Introducción

El tomate (Solanum lycopersicum L.) es la hortaliza más cultivada y de mayor valor económico en el mundo (^{Hanssen et al., 2010}). Panamá ocupa el vigésimo segundo y el quinto lugar en producción de tomate en el continente americano y en América Central, respectivamente (FAO, 2017). En Panamá se cultiva, principalmente, tomate industrial, ocupando la provincia de Los Santos, en la región central del país, el primer lugar en producción nacional con 14.635 t (84,1%) (INEC, 2017).

En la provincia de Los Santos se han observado plantas de tomate mostrando síntomas asociados a begomovirus desde 1983, pero el virus del mosaico amarillo de la papa de Panamá (PYMPV; género Begomovirus, familia Geminiviridae) se presentó como un problema a partir de 1991, con el incremento de las poblaciones de la mosca blanca Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae), debido al uso indiscriminado de insecticidas (^{Engel et al., 1998}). Recientemente, se reportó en Panamá la presencia de otras dos especies de begomovirus, el virus del moteado amarillo del tomate (TYMoV) y el virus del enrollamiento de la hoja de tomate de Sinaloa (ToLCSiV), afectando al tomate en las provincias de Herrera (región central) y Chiriquí (región occidental), respectivamente (^{Herrera-Vásquez et al., 2015}, 2016). Los begomovirus presentan uno (monopartito) o dos (bipartito) componentes genómicos, denominados ADN-A y ADN-B, y se transmiten de forma persistente por B. tabaci (^{Jones, 2003}). Las especies de begomovirus identificadas en Panamá poseen un genoma bipartito (Engel et al., 1998; Herrera-Vásquez et al., 2015, 2016).

En los años 1990, el promedio anual de la producción de tomate industrial en Panamá era de 36 t/ha, con pérdidas de rendimiento de 2,2 t/ha por año. Esta situación condujo a pérdidas económicas para los productores de US$ 220/ha por año, lo que equivalió a US$ 1.000.000 durante el período 1991-1997, debido principalmente a las enfermedades causadas por PYMPV (^{Engel et al., 1998}). De igual forma, en el período 2011-2012, la incidencia de este virus alcanzó proporciones epidémicas en la provincia de Los Santos y en otras regiones dedicadas al cultivo de tomate en Panamá (^{Herrera-Vásquez et al., 2016}). Asimismo, en el período 2015-2016, se presentó una disminución de 6.000 t (50%) de la producción de tomate industrial en la provincia de Los Santos, según informaron al periódico El Siglo de Panamá, la asociación de productores de tomate industrial de la provincia de Los Santos y el Ministerio de Desarrollo Agropecuario de Panamá (MIDA) (^{Mendoza, 2015}).

La identificación de begomovirus debe ser un proceso permanente, dado que los nuevos patógenos requieren cambios continuos en las estrategias de manejo. Este estudio se realizó con el objetivo de determinar la incidencia actual de PYMPV, y su asociación con la reducción de la producción de tomate industrial informada recientemente en la provincia de Los Santos.

Materiales y Métodos

Se recolectaron 70 muestras de tomate industrial de diferentes cultivares locales (T-7, T-8 y criollo), cultivados a campo abierto en nueve parcelas ubicadas en siete localidades distintas de la provincia de Los Santos, Panamá, durante el período 2016-2017 (Figura 1, Tabla 1). Cada parcela se georreferenció con la ayuda de un sistema de posicionamiento global (GPS). En total, se tomaron muestras de plantas que mostraban síntomas asociados a begomovirus, con diferentes grados de severidad, incluyendo mosaico amarillo y enrollamiento de las hojas, reducción del tamaño de las plantas, maduración irregular y reducción del tamaño de los frutos (Figura 2). Se utilizó agua ultrapura estéril y se cultivaron plantas de tomate (cultivares T-7, T-8 y T-9) en una jaula a prueba de insectos, para ser utilizadas como controles negativos en la detección e identificación de begomovirus mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Figura 1 Localización geográfica del área muestreada en la provincia de Los Santos, Panamá (período 2016-2017): N^os 1 y 2 (Parcelas 1 y 2, Tres Quebradas), N° 3 (Parcela 3, Las Cruces), N° 4 (Parcela 4, La Colorada), N^os 5 y 6 (Parcelas 5 y 6, San Luis), N° 7 (Parcela 7, Villa Lourdes), N° 8 (Parcela 8, El Ejido), y N° 9 (Parcela 9, Chupá). 

Tabla 1 Incidencia y distribución del virus del mosaico amarillo de la papa de Panamá (PYMPV) mediante PCR en muestras de tomate procedentes de diferentes localidades de la provincia de Los Santos, Panamá (período 2016-2017). 

^a La altitud corresponde a metros sobre el nivel del mar (MSNM).

^b Número de plantas positivas. Para determinar la especie de begomovirus, se analizaron solamente las muestras que resultaron positivas a begomovirus. El virus del moteado amarillo del tomate (TYMoV) y el virus del enrollamiento de la hoja de tomate de Sinaloa (ToLCSiV) no se identificaron en este estudio. Por tanto, estos virus no se incluyeron en la tabla.

Figura 2 Síntomas de mosaico amarillo de hojas (a); enrollamiento de hojas (b); reducción del tamaño de la planta de tomate (c); maduración irregular y reducción del tamaño de los frutos de tomate (d). 

La extracción de ADN total de cada muestra se realizó siguiendo el protocolo indicado por ^{Dellaporta et al. (1983}). La detección de begomovirus se realizó mediante la técnica de PCR, siguiendo el procedimiento descrito por ^{Herrera-Vásquez et al. (2016}), utilizando dos parejas de iniciadores degenerados, PAL1v1978/PARc715 y PBL1v2040/PCRc2, los que amplifican parcialmente el ADN-A y el ADN-B de este grupo de virus, respectivamente (^{Rojas et al., 1993}). La primera pareja de iniciadores amplifica un fragmento de ~1.400-pb, correspondiente a un segmento de la proteína asociada con la replicación (Rep), la región común (CR) completa y un segmento de la proteína de cubierta (CP), mientras que la segunda pareja de iniciadores amplifica un fragmento de ~500-pb, correspondiente a un segmento de la proteína de movimiento (MP) y la región común (CR) completa (Rojas et al., 1993).

La tipificación de begomovirus se realizó mediante PCR, solamente en las muestras que resultaron positivas a begomovirus, siguiendo el protocolo descrito por ^{Herrera-Vásquez et al. (2016}). Para ello, se utilizaron iniciadores específicos para las tres especies de begomovirus que infectan tomate en Panamá (PYMPV, TYMoV y ToLCSiV) (Herrera-Vásquez et al., 2015, 2016). Los iniciadores PYMPVA-151v/PYMPVA-894c (específicos para PYMPV) amplifican un fragmento de 743-pb, correspondiente a un segmento de la CP (Herrera-Vásquez et al., 2016), mientras que los iniciadores TYMoVC 1v/TYMoVC 1c (específicos para TYMoV) y ToLCSiVC2v/ToLCSiVC2c (específicos para ToLCSiV) amplifican un fragmento de 479-pb y 580-pb, respectivamente, correspondientes a un segmento de la Rep (^{Nakhla et al., 2005}).

Para confirmar la identidad de PYMPV, única especie de begomovirus identificada en este estudio, se secuenciaron dos productos de PCR en el Instituto Smithsonian de Investigaciones Tropicales (STRI) en Panamá. Las secuencias obtenidas se compararon con secuencias de PYMPV disponibles en la base de datos del GenBank, con la ayuda del instrumento de búsqueda de alineamientos locales básicos (BLAST) (^{Altschul et al., 1997}). El árbol de homología se obtuvo de la comparación de las secuencias de PYMPV en el programa DNAMAN versión 4.02 Lynnon Biosoft©1994-98 (Institute of Plant Pathology, BBA, Alemania). Las secuencias de ToLCSiV (AJ608286) y TYMoV (KC176780) se utilizaron como "outgroup". Las secuencias de PYMPV presentadas en este estudio se depositaron en la base de datos del GenBank bajo los números de acceso MF940172 y MF940173.

Resultados y Discusión

La detección de begomovirus se realizó mediante PCR, utilizando iniciadores degenerados para el ADN-A y el ADN-B de estos virus. Cincuenta y ocho (58) muestras de tomate (82,9% del total de muestras recolectadas) (Tabla 1) mostraron el tamaño de banda esperado de ~1.400-pb y ~500-pb para el ADN-A y el ADN-B, respectivamente, tras la electroforesis en gel de agarosa, lo que indica que existe infección por begomovirus bipartito del Nuevo Mundo. No se observó amplificación cuando se utilizó agua ultrapura estéril o plantas sanas de tomate como molde en el análisis de PCR (Figura 3).

Figura 3 Amplificación mediante PCR de fragmentos de ~1.400-pb y ~500-pb correspondientes al ADN-A (a) y ADN-B (b) de begomovirus, respectivamente. Línea 1, agua ultrapura estéril; Línea 2, planta de tomate sana; Líneas 3-8, muestras de hojas de tomate procedentes de distintas localidades de la provincia de Los Santos; Línea M, marcador de peso molecular de 100-pb (AMRESCO). 

La presencia de begomovirus se determinó en todas las parcelas y localidades evaluadas en la provincia de Los Santos, durante el período 2016 2017 (Tabla 1). La incidencia más alta (100,0%) se presentó en las localidades de Tres Quebradas (Parcela 1) y San Luis (Parcela 5), mientras que la incidencia más baja (60,0%) se obtuvo en las localidades de Las Cruces (Parcela 3) y Chupá (Parcela 9) (Tabla 1). En estudios previos realizados por ^{Herrera-Vásquez et al. (2016}), la incidencia de begomovirus se presentó en el rango de 20-80% en cultivos de tomate en diferentes localidades de la provincia de Los Santos, incluida Tres Quebradas. No obstante, el presente estudio es el primero que analiza la incidencia de begomovirus en las localidades de Las Cruces, La Colorada, San Luis, Villa Lourdes, El Ejido y Chupá, consideradas las zonas más importantes del cultivo de tomate en esta provincia. Por tanto, la disminución de la producción de tomate industrial reportada recientemente en la provincia de Los Santos, podría estar asociada a la alta incidencia de begomovirus determinada en este estudio, lo que coincide con la presencia en esta región del país de los biotipos A y B de B. tabaci (^{Alvarado et al., 2004}), denominados actualmente grupos Nuevo Mundo (NW) y Oriente Medio Asia Menor 1 (MEAM1), respectivamente (^{Lee et al., 2013}), ambos vectores de begomovirus (^{Morales, 2006}).

La tipificación de begomovirus se realizó mediante PCR en las 58 muestras que mostraron una reacción positiva a este grupo de virus, utilizando iniciadores específicos para PYMPV, TYMoV y ToLCSiV, únicas especies de begomovirus reportadas en tomate en Panamá (^{Herrera-Vásquez et al., 2015}, 2016). Se identificó solamente a PYMPV en el 100,0% de estas muestras (Tabla 1), coincidiendo con los estudios realizados por ^{Engel et al. (1998}) y Herrera-Vásquez et al. (2016), quienes reportan solamente a esta especie infectando cultivos de tomate en la provincia de Los Santos. El producto de PCR amplificado con los iniciadores específicos para este virus, presentó el tamaño de banda esperado de 743-pb tras la electroforesis en gel de agarosa. No se observó amplificación de este fragmento en los controles negativos utilizados como molde en el análisis de PCR (Figura 4).

Figura 4 Amplificación mediante PCR de un fragmento de 743-pb correspondiente a la proteína de cubierta (CP) del virus del mosaico amarillo de la papa de Panamá (PYMPV). Línea 1, agua ultrapura estéril; Línea 2, planta de tomate sana; Líneas 3-8, muestras de hojas de tomate procedentes de distintas localidades de la provincia de Los Santos; Línea M, marcador de peso molecular de 100-pb (AMRESCO). 

Un total de 12 muestras de tomate que mostraban síntomas asociados a virus, las que se recolectaron en diferentes localidades de la provincia de Los Santos, resultaron negativas a begomovirus mediante PCR (Tabla 1). Estas muestras podrían albergar la presencia de otros virus que infectan tomate en distintas regiones de Panamá, como el virus Y de la papa (PVY; género Potyvirus, familia Potyviridae) (^{Herrera-Vásquez et al., 2009b}), virus del mosaico del pepino (CMV; género Cucumovirus, familia Bromoviridae), virus del torrado del tomate (ToTV; género Torradovirus, familia Secoviridae) (Herrera-Vasquez et al., 2009a), virus del mosaico del tabaco (TMV) y virus del mosaico del tomate (ToMV), ambos pertenecientes al género Tobamovirus dentro de la familia Virgaviridae (J.A. Herrera-Vásquez, comunicación personal). PVY y CMV se transmiten por áfidos de forma no persistente (^{Brunt et al., 1996}), mientras que ToTV se transmite por las moscas blancas B. tabaci, Trialeurodes vaporariorum Westwood y Trialeurodes abutilonea Haldeman de forma semipersistente (^{Verbeek et al., 2014}). En Panamá, se reporta la presencia solamente de B. tabaci y T. vaporariorum (^{Zachrisson y Poveda, 1992}). TMV y ToMV se transmiten mecánicamente y por semilla (Brunt et al., 1996). La presencia o ausencia de estos virus en las muestras que resultaron negativas a begomovirus podría analizarse en un futuro estudio.

Las secuencias de PYMPV obtenidas en este estudio (MF940172 y MF940173), quienes se compararon con las secuencias de este virus obtenidas en 1998 (Y15034), 2011 (KP313716) y 2012 (KP313717), mostraron una alta homología (97-100%) a nivel de secuencia de nucleótidos en la zona del genoma estudiada (CP) (Figura 5). Por tanto, estos resultados aportan evidencia de que PYMPV se ha diseminado durante los últimos 20 años en Panamá con una variabilidad genética muy baja, lo que es consistente con los trabajos realizados para virus de plantas, que indican que la estabilidad genética en lugar de la diversidad podría ser la regla general de este grupo de virus, independientemente si su genoma es ARN o ADN (^{Gibbs et al., 1999}).

Figura 5 Árbol de homología de la secuencia parcial de la pro teína de cubierta (CP) obtenido con el programa DNAMAN. En el análisis realizado se incluyeron las secuencias del virus del mosaico amarillo de la papa de Panamá (PYMPV) obtenidas en este estudio en 2016 (MF940172) y 2017 (MF940173), las que se compararon con secuencias de este virus obtenidas en 1998 (Y15034), 2011 (KP313716) y 2012 (KP313717). Las secuencias del virus del enrollamiento de la hoja de tomate de Sinaloa (ToLCSiV) (AJ608286) y virus del moteado amarillo del tomate (TYMoV) (KC176780) se utilizaron como "outgroup". 

Conclusiones

Las prospecciones realizadas históricamente en cultivos de tomate de la provincia de Los Santos, revelan que las infecciones causadas por PYMPV son de especial preocupación en esta región del país. Esta información podría ayudar a establecer una base para el diseño de estrategias de control de las epidemias causadas por begomovirus en los cultivos de tomate panameños.