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Introducción
Entre las adaptaciones que suelen presentar algunas plantas en respuesta al desarrollo en condiciones de estrés salino, se encuentra la síntesis de sustancias protectoras o moléculas bioactivas (Stagnari et al., 2014) como la betalaína contenida en miembros del orden Caryophyllales (Cai et al., 2005), al cual pertenece la betarraga (Beta vulgaris L.). El cultivo de esta planta en los últimos años ha llamado la atención científica internacional al ser considerada un alimento con características funcionales benéficas para la salud del ser humano (Clifford et al., 2015) y una potencial fuente de minerales, antioxidantes, azúcar, fibra dietética, vitaminas, ácidos grasos y biomoléculas con alguna actividad biológica, anticancerígena y radioprotectora (Escribano et al., 1998). Dentro de su composición se ha identificado la betaxantina, que exhibe una coloración amarillo-naranja y contiene diferentes cadenas laterales de aminoácidos o aminas. En este grupo se incluyen la indicaxantina y vulgaxantinas I y II. Por otra parte están las betacianinas, de coloración rojo-violeta, que contienen un residuo de ciclo-dihidro xifenilalanina (ciclo-DOPA) e incluyen la betanina, isobetanina y neobetanina (Chhikara et al., 2019). Todos estos compuestos son reconocibles comercialmente como colorantes alimentarios debido a su naturaleza no precaria, no tóxica y no cancerígena.
Su síntesis estaría influenciada por factores como la variedad (Niveyro et al., 2013), estado de maduración (Castellar et al., 2012), incremento de la temperatura (Szopínska y Gaweda, 2013), salinidad (Mulry et al., 2015), luz, nutrientes, reguladores de crecimiento (Bhuiyan et al., 2002) y disponibilidad de agua (Stagnari et al., 2014). En la actualidad existen muy pocos estudios conducentes a evaluar los efectos de los estreses abióticos en la producción y acumulación de esas biomoléculas en este cultivo. En tal sentido, el objetivo de este trabajo fue evaluar la acumulación de ese pigmento en las raíces de betarraga, en dos estaciones del año, en condiciones de salinidad y temperatura del valle de Lluta, ubicado en el norte de Chile, surgiendo como una posibilidad de diversificación productiva para esta zona salina.
Materiales y métodos
Sitio del experimento
El cultivo se realizó al aire libre durante dos estaciones del año (temporada 1: cosecha de frutos hecha en el verano del 2013 (91 Días Después de Trasplante (DDT) y temporada 2: cosecha de frutos en invierno-primavera del año 2014 (99 DDT)) en la parcela experimental de la Facultad de Ciencias Agronómicas de la Universidad de Tarapacá, km 19, sector Rosario del valle de Lluta. Las características químicas del agua de riego y suelo se presentan en las Tablas 1 y 2.
Tabla 1 Características químicas promedios de agua de riego, Temporada 1 y Temporada 2. Sector Rosario, km 19, valle de Lluta.
Fuente. Laboratorio de suelo y agua, Facultad de Ciencias Agronómicas, Universidad de Tarapacá. Años 2013 y 2014. *ND: No detectable.
Tabla 2 Características químicas promedios de suelo, Temporada 1 y Temporada 2. Sector Rosario, km 19, valle de Lluta.
Fuente. Laboratorio de suelo y agua, Facultad de Ciencias Agronómicas, Universidad de Tarapacá. Años 2013 y 2014. *ND: No detectable.
El material vegetal utilizado para la cuanti-ficación de betalaína incluyó la variedad Detroit (T 0 ) de la empresa Bonanza Seeds que es la más cultivada en el valle de Lluta. Se caracteriza por su forma aglobada y piel lisa, así como por su alta uniformidad y productividad. Puede sembrarse durante todo el año y tiene maduración comercial a los 60 días. El segundo tratamiento (T 1 ) correspondió a la variedad Larka de la empresa Semillas Latinoamericanas, una betarraga multigérmica, de precocidad media y follaje vigoroso. Presenta raíces muy homogéneas, redondas y de color rojo intenso. Es recomendada para cultivos de verano y otoño.
Se realizó siembra directa en el terreno previamente preparado con una mezcla de arena y guano de cordero, utilizando un marco de plantación de 0,2 x 1,2 m (41.666 plantas ha-1) y un largo de camellón de 27 m. Durante su desarrollo el cultivo fue regado por goteo y fertilizado según sus requerimientos.
El registro meteorológico de las variables temperatura (°C) y humedad relativa (%) de los meses de estudio (Tabla 3) se obtuvo de las estaciones en línea de la Red Agrometeorológica (AGROMET) del Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA).
Diseño experimental y tratamientos
El experimento se realizó con un diseño de bloques completos al azar, con 2 tratamientos (T0: Detroit y T1: Larka), 4 repeticiones y una superficie total de 259,2 m2 por tratamiento.
La cuantificación de betalaína se hizo en 3 etapas: pre-tratamiento de la muestra, preparación de muestras con N2 líquido y liofilización.
Pre-tratamiento de la muestra: Se colectaron4 muestras homogéneas de cada bloque, de ambas variedades, seleccionando la cuarta parte de cada fruto del bloque (incluida la cáscara) para ser lavadas, ralladas y almacenadas en bolsas herméticas refrigeradas a 5 °C.
Tratamiento con nitrógeno líquido: En un mortero se incorporó una pequeña cantidad de betarraga rallada a la que se agregaron pequeñas dosis de nitrógeno líquido hasta cubrir por completo la muestra para su trituración, pulverización y posterior depósito en tubos falcon de 50 ml, mantenidos en un cooler con hielo. El material congelado se introdujo en una cámara de vacío (liofilizador modelo BK-FD10P, Biobase Biodustry (Shandong) Co., Ltd.) para realizar la separación del agua de las muestras por sublimación. Para acelerar el proceso se utilizaron ciclos de congelación-sublimación y se consiguió eliminar la totalidad del agua libre contenida. Para la cuantificación del contenido total de betalaína se utilizó la metodología indicada por Fernández-López y Almela (2001) mediante evaluación espectrofotométrica (HPLC-grade).
Extracción de betalaína: Se tomó una muestra de 2 g de pulpa liofilizada y se colocó en un matraz Erlenmeyer con 20 ml de metanol acuoso 80% (V/V). La mezcla se sonicó por 10 minutos en un Bath sonicador (Branson model® Danbury, USA) previo a su agitación por 20 minutos en un agitador horizontal (modelo G10 R, New Jersey, USA) a temperatura ambiente y en oscuridad. Cada muestra se centrifugó a 2200 x g por 10 minutos en una centrífuga (Hettich Zentrifugen® Mod. Universal 32, Germany). El sobrenadante se guardó y el residuo se sometió a una segunda extracción con la metodología descrita anteriormente. Los sobrenadantes se juntaron y se filtraron con papel Whatman Número 4, para luego concentrarlos a sequedad en un rotavapor (Buchi® Modelo R-125, Switzerland) a 40 °C.
Cuantificación: La cuantificación de beta-cianinas y betaxantinas se realizó según lo descrito por Castellanos-Santiago y Yahia (2008), mediante la absorbancia de los extractos de las betalaínas a 538 y 483 nm, respectivamente, en un espectrofotómetro (Perkin Elmer Lambda 25® UV/ Vis, (USA)). Para la conversión de las unidades de absorbancia en unidades de concentración se utilizó la expresión: B (mg/g) = (A x FD x PM x V)/(ɛ x P x L), donde B es betacianina o betaxantina, A es la absorbancia 538 nm para betacianina y 483 nm para betaxantina, FD es el factor de dilución al momento de leer en el espectofotómetro, PM es el peso molecular (Betanina = 550 g/mol e Indicatina = 308 g/mol), V es el volumen del extracto, e es el peso molecular (Betanina = 60.000 L/mol cm, e Indicatina = 48.000 L/mol cm) y L es la longitud de la celda (1 cm). Considerando lo anterior, se realizó el cálculo mediante la expresión matemática:
CB (mg/g.ps) = (A* FD* MW+V)/e* peso seco)
Donde:
CB= Contenido de betalaína
A= Absorbancia
F= Factor peso molecular
V=Volumen total
E= Coeficiente de extinción
*Para betacianinas se utilizó una masa de 550 g/mol y un E = 60.000, y para betaxantina una masa de
308 g/mol y un E = 48.000 (Castellanos-Santiago y Yahia, 2008).
Resultados
Contenido de betacianina
Durante la temporada 1 (Tabla 4) se presentaron diferencias significativas (P ≤ 0,05) en la síntesis de betacianina entre T0 (1,41 mg g-1 PS) y T1 (3,38 mg g-1 PS), con resultados similares durante la temporada 2 (1,32 mg g-1 PS en Detroit y 3,32 mg g-1 PS en Larka). Se observaron diferencias estadísticas en la síntesis del pigmento entre ambas variedades. Al comparar el contenido de betacianina en T0, entre temporadas, no se detectaron diferencias significativas en cuanto a la síntesis de esta biomolécula, comportamiento que se observó notoriamente también en T1.
Contenido de betaxantina
Los resultados observados durante la tempora da 1 mostraron diferencias significativas (P < 0,05) en cuanto a la síntesis de betaxantina entre T0 y T1 (3,34 y 6,31 mg g-1 PS, respectivamente). Esta tendencia se repitió durante la temporada 2 (3,43 y 6,63 mg g-1 PS, respectivamente).
Al comparar el contenido de betaxantina en T0, entre ambas temporadas (3,34 y 3,43 mg g-1 PS, respectivamente), no se detectaron diferencias estadísticas significativas en cuanto a su síntesis, comportamiento similar al observado en T1 (6,31 y 6,63 mg g-1 PS, respectivamente).
Por otra parte, en ambas temporadas se observó un mayor contenido de betaxantinas, respecto a betacianinas, en los dos tratamientos (Tabla 4), y hubo diferencias significativas en la síntesis entre ambos pigmentos.
Rendimiento de frutos
Los rendimientos en la temporada 1 mostraron diferencias significativas entre T0 y T1 (15,1 y 9,42 Ton ha-1, respectivamente), tendencia similar a la registrada durante la temporada 2 (21,2 y 17,20 Ton ha-1, respectivamente). T0 fue el tratamiento que presentó en ambas temporadas el mayor rendimiento. Respecto al rendimiento de cada tratamiento, entre las temporadas 1 y 2, los resultados mostraron la existencia de diferencias estadísticas en el de T0 y T1, y fueron significativamente mayores los rendimientos durante la temporada 2 (invierno-primavera), tanto en T0 como en T1 (Figura 1).
Discusión
Según Lee y Wiley (1981), la temperatura sería uno de los factores que tendrían un rol importante en la síntesis de las betalaínas durante el desarrollo del cultivo. Sin embargo, los resultados obtenidos indicarían que el cambio de temporada, y con esto, la fluctuación de las temperaturas ambientales registradas durante los períodos evaluados (Tabla 3), no tendrían un efecto en la síntesis de este pigmento en T0 y T1, o tal vez no la afectarían en condiciones de campo.
Otros autores mencionan que la acumulación de betalaína podría estar influenciada por diversos factores, tanto bióticos como abióticos, y relacionarse con la variedad (Niveyro et al., 2013), estado de madurez (Castellar et al., 2012) y la concentración de micronutrientes en la planta (Tyszka-Czochara et al., 2016). Entre los factores ambientales, el estrés salino sería uno de los principales precursores en la síntesis de este tipo de pigmento en respuesta al exceso de sales presentes en el medio (Jain y Gould, 2015a), y que caracteriza los suelos y el agua de riego del valle de Lluta (Bastías et al., 2004). Al observar los análisis de ambas temporadas, tanto en agua como en suelo (Tabla 1 y 2), se evidencian altos y variables contenidos de sales con exceso de Na+, Cl- y B que podrían inducir alguna respuesta fisiológica en cultivos poco tolerantes. Es el caso de T1, que sintetizó un mayor contenido de betacianina y betaxantina, en ambas temporadas, siendo tal vez una variedad menos sensible a este tipo de estrés, respecto a T0. El comportamiento de T1 coincidiría con el de las halófitas Disphyma australe, Suaeda salsa y Portulaca oleracea, que presentarían una mayor acumulación de betalaína en presencia de estrés salino (Jain y Gould, 2015b; Wang et al., 2006; Mulry et al., 2015).
Se destaca la diferencia entre los niveles de pigmentos sintetizados, duplicándose el contenido de betaxantina en ambas temporadas, tanto en T0 como en T1 (Tabla 4). Este último tratamiento (cv. Larka) fue el que acumuló un mayor contenido de pigmento en ambas temporadas. Esta mayor acumulación de betaxantina coincidiría con los resultados reportados por Valencia et al. (2017) en semillas de quinoa peruana.
Esta escasa documentación de menor o mayor síntesis de uno u otro pigmento y su funcionalidad en situaciones de estrés y, particularmente, en condiciones de salinidad, nos permite sugerir la importancia de realizar estos trabajos considerando el comportamiento de esta biomolécula bajo estrés abiótico.
Se sugiere que factores como la salinidad y el efecto varietal u otros, aún no evaluados, como los mencionados por Kujala et al. (2002) y Belhadj et al. (2017), podrían ser los reguladores o precursores en la síntesis de estas biomoléculas.
Respecto a los rendimientos, se pudo observar un mejor comportamiento de ambas variedades de betarragas durante la temporada de invierno-primavera. Se registraron resultados estadísticos más favorables en la variedad Detroit (T0), debido posiblemente a las mejores características del agua de riego y las temperaturas más adecuadas que explicarían el mayor desarrollo y rendimiento del cultivo.
Si bien es cierto que T0 alcanzó mayores rendimientos que T1, esta diferencia se compensaría en T1 por la mayor concentración de betalaína (betacianina y betaxantina (g/Ha)) en las raíces de betarraga (Tabla 4), lo cual en definitiva es el interés de la industria dedicada a la extracción de pigmentos, con un ahorro de insumos y agua.
Conclusión
La síntesis de betalaína en ambas variedades de betarraga no tendría una relación directa con la estacionalidad y la variación de temperaturas durante el desarrollo del cultivo. Existe, más bien, un efecto de la salinidad y de la variedad en la síntesis y acumulación de esta biomolécula en las raíces de Detroit y mayormente en Larka.
La temporada 2 (invierno primavera) favoreció el rendimiento de ambas variedades de betarraga y en especial el de Detroit, que fue mayor. No obstante, el contenido de betalaína por superficie fue mayor en Larka, en ambas temporadas. Por ello resulta interesante analizar si el destino de la producción de betarraga se orienta a la industria de la extracción y producción de pigmentos como materia prima.
Cabe destacar que la síntesis de estos pigmentos en betarraga cultivada en condiciones de campo y su respuesta a estrés abiótico (alta radiación, temperatura, salinidad y estrés hídrico) ha sido escasamente documentada. Se abre así un campo interesante para estudios que orienten respecto del incremento de la producción de estas biomoléculas en cultivos desarrollados en suelos marginales.
