de 100 ng/mL de SEB {Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), 5 Lig/mL del mltógeno concanavalma A (ConA, Sigma-Aldrich Co.) o RPMI/SFB5% (control negativo sin estímulo) por 48 horas con el fin de estudiar si el SEB era capaz de producir una polarización en la producción de cltoqulnas característica. Se agregó brefeldlna A 10 Lig/mL (BFA; eBioscience Inc., San Diego, CA, USA) a cada pocilio 4 horas antes de la tinción para cltometría de flujo.

Tinción de superficie e intracelular

Las CMSP tratadas fueron transferidas a una placa de 96 pocilios con fondo en V y se Incubaron con el anticuerpo monoclonal anti CD4 {mouse anti-human, clon RPA-T4, eBioscience Inc.), conjugado con ¡sotloclanato de fluoresceína (FITC) por 30 minutos a 4°C y en oscuridad. A continuación, las PBMCs fueron lavadas con PBS-SFB1% 2 veces, fijadas y permeablllzadas con la solución Fixation/ Permeabilization {eBioscience Inc.) por 60 minutos a 4°C en oscuridad. Posteriormente, las CMSP se lavaron 2 veces con tampón permeabilization {eBioscience Inc.) e Incubadas con un anticuerpo anti IFN^y {mouse anti-human, clon 4S.B3), anti IL-4 {rat anti-human, clon MP4-25D2), anti IL-5 {rat anti-human, clon TRFK5), anti IL-17 {mouse anti-human, clon eBio64DEC17) o anti IL-21 {mouse anti-human, clon eBlo3A3-N2; todos de eBioscience Inc.), conjugados con ficoerltrina (PE), en 20 l»L de tampón permeabilization por 30 minutos a 4°C y en oscuridad. Por último, las CMSP se lavaron 2 veces con tampón de permeablllzación y resuspendldas en PBS/ SFB 1%. Las células marcadas se almacenaron a 4°C en oscuridad hasta su análisis por citometría de flujo.

Citometría úe flujo

Las muestras fueron analizadas mediante citometría de flujo utilizando un cltómetro FACSCanto {BD Biosciences, USA). Se analizaron entre 10.000 y 30.000 células con ventana en la población correspondiente a llnfocitos, según tamaño y granularidad. El análisis de datos se realizó utilizando el programa FCS Express V3 {de Novo Software, Los Angeles, CA, USA).

Análisis estadístico

Se compararon las células positivas a la marcación con los anticuerpos antes descritos entre el grupo control y el grupo con PN utilizando la prueba de Wilcoxon para muestras independientes. Se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson para correlacionar los puntajes de la encuesta SNOT-20, del score endoscópico de Lund-Mckay y el porcentaje de células positivas a la marcación en el grupo con PN. Se consideró un p <0,05 como significativo. Para estos procedimientos estadísticos se utilizó el software Prism 5 para Windows {GraphPad Software Inc, La Mía, CA, USA).

RESULTADOS

Demografía, reactividad a alérgenos a través de prick test y hábito de tabaco de pacientes con PN

Siete (77,8%) de los pacientes con PN tuvieron un prick test positivo a aeroalergenos y dos pacientes (22,2%) no se encontraban sensibilizados a los alérgenos examinados. De aquellos pacientes con un prick test positivo, tres (42,9%) presentaron sensibilización a cinco o menos alérgenos, tres (42,9%) a entre seis y diez alérgenos y un paciente (28,6%) presentó sensibilización a más de diez alérgenos (Tabla 1). Los grupos de alérgenos a los cuales los pacientes presentaron una reacción positiva con mayor frecuencia fueron las malezas y pastos (77,8%), seguido por los árboles e Inhalantes ¡ntradomiclllarios (55,6%). Ningún paciente tuvo reacción a los hongos probados (datos no mostrados). Cuatro (44,4%) de los pacientes estudiados tenían antecedente de tabaquismo (Tabla 1).

Evaluación del perfil de citoquinas intracitoplasmáticas en linfocitos T CD4+ de pacientes con PN y controles sanos frente al estímulo con SEB o concanavalma A

Nuestros resultados Indicaron que la proporción de células CD4+ IL-5+ fue significativamente menor en el grupo de PN respecto a los controles sanos, tanto con la estimulación con ConA (p =0,0466) como con SEB (p =0,0088;) (Figuras 1E y 1F). El porcentaje de células CD4+ productoras de las cltoquinas efectoras IFN-y (Figuras 1Ay 1B), IL-4 (Figuras 1Cy 1D), IL-17 (Figuras 1G y 1H) e IL-21 (Figuras 1l y 1J) no presentó diferencias entre el grupo PN y los controles sanos, respondiendo de manera similar a la estimulación con ConA y con SEB.

Finalmente, la asociación entre el número de alérgenos positivos al prick test, puntaje de la encuesta SNOT-20, puntaje de evaluación endoscópica y el porcentaje de células CD4+ productoras de cltoquinas no mostraron una asociación estadísticamente significativa (datos no mostrados).

DISCUSIÓN

La evaluación de los ejes de LT CD4+ efectores Th1 (IFN-y), Th2 (IL-4 e IL-5) y Th17 (IL-17 e IL-21) permite definir la participación de cada uno de éstos en la patogénesis de la PN.

En este estudio se muestra por primera vez en la literatura el porcentaje de LT CD4+ obtenido de sangre periférica de pacientes con PN y AB, productores de citoquinas Th1, Th2 y Th17, en respuesta a la estimulación con SEB o ConA, comparándolos con llnfocitos de sangre periférica de controles sanos. Las células T CD4+ de pacientes con PN productoras de la cltoquina Th2 IL-5 fueron significativamente menos que las de los controles sanos, sin que hubiera diferencias al analizar otra citoqulna del mismo eje como IL-4, ni tampoco para el eje Th1 (IFN-y) ni Th17 (IL-17 e IL-21). En la literatura se han estudiado los niveles de producción de citoquinas de tipo Th1 y Th2 en pacientes con AB, sin PN, con resultados discordantes. Es así como se han descrito niveles séricos elevados de IL-5 en pacientes con AB, tanto atópica como no atópica²⁸ y un porcentaje aumentado de LT CD4+ productores de IL-5 estimulados con los mltógenos miristato de forbol (PMA) y ¡onomiclna de pacientes con AB atópica, medido mediante citometría de flujo²⁹. Asimismo, se ha pesquisado una elevada producción de IL-4 en sangre total estimulada con llpopollsacárido (LPS), en AB atópica y no atópica, y producción elevada de IFN-y en sangre total estimulada con el mltógeno fitohemoglutlnina (PHA) en AB atópica³⁰. Por otro lado, se ha demostrado una producción deficiente de IFN-y con niveles normales de IL-4 e IL-5 en CMSP estimuladas con PHA³¹. Además, Koch y cois³² describen un aumento en la producción inducida por anti-CD3/anti-CD28 de IL-5 de llnfocitos de sangre periférica de pacientes con AB, sin que hubiera diferencia en la producción de IFN^y respecto a controles sanos, sin embargo al estimular adlcionalmente los llnfocitos con IL-4 vieron que el grupo con AB presentaba menores niveles de producción de IL-5 que los controles, lo que concuerda con nuestros hallazgos. Una posible explicación a la poca concordancia en los estudios publicados podría ser que en cada uno de ellos se utilizó un modelo experimental distinto, midiéndose niveles básales de cltoqulnas²⁸ o estimulando células en distintas condiciones (CMSPs, sangre total o llnfocltos de sangre periférica) con diferentes mltógenos (PHA, PMA/lonomlclna, LPS, ant¡CD3/ ant¡CD28 o IL-4). Nosotros estimulamos CMSPs de pacientes con PN-AB con SEB y ConA.

Por otra parte, también hay que considerar que múltiples factores podrían Influir sobre los niveles de producción de cltoqulnas a nivel de sangre periférica y que no son Investigados en los estudios focalizados en la vía aérea, Incluido el nuestro. Por ejemplo, pacientes asmáticos y con alergia alimentarla presentan niveles elevados de IL-4 e IL-5 tras el desafío con alérgeno oral³³. Lo mismo ocurre con los niveles séricos de IL-5 en pacientes con dermatitis de contacto sensibles al níquel tras el desafío oral con el mismo³⁴. De similar manera, se ha descrito que CMSP de pacientes con perlodontltls de desarrolllo precoz producen mayor cantidad de IL-4 y menor de IFN-y ante la estimulación con mltógenos³⁵. Los niveles de hormonas sexuales circulantes también Influirían en los niveles de producción de IL-4 e IFN-y de CMSP, tanto en hombres como en mujeres³⁶.

A diferencia de lo que ocurre a nivel de LT de sangre periférica, el perfil de producción de cltoqulnas de los LT de pn ha sido descrito por variados autores. En 1994, Miller y cois³⁷, estimularon clones de LT, obtenidos de pn, con los mltógenos PHA y PMA más IL-2, encontrando un perfil Inflamatorio predominantemente de tipo Th1, con alta producción de IFN-y y baja producción de IL-4, utilizando ELISA. Por otra parte, Sánchez-Segura y cois, describieron un perfil Inflamatorio de tipo mixto Th1 yTh2, con producción de IFN-y e IL-5, medido en el sobrenadante de cultivo de células mononucleares obtenidas de pn, mediante ELISA⁶. También se ha demostrado la producción de cltoqulnas, tanto de tipo Th1, IFN-y, como Th2, IL-4 e IL-5, por LT de pn estimulados con PMA, mediante cltometría de flujo⁵ y en condiciones básales³⁸.

También se ha descrito un aumento de IL-17 en tejido de pn comparado con mucosa control, tanto en pacientes con PN como en pacientes con PN-AB⁷⁸. Estudios recientes muestran resultados contrapuestos, describiéndose un predominio de las respuestas Th1 y Th2 sobre la Th17 en pacientes de origen europeo⁹, y un predominio de una respuesta Th1 yTh17 en pacientes de origen chino¹⁰. Por otra parte, un estudio también realizado en pacientes chinos demuestra un predominio de las respuestas Th1 y Th2 sin que la respuesta Th17 se encuentre exacerbada¹¹. Este hecho pone en discusión al factor racial como determinante de las características de la Inflamación presente en los pn, llamando la atención sobre otros factores que habría que tener en cuenta al momento de analizar los resultados, como por ejemplo el limitado número muestral de las publicaciones o la posibilidad de una gran variabilidad interindividual en los perfiles inflamatorios, Independiente del origen étnico de los pacientes.

La única publicación a la fecha que ha estimulado tejido disgregado de pn con SEB¹⁷ muestra, a diferencia de lo que hemos observado en sangre periférica, que hay un aumento generalizado en la producción de cltoquinas proinflamatorias como IL-113, TNF-a, IFN-y, IL-2, IL-4, IL-5 e IL-13. Cabe destacar que en esta investigación no se analizó la respuesta Th17. Diferencias en los perfiles de citoqulnas de los linfocltos tras la estimulación con SEB y otras enterotoxlnas ya habían sido descritas por Sperber y cois³⁹, mostrando distintas características según el origen de los LT estimulados (de sangre periférica, lámina propia o ¡ntraepiteliales).

Nuestro hallazgo de un menor porcentaje de LT CD4+ productores de IL-5 en CMSP del grupo PN-AB comparado con los controles podría explicarse por una migración desde la sangre periférica a la mucosa nasal y/o bronquial Inflamada de estos pacientes.

En la presente investigación quisimos estudiar el perfil de citoqulnas de sangre periférica de pacientes con PN y AB ya que ellos presentan una mayor actividad Inflamatoria slstémica que en los pacientes solo con PN, demostrada por mayores niveles de leucotrlenos urinarios⁴⁰ de manera tal de poder contrastar de manera más clara con el grupo control sano.

Por otra parte, el hecho que los perfiles en sangre periférica de las distintas cltoquinas de los pacientes con PN-AB de este estudio no se correlacionara con la severidad de la enfermedad, medida por la encuesta SNOT-20 y el score endoscóplco de Lund-Mckay, sugiere que probablemente la Inflamación local en el tejido de pn sería la predominante en el desarrollo de esta enfermedad.

Concordantemente con lo descrito en la literatura¹⁹, la condición de atopla de los pacientes del presente estudio no se correlacionó con la severidad de la enfermedad, ni con el porcentaje de LT CD4+ productores de cltoqulnas, lo que hace poco probable que la atopla, al menos a alérgenos Inhalados, juegue un rol flslopatológlco en esta enfermedad.

Nuestros hallazgos, en conjunto con lo descrito en la literatura, refuerzan la teoría de una respuesta Inflamatoria de predominio local en la PN, pudlen-do cumplir un papel en desencadenar o mantener localmente esta Inflamación el SEB. Se hace Indispensable complementar lo encontrado en LT de sangre periférica con los patrones Inflamatorios presentes en el tejido de pn de estos mismos pacientes para tener un mejor entendimiento de la flslopatología de la PN.

Fuente de financiamiento: Fondo de Investigación de la Sociedad Chilena de Otorrinolaringología, Medicina y Cirugía de Cabeza y Cuello 2005 y Núcleo Milenio en Inmunología e Inmunoterapla P07/088-F.

 

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