INTRODUCCIÓN

El carcinoma espinocelular oral (CECO) es una neoplasia maligna desarrollada a partir del epitelio plano estratificado de la mucosa oral que se caracteriza por su agresividad local, capacidad de invasión y tendencia a desarrollar metástasis linfáticas de manera temprana (^{Barnes et al., 2005}). En la última década se ha tornado un serio problema de salud pública a nivel global, constituyendo el octavo lugar de incidencia en hombres y decimocuarto en mujeres, representando el 3 % de todos los cánceres en el mundo (^{Siegel et al., 2016}). En Chile la incidencia es de 1,6 % del total de cánceres, con una tasa de mortalidad cercana al 1 % (^{Riera & Martínez, 2005}). Su diagnóstico prematuro se asocia con aumentos en las tasas de supervivencia (Barnes et al.), por lo que resulta imperativo su detección y tratamiento oportuno poniendo especial énfasis en la displasia epitelial, lesión que se clasifica dentro de los desórdenes potencialmente malignos, los cuales presentan inherentemente una mayor probabilidad de progresar a carcinoma espinocelular.

El sistema linfático es un sistema paralelo al circulatorio sanguíneo cuya función principal es la de mantener la homeostasis de fluidos en los tejidos, recogiendo el líquido y proteínas filtradas que se acumula en los espacios intersticiales, devolviéndolos a la circulación sanguínea (^{Jurisic et al., 2009}).

La podoplanina (PDPN) corresponde a una glicoproteína transmembrana expresada por una variedad de tejidos en modelos de animales adultos como el cerebro, corazón, riñon entre otros, sin embargo, su función exacta a nivel fisiológico aún no está del todo dilucidada (^{Astarita et al., 2012}). Hoy en día, se considera el principal marcador de endotelio linfático (LongattoFilho et al., 2007; ^{Kawaguchi et al., 2008}). El dominio citoplasmático de la PDPN es esencial en la función de esta proteína ya que tiene un sitio funcional que actúa como una proteína quinasa dependiente de cAMP, un sitio de fosfoliración de una proteína quinasa C y un racimo de aminoácidos altamente conservados que sirven como sitio de reclutamiento para la familia de proteínas ezrina, radixina y moesina (ERM) (^{Swain et al., 2014}). La función principal de ERM es servir como conectores entre las proteínas de membrana y la actina citoesqueletal contribuyendo a una movilidad aumentada en la célula (^{Inoue et al., 2012}).

El objetivo de este estudio fue evaluar la inmunoexpresión de PDPN en el epitelio y vasos linfáticos de muestras de mucosa oral normal (MON), displasia epitelial oral (DEO) y carcinoma espinocelular oral (CECO).

MATERIAL Y MÉTODO

El diseño del estudio fue descriptivo transversal de serie de casos. Este estudio fue aprobado por el comité de bioética de la Universidad Andrés Bello, Viña del Mar (Folio No 24). El tipo de muestreo fue no probabilístico por conveniencia. La población de estudio fue categorizada de acuerdo a lo siguiente: 19 casos de mucosa oral normal, 18 de displasia epitelial oral y 19 de CECO. Las biopsias de mucosa oral normal se obtuvieron de los márgenes sanos de muestras de lesiones reaccionales como fibromas irritativos y papilomas orales pertenecientes a la casuística del Servicio de Histopatología oral de la Universidad Andrés Bello. Para las muestras de CECO y displasia epitelial oral, se obtuvo la autorización y acceso a los registros de las biopsias orales en los Laboratorios de histopatología de la Facultades de Odontología de la Universidad Mayor (Santiago), Andrés Bello (Viña del Mar) y la Universidad de Talca entre los años 2004 al 2012. Se incluyeron muestras embebidas en parafina con suficiente tejido para obtener dos cortes de tejido, de 3 micrómetros de espesor cada uno, diagnosticados histológicamente como MON, DEO y CECO, con datos clínicos de ubicación de la lesión, género y edad del paciente. Se excluyeron las muestras de CECO secundarias a metástasis, muestras con datos incompletos y/ o con artefactos de técnica. Para confirmar el diagnóstico de MON; DEO y CECO de las muestras seleccionadas, dos patólogos previamente calibrados (concordancia de 0,97) examinaron las láminas teñidas con hematoxilina- eosina (HE) en un microscopio de luz Olympus® CX-31 (Olympus Corporation, Japan). Para realizar los diagnósticos, se basaron en los criterios propuestos por la Organización Mundial de la Salud (OMS).

Técnica de inmunohistoquímica para Podoplanina. De las muestras previamente embebidas en parafina, se obtuvieron los cortes que fueron montados en portaobjetos silanizados, desparafinados e hidratados a través de sucesivos baños de alcohol en concentraciones decrecientes hasta llegar al agua destilada. Luego, se realizó el proceso de recuperación antigénica durante 72 minutos CC1 (Ph 8). Los cortes de tejido fueron incubados con el anticuerpo monoclonal antipodoplanina D2-40 (Dako) durante 50 minutos a 37 °C en una dilución 1:200 y el sistema de detección utilizado será Optiview Ventana (©2015 Ventana Medical Systems, Inc). Todo el protocolo fue utilizando el equipo automatizado Benchmark GX (©2014 Productos Roche). Finalmente, los cortes fueron montados con cubreobjetos usando entellán como medio de montaje. Cada muestra se comparó con un control positivo y negativo inserto en cada una de las placas histológicas. El control inmunopositivo correspondió a una muestra de tejido amigdaliano (patrón de citoplasma y membrana en células epiteliales basilares y linfocitos del centro germinal) mientras que el negativo fue la misma muestra sin el anticuerpo primario.

Evaluación de la inmunoexpresión de Podoplanina en epitelio y en vasos linfáticos. Las muestras fueron analizadas por dos examinadores calibrados (RM y CM). Se consideraron células inmunopositivas para PDPN aquellas que mostraron un patrón de inmunotinción citoplasmático y/o de membrana. En relación a la evaluación de la intensidad de la inmunotinción de PDPN epitelial, esta se clasificó en una escala estratificada entre el 0 al 3, siendo 0= negativo; 1= tinción débil; 2= tinción moderada; y 3= tinción intensa. Para la evaluación de la extensión de inmunotinción de PDPN epitelial en las muestras en estudio, se otorgaron porcentajes a las láminas teñidas, asignándoles cinco categorías, a saber: 0= células sin teñir; 1= 0 <10 %; 2= 10-50 %; 3= 51-80 %; 4= >80 %. Los datos resultantes fueron convertidos a la Puntuación de inmunoreactividad (Inmunoreactive Score- IRS-) multiplicando los puntajes de extensión e intensidad. Los puntajes pueden fluctuar entre 0 al 12. Cada investigador categorizó los casos como una expresión fuertemente positiva (con un IRS entre 9-12), moderadamente positiva (IRS entre 4-8), débilmente positivo (IRS entre 2-3) o negativo (IRS entre 0-1) (^{Kaemmerer et al. 2012}). Con respecto al análisis de la inmunotinción de PDPN en los vasos linfáticos, se definió un microvaso como una célula endotelial aislada o como un nido de células endoteliales positivas para PDPN, con o sin lumen y claramente separadas de los tejidos adyacente. Luego se observó la totalidad de la muestra bajo una magnificación de 40X (10x del lente ocular y 4x del lente objetivo) , en donde se identificó el campo con la mayor densidad de vasos linfáticos (hot spot) por cada muestra (^{Weidner et al., 1991}). Por cada hot spot se fotografiaron los 3 campos ópticos (CO) utilizando una cámara digital Micrometrics® modelo 518 CU de 5,1 megapixeles incorporada al microscopio óptico, con una maginificación de 400x. Finalmente se realizó el conteo individual de los vasos linfáticos (área de examinación de 0.1885 mm2). La densidad media microvascular (DMV) de cada lámina teñida se determinó mediante el promedio de la cantidad de vasos de 3 campos ópticos como indica la siguiente fórmula, y se definió como el número de vasos por mm2, DMV= (número de vasos en CO1+ número de vasos en CO2 + número de vasos en CO3)/ 3 (^{Oliveira-Neto et al., 2012}). Los análisis estadísticos y los gráficos fueron desarrollados en el software estadístico Stata 11.2. Se aplicó el test de Shapiro-Wilk para determinar la distribución de los datos a estudiar. Si los datos presentaban una distribución normal, se aplicó test de ANOVA y cuando no presentaron distribución normal, se utilizaron los test de Mann-Whitney y Kruskall Wallis para comparar entre dos o más grupos, respectivamente. Las diferencias en las frecuencias serán comparadas utilizando chí-cuadrado. Los valores de P < 0,05 fueron considerados significativos.

RESULTADOS

Los datos demográficos de la muestra en estudio se resumen en la Tabla I. Con respecto al análisis de la expresión de inmunohistoquímica de PDPN epitelial de las muestras en estudio, la Tabla II muestra la puntuación de inmunoreactividad (IRS) destacando que las muestras de mucosa oral normal y displasia epitelial oral sólo mostraron un IRS de baja puntuación, a diferencia de lo que ocurrió con las muestras de CECO en donde aproximadamente un 60 % de estas se graduaron con un IRS de moderada a fuerte expresión. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas al comparar el grupo de CECO/MON (p= 0,0078) y CECO/DEO (p= 0, 0200), no así al comparar el grupo de DEO/MON (p= 0,6186) (Fig. 1). Con respecto a la densidad media vascular (DMV), se observó que los valores según diagnóstico estudiado, no presentaron diferencias significativas entre sí (p= 0,4273) (Fig. 2). Los resultados según diagnóstico se observan en la Tabla III. Finalmente, para relacionar los valores de IRS de PDPN a nivel epitelial y la DMV de las muestras en estudio, se aplicó el test de Independencia de Spearman el cual determinó que no hay un grado de asociación entre ambas (p= 0,2056), por lo tanto, se puede concluir que las variables estudiadas son independientes entre ellas.

Fig. 1 Inmunotinción para Podoplanina epitelial. En (A) se observa un patrón mixto (membrana y citoplasmático) de inmunotinción a nivel del estrato basal del epitelio de mucosa oral normal (100X). En (B) se observa una inmunitinción intensa, con un patrón de membrana, la cual sólo abarca el estrato basal y parabasal en una muestra de displasia severa (400x). En (C) se observa la inmunotinción en una muestra de carcinoma espinocelular. El patrón de tinción es mixto, de intensidad severa y, en el frente de invasión del tumor, abarca casi todo el espesor del epitelio afectado (100X). 

Fig. 2 (A): Inmunotinción para podoplanina en los vasos linfáticos del corión. En (A) se observa la inmunotinción en una muestra de displasia epitelial leve. Nótese que el marcador sólo es positivo en los vasos linfáticos y no en los vasos sanguíneos contiguos (400X). En (B) se observa la inmunotinción de patrón mixto (membrana y citoplasmático) a nivel del estrato basal del epitelio de mucosa oral normal y en los vasos linfáticos (400X). 

DISCUSIÓN

En el presente estudio se observó que la inmunotinción para PDPN en las células epiteliales fue positiva, en un patrón mixto (tinción membrana y citoplasmática),e independiente del diagnóstico, lo cual se puede deber a que la podoplanina es una proteína transmembrana (Inoue et al.; ^{Preuss et al., 2014}; ^{Martín-Villar et al., 2015}) o bien porque esta podría sufrir un proceso de translocación proteica, situación que ha sido descrita en otras moléculas que participan en el cáncer, como lo son el EGFR y PD-L1. Tanto la extensión como la intensidad de inmunoexpresión de PDPN epitelial fueron aumentando desde las muestras de MON a CECO, pasando por las de DEO. La expresión de PDPN en epitelios de mucosa oral ha sido descrita en los márgenes de lesiones potencialmente malignas así como también en los márgenes libres de tumor en relación a CECO (^{Margaritescu et al., 2010}). ^{Atsumi et al. (2008}) lo atribuyen a la presencia en este nivel de células epiteliales de reserva o células madre por lo que se propone que la PDPN es un marcador de células tumorales iniciadas con propiedades de células madre. En relación a la expresión de PDPN en displasias y CECO, nuestros hallazgos coinciden con la mayoría de los estudios reportados ya que como postularon Inoue et al., Kawaguchi et al. y ^{Feng et al. (2012}), existe una relación positiva entre la expresión de PDPN epitelial y la presencia y severidad de la displasia. Al evaluar la expresión epitelial de PDPN se obtuvo un valor de IRS menor en las muestras de MON, seguido por las muestras de displasias, mientras que los valores más altos los presentaron las muestras de CECO. Estas diferencias fueron significativas al comparar las muestras de CECO con MON y DEO, lo que nos permite suponer que esta proteína tendría un rol en la transformación maligna en etapas tardías de la carcinogénesis, y no tempranamente como lo han sugerido otros autores (Kawaguchi et al.; ^{de Vicente et al., 2013}). No observamos diferencias en cuanto a estructura, distribución, aspecto y regularidad de los vasos linfáticos en el presente estudio. Esta observación difiere con lo observado por Longatto Filho et al. y ^{Zhao et al. (2008}) quienes caracterizaron los vasos linfáticos intratumorales de CECO como vasos de estructura desorganizada, lúmenes tortuosos, colapsados y de menor diámetro que los linfáticos peritumorales. Con respecto a la densidad media vascular (DMV) observamos que la mayor densidad se presentó en el grupo de MON, seguido por el de DEO y CECO. Nuestros resultados difieren de los de Margaritescu et al., quienes observaron mediante un análisis morfométrico, que las áreas vasculares linfáticas aumentaban progresivamente desde el tejido mucoso oral normal hacia el tejido tumoral, pasando por estadios intermedios de lesiones precancerosas. Nuestros hallazgos son inesperados si consideramos que a la luz del conocimiento actual, las neoplasias malignas como CECO requieren del desarrollo de una microvasculatura para poder crecer y metastatizar, migrando a sitios distantes al foco primario tumoral a través de nuevos vasos sanguíneos y linfáticos provenientes de vasos pre-existentes, los que aparecen en el tejido gracias a factores proangiogénicos liberados por las mismas células transformadas (^{Gomes et al., 2013}). Atribuimos estos resultados a factores asociados a los tipos de muestras con las que trabajamos (incisionales). En este trabajo quisimos conocer la relación entre la expresión de PDPN a nivel epitelial y a nivel de vasos linfáticos, para la cual se aplicó el test de asociación de Spearman, obteniendo que estas variables son independientes entre ellas, lo que quiere decir que la transición epitelial-mesenquimal, asociada a la mayor expresión de PDPN en las células neoplásicas epiteliales, es un fenómeno que ocurriría de manera independiente a la proliferación de vasos linfáticos. Sin embargo, no podemos dejar de reconocer que ambos fenómenos son necesarios para la progresión y metástasis tumoral.