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Idesia (Arica)

versión On-line ISSN 0718-3429

Idesia v.26 n.3 Arica  2008

http://dx.doi.org/10.4067/S0718-34292008000300002 

IDESIA (Chile) Vol. 26, Nº 3; 7-19, 2008

INVESTIGACIONES

 

INTERACCIÓN RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM BV TRIFOLII Y HONGOS MICORRÍCICOS EN UN ANDISOL CON DIFERENTES NIVELES DE SATURACIÓN DE ALUMINIO

INTERACTION OF RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM BV TRIFOLII AND MYCORRHIZAL FUNGI IN AN ANDISOL AT DIFFERENT LEVELS OF ALUMINIUM SATURATION


Claudia G. Castillo R.1*; Rosa Rubio H.2; Horacio Urzúa S.3; Fernando Borie B.2

1 Universidad Católica de Temuco, Casilla 15-D, Temuco, Chile.
2 Universidad de La Frontera, Casilla 54-D, Temuco, Chile.
3 Pontificia Universidad Católica de Chile, Casilla 306 Correo 22, Santiago, Chile. E-mail: ccastill@uct.cl


RESUMEN

La fitotoxicidad por Al es una seria limitante de la productividad de praderas crecidas sobre suelos volcánicos afectando la nodulación y efectividad de los Rhizobium. El objetivo del estudio consistió en seleccionar cepas de Rhizobium de colección para estudiar su efectividad en Trifolium repens crecido en un Andisol con cepas nativas y distinta saturación de Al. Para ello se evaluó previamente en caldo nutritivo la tolerancia a la acidez y toxicidad por Al de 12 cepas de colección mediante control de curvas de crecimiento. Paralelamente, se inocularon los Rhizobium en un Andisol para evaluar su efectividad mediante rendimiento de Trifolium pratense. Se seleccionaron las cepas R-109, R-113 y R-115 para inocularlas en el Andisol utilizando cuatro tratamientos: suelo adicionado de 2 Mg CaCO3 ha-1 (SAl1), un testigo (SAl2) y suelo adicionado de dos niveles de saturación Al (SAl1, SAl4) utilizando Trifolium repens como hospedero. Las plantas mostraron capacidad para asociarse con las especies inoculadas presentando mayor efectividad R-113-SAl1 sinergismo positivo expresado en variables microbiológicas como nodulación (16 nódulos maceta-1), esporas de hongos micorrícicos arbusculares, HMA (384 esporas 100g-1), colonización HMA (45%) junto con variables agronómicas alcanzándose un incremento de biomasa foliar (93,5%) frente al testigo. Niveles más elevados de Al afectaron la inoculación con cepas de colección; así, con R-109 se obtuvo el menor crecimiento radical y nodulación respecto al suelo natural mientras que R-113 fue la cepa más efectiva.

Palabras clave: Micorriza arbuscular, actividad fosfatásica, Trifolium repens, Trifolium pratense.

ABSTRACT

Aluminium phytotoxicity is a serious limitation of the productivity of prairies growing on volcanic soil by affecting nodulation and effectiveness of Rhizobium. The aim of this study was to select Rhizobium strains to determine the effect as inoculant on Trifolium repens cropped in an Andisol with different aluminium saturation levels. Acidity tolerance (pH 4.5 and 6.0) of twelve Rhizobium strains of collection at three Al levels (100, 200, 300 µM) was evaluated in mineral nutritive medium vitro. Simultaneously, in a greenhouse trial, strains effectivity were tested by inoculation of Trifolium pratense growing in an acidic Andisol and compared with dry matter accumulation produced by native strains. According to the results of this two trials, three Rhizobium strains (R-109, R-113 and R-115) were selected to study the effect of their inoculation on Trifolium repens growth cropped in an Andisol at four Al saturation levels (SAl1 to SAl4). In addition, the effect on arbuscular mycorrhizal propagules was also studied. Plants showed different capacity for association with the inoculated strains giving the best response R-113 at SAl1 level with positive synergism expressed by microbiological parameters such as high nodulation (16 nodules pot-1), AMF spore number (384 spores 100 g-1), root colonization percentage (45%), together with agronomical variables with an increase of aerial phytomass (93,5%) in comparison with the control. Higher Al levels had an deleterious effect on the inoculation of collection strains; therefore, with R-109 strain inoculation the smallest root growth and nodulation were observed in comparison with soil with native strains whereas R-113 was the more effective one.

Key words: Arbuscular mycorrhizae, phosphatase activity, Trifolium repens, Trifolium pratense.


INTRODUCCIÓN

La Novena y Décima Región del sur de Chile corresponden a zonas ganaderas por excelencia, siendo las praderas la base de la alimentación con una superficie aproximada de 2,5 millones de ha (Campillo, 1997), de las cuales la pradera mixta compuesta por trébol blanco (Trifolium repens L.) y ballica perenne (Lolium perenne L.) ocupa una superficie de 1,29 millones de ha (VI Censo Nacional Agropecuario, 1997). En dicha área existen amplias extensiones de suelos ácidos (Mora et al., 2006) originados por las abundantes lluvias de los meses de invierno con lixiviación de cationes y por el uso de fertilizantes ácidos del tipo amoniacal (Mora y Demanet, 1999). En este tipo de suelos el P es adsorbido fuertemente sobre los hidróxidos de Fe y Al, lo que incide en un incremento de la toxicidad por Al (Fageria y Stone, 2006), con un consiguiente descenso en la productividad y calidad de las praderas (Mora et al., 2004) como también de la actividad microbiana (Yang et al., 2004).

En la endorrizósfera (Fageria y Stone, 2006) existe una amplia gama de microorganismos que favorecen la nutrición vegetal y, por tanto, el funcionamiento de toda la biosfera. Entre ellos se encuentran los hongos micorrícicos arbusculares (HMA), simbiontes que mejoran la captación de nutrientes poco móviles desde el suelo (Azcón et al., 1991) y los Rhizobium que forman asociaciones simbióticas con las raíces de leguminosas multiplicándose dentro de las células corticales con formación de nódulos (Helyar, 2003). La eficiencia de ambas simbiosis dependerá del hongo o bacteria, hospedero y condiciones edáficas como acidez, toxicidad por Al (Hungria y Vargas, 2000), niveles de nutrientes, metales pesados, temperatura y humedad (Campo y Wood, 2001).

De esta manera, la actividad microbiológica aumenta la disponibilidad de nutrientes, resultando ser procesos económicamente más asequibles que los agroquímicos y que permiten la conservación del medio ambiente (Stamford et al., 1998). Sin embargo, por la gran diversidad de poblaciones de Rhizobium nativas se requieren cepas adaptadas a las condiciones de acidez y toxicidad de Al (De-Polli et al., 1988) que sean capaces de sobrevivir en estos suelos ácidos y que posibiliten la formación de una simbiosis efectiva (Taylor et al., 1991).

De aquí que el objetivo de este estudio consistió en seleccionar cepas de Rhizobium de colección tolerantes a la acidez y Al en caldo nutritivo. Paralelamente mediante inoculación en un suelo ácido se estudió su efectividad en Trifolium pratense para, finalmente, estudiar en un Andisol con distintos niveles de saturación de Al el efecto de la inoculación de las cepas seleccionadas sobre Trifolium repens mediante evaluación de parámetros edáficos, microbiológicos del microsimbionte y de rendimiento del macrobionte.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Este estudio se realizó en los Laboratorios e Invernaderos del Departamento de Ciencias Químicas de la Universidad de La Frontera.

Ensayo I: selección de cepas tolerantes a acidez y toxicidad por Al en caldo nutritivo

Para cuantificar el número de células microbianas en un cultivo existen métodos directos o indirectos; entre los indirectos uno de los más utilizados es la medición de turbidez, metodología relativamente rápida basada en la capacidad que tienen las células microbianas de dispersar la luz que incide sobre ellas y como el tamaño de las células en una población es prácticamente constante, el grado de dispersión se considera proporcional a la concentración de células presentes (Aquiahuati y Pérez, 2004).

Para este ensayo se utilizaron doce cepas de Rhizobium leguminosarum bv trifolii de colección (R 100, 109, 110, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 y 121) proporcionadas por PROBICAL Ltda., reproducidas previamente mediante siembra estéril en placa petri con agar nutritivo-extracto de levaduramanitol (Cleyet-Marel, 1983) bajo condiciones estériles en cámara de flujo laminar. La duración aproximada del ensayo fue de dos meses, utilizándose tubos de tapa rosca (18 x 2,5 cm) conteniendo 35 mL de caldo nutritivo de extracto levadura-manitol (Cleyet-Marel, 1983), exento de agar, ajustado a dos niveles de pH (4,5 y 6,0) y adicionado de Al2(SO4)3.18H2O en dosis equivalente a 100 (Al1), 200 (Al2) y 300 (Al3) µM de Al, con tres repeticiones por tratamiento. El diseno experimental fue uno completamente al azar que incluyo como tratamientos las doce cepas de Rhizobium, los cuatro niveles de Al incluyendo un control sin Al (Al0), dos niveles de pH y tres repeticiones, con un total de 288 unidades experimentales. Los tubos sembrados con cada una de las cepas de colección se mantuvieron en oscuridad a 26 °C con agitación y observación permanente de aparición de turbidez, la que se inició el día 4. Mediante lecturas adecuadas para un espectrofotómetro, se evaluó diariamente la concentración celular desde el día 4 hasta el día 7 (T4, T5, T6, T7), tiempo en que las cepas dejaron de reproducirse.

Ensayo II: selección de cepas eficientes de Rhizobium en Trifolium pratense crecido en un Andisol serie Gorbea

Este ensayo en invernadero se realizó en paralelo con el ensayo en caldo nutritivo y como en los suelos ácidos las leguminosas forrajeras presentan distintos grados de sensibilidad a toxicidad por Al, se utilizó como planta hospedera Trifolium pratense por ser una especie sensible (Barrientos et al., 1994).

Suelo. Se utilizó un Andisol serie Gorbea (39º07’72º41’) de textura franco limosa a franca en sus primeras estratas, muestreado a 20 cm de profundidad procedente de un cultivo de lupino.

Reproducción de los Rhizobium. Las doce cepas de colección conservadas a 4 °C en agar inclinado se inocularon en matraces Erlenmeyer estériles conteniendo caldo extracto de levadura-manitol (Cleyet-Marel, 1983) exento de agar, agitándose en oscuridad durante 5 días a 26 °C para aumentar la masa celular.

Diseño experimental. Se utilizó un diseño completamente al azar que incluyó las doce cepas de colección más un testigo correspondiente al suelo conteniendo las cepas nativas y cuatro repeticiones, con un total de 52 unidades experimentales.

Siembra. Macetas de aproximadamente 300 g de capacidad se completaron con el Andisol tamizado a 2 mm y fertilizado con superfosfato triple (SFT) con el equivalente a 180 kg P2O5 ha-1, sembrándose ocho semillas pregerminadas de Trifolium pratense cv Quiñequeli. A los siete días después de la siembra (DDS) se añadieron 2 mL de suspensión de Rhizobium por maceta, manteniéndose durante todo el ensayo la humedad del suelo a capacidad de campo. A la semana siguiente, se ralearon las macetas para dejar una densidad de tres plantas maceta-1. Durante el transcurso del ensayo se realizaron dos cortes mensuales de la parte aérea, realizándose la cosecha a los 160 días después de la emergencia (DDE), determinándose la cantidad de materia seca maceta-1 mediante secado en estufa a 65 °C por 48 h.

Selección de tres cepas de colección. De acuerdo con los resultados obtenidos en el ensayo de exposición de las cepas al caldo nutritivo con distintos niveles de Al y el de inoculación de las cepas en el suelo con trébol rosado, se seleccionaron los Rhizobium R-109, R-113 y R-115 como los más efectivos y tolerantes a Al.

Ensayo III: eficiencia de inoculación de tres cepas de Rhizobium de colección en un Andisol con distintos niveles de saturación de Al sobre Trifolium repens

Con las tres cepas seleccionadas se procedió a evaluar la respuesta de su inoculación en el Andisol serie Gorbea conteniendo los microorganismos nativos (entre ellos Rhizobium y HMA) sobre T. repens en un ensayo en invernadero que permaneció durante siete meses bajo condiciones controladas de temperatura, humedad, luminosidad y que incluyó cuatro tratamientos:

a) SAl1: Andisol adicionado de CaCO3 en una dosis equivalente a dos Mg de cal ha-1.
b) SAl2: Andisol serie Gorbea.
c) SAl3: Andisol seco adicionado de una solución de Al2(SO4)3.18H2O en el equivalente a 2 cmol (+) kg-1 de Al.
d) SAl4: El mismo Andisol utilizado en el tratamiento anterior pero con una dosis equivalente a 3,5 cmol (+) kg-1 de Al (Mora y Barrow, 1996).

El análisis químico de los suelos al comienzo del ensayo se muestra en el Cuadro 1. Todos los tratamientos fueron fertilizados por una vez con SFT con el equivalente a 180 kg P2O5 ha-1 utilizándose como hospedero trébol blanco (Trifolium repens cv Huia), leguminosa utilizada comúnmente en praderas mixtas de la IX y X Región. Las macetas de aproximadamente 700 g de capacidad se completaron con el suelo de cada tratamiento, sembrándose 20 semillas pregerminadas y manteniéndose durante todo el ensayo la humedad del suelo a capacidad de campo. A los siete DDS se añadieron a cada maceta 2 mL de suspensión de Rhizobium, repitiéndose la aplicación nuevamente a la semana siguiente. A los 15 DDS se raleó el ensayo, dejando una densidad de 15 plantas maceta-1. El diseño experimental fue completamente al azar, teniendo como tratamientos las cuatro cepas de Rhizobium (incluyendo un control sólo con cepas nativas), los cuatro niveles de saturación de Al y cuatro repeticiones con un total de 128 unidades experimentales. Para cada parámetro evaluado se realizó un análisis ANOVA de una vía con cuatro repeticiones, aplicándose la transformación arcoseno previo al análisis de varianza cuando fue necesario para normalización de datos, seguido por el Test de Duncan de rango múltiple (Duncan, 1955) (α ≤ 0,05) mediante el programa estadistico JMP 5.01 (SAS).

Cuadro 1

Características químicas del Andisol serie Gorbea con distintos niveles de saturación de Al en un comienzo y a la finalización del ensayo de inoculación con tres cepas de Rhizobium de colección sobre Trifolium repens

Evaluaciones

Hospedero. Al término del ensayo se determinó el rendimiento acumulado de la planta a través de cuatro cortes mensuales, utilizándose la parte aérea secada en estufa a 65 °C durante 48 h. La masa foliar se molió y calcinó a 550 °C durante 8 h y las cenizas se trataron con HCl para determinar Ca, Mg y Al por espectrofotometría de absorción atómica (EAA), P mediante espectrofotometría usando el método del fosfomolibdatovanadato y N por el método Kjeldhal (Sadzawka et al., 2004a). Para el tratamiento SAl4 en el suelo testigo y en el inoculado con R-109 no se pudieron realizar los análisis anteriores por el escaso material vegetal obtenido.

Suelo. La determinación de pH se realizó potenciométricamente en relación suelo:agua (1:2,5) y el contenido de humedad se calculó secando el suelo en estufa a 105 °C por 24 h. El contenido de materia orgánica se determinó por digestión húmeda con dicromato en medio ácido (Walkley y Black, 1934) y el P disponible mediante extracción con NaHCO3 0,5 M a pH 8,5 con posterior medición espectrofotométrica (Olsen y Sommers, 1987). Los cationes intercambiables (Ca, Mg) fueron extraídos con CH3COONH4 1 M a pH 7,0 y analizados por EAA. El Al intercambiable se extrajo con KC1 1 M y se analizó por EAA (Sadzawka et al., 2004b).

Determinaciones microbiológicas. El conteo de nódulos se realizó en raíces cuidadosamente lavadas junto con la observación cualitativa de tamaño y tonalidad interna, considerándose activos aquellos nódulos que presentaron coloración roja a rosada (apreciación: +++ y ++, respectivamente) por evidenciar presencia de leghemoglobina, mientras que el color blanco (apreciación: +) se consideró como nódulo joven.

Para la determinación de colonización por HMA se separaron cuidadosamente las raíces limpias de la parte aérea y al azar se cortaron trozos de 1 cm que se tiñeron según metodología descrita por Phillips y Hayman (1970) con posterior cuantificación de las estructuras fúngicas según método del intercepto de líneas (Giovannetti y Mosse, 1980). Las esporas HMA se aislaron desde el suelo de acuerdo con el método del tamizado y decantación húmeda seguido por centrifugación en gradiente de sacarosa con posterior cuantificación bajo lupa estereoscópica en placa de Doncaster (Sieverding, 1991). Finalmente, para la actividad fosfatásica ácida se siguió metodología propuesta por Tabatabai y Bremner (1969) con modificaciones realizadas por Rubio et al. (1990) para suelos derivados de cenizas volcánicas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Ensayo I: selección de cepas de Rhizobium tolerantes a la acidez y Al

Las doce cepas de Rhizobium reproducidas en caldo levadura-manitol presentaron turbidez al cuarto día (T4), la que aumentó al día siguiente para comenzar a decaer el día 6 (T6), pudiendo clasificarse como especies de crecimiento rápido (Cleyet-Marel, 1983). Los Rhizobium de colección resultaron ser sensibles a la acidez, mostrando un bajo crecimiento en el caldo de pH 4,5 y presentando variaciones entre cepas a la tolerancia de Al (Figura 1A). En este estudio el pH se ajustó a una unidad más ácida que la propuesta por Ayanaba et al. (1983), mientras el medio ajustado a pH 6,0 (Figura 1B) se seleccionó de acuerdo con lo informado por Octive (1990) quien despues de adicionar distintas concentraciones de Al en el medio trabajó con el pH original. Diferencias de pH en las soluciones alteran la actividad y concentración de especies de Al por reacciones de disolución y precipitación en las fases sólidas o líquidas (Ritchie 1994, Campo y Wood, 2001), lo que explicaría el comportamiento de las cepas a los dos pH utilizados.

Figura 1A.

Curvas de crecimiento de doce cepas de Rhizobium de coleccion en caldo levadura-manitol ajustado a pH 4,5 y cuatro niveles de Al (0- 100- 200- 300 µM Al).

Una cepa que presentó distinta turbidez en los dos medios estudiados fue R-113; en el caldo ácido no presentó diferencias de crecimiento con los distintos niveles de Al, mientras en el caldo de pH 6,0 adicionado con el equivalente a 200 µM de Al alcanzó la mayor turbidez al día 5 (T5). A la dosis de 100 µM de Al no presentó diferencias con el testigo, mientras que con el tratamiento Al3 se inhibió su desarrollo mostrando, en general, mayor crecimiento en el medio de menor acidez. Las cepas 118, 119 y 121 a pH 6,0 presentaron turbidez al día 4, deteniéndose bruscamente su crecimiento al día siguiente (Figura 1B). Resultados similares mostrando variaciones en la tolerancia a Al entre cepas han sido informados por Taylor (1991) y Campo y Wood (2001).

Figura 1B.

Curvas de crecimiento de doce cepas de Rhizobium de coleccion en caldo levadura-manitol ajustado a pH 6,0 y cuatro niveles de Al (0- 100- 200- 300 µM Al).

Ensayo II: seleccion de cepas de Rhizobium de coleccion eficientes en Trifolium pratense

El mayor rendimiento acumulado a traves de dos cortes lo presento la inoculacion de la cepa R-113 seguida por la cepa R-115, no encontrandose diferencias significativas entre los dos ecotipos de Rhizobium (Figura 2). La inoculacion con cinco de las doce cepas de coleccion produjo diferencias de rendimiento en T. pratense comparadas con el testigo. Por esta razon, se seleccionaron como mas eficientes los Rhizobium R-113 y R-115, resultados que fueron corroborados por el mayor crecimiento alcanzado por R-113 en caldo nutritivo a pH 6,0. Como tercera cepa se eligio R-109, por representar el comportamiento general observado en el resto de las cepas en caldo nutritivo o inoculadas en el Andisol.

Figura 2:

Efecto de la inoculación de doce cepas de Rhizobium de colección en un Andisol serie Gorbea sobre el rendimiento acumulado a través de dos cortes de Trifolium pratense.

Ensayo III: eficiencia de inoculacion con tres cepas de Rhizobium de coleccion en un Andisol con cuatro niveles de saturacion de Al sobre Trifolium repens

En general, los rendimientos disminuyeron con el aumento en la saturacion de Al del suelo (Figura 3A); la adición de cal disminuyó notablemente el porcentaje de saturación de Al (Cuadro 1), resultando favorecida la producción de trébol blanco que incrementó el rendimiento en un 23% en el testigo con cepas nativas como consecuencia de las mejores condiciones edáficas alcanzadas en el tratamiento SAl1 (0,9% de saturación de Al). En SAl1 la inoculación con Rhizobium de colección mejoró los rendimientos en un 30% con R-109, 93,5% con R-113 y un 28% con R-115 respecto a sus testigos con cepas nativas en el suelo sin adición de cal (SAl2). La adición de CaCO3 en los suelos ácidos neutraliza el Al de la solución del suelo incrementando los contenidos de Ca, Mg, Mo y disminuyendo la acidez, lo que favorece las actividades biológicas de la rizósfera junto con estimular la mineralización del P-orgánico. En este trabajo, al descender drásticamente la saturación de Al a un promedio de 1%, las nuevas condiciones edáficas permitieron un ambiente favorable para el funcionamiento de la FBN. Los tratamientos con altos niveles de saturación de Al (SAl3 y SAl4) presentaron bajos rendimientos de T. repens, no existiendo diferencias de materia seca entre las cepas nativas con las inoculadas por el daño que produjo el Al en el sistema radical, limitando la formación de nódulos y por tanto inhibiendo el proceso de FBN. Richardson et al. (1988) observaron en T. repens que el Al afectó el crecimiento de Rhizobium trifolii tanto en solución como en la rizósfera de la planta. Las especies y variedades dentro de las especies vegetales muestran grandes diferencias en la susceptibilidad a la toxicidad por Al (Ma, 2000), siendo las leguminosas las más susceptibles por el efecto detrimental producido en el proceso de nodulación (Kinraide, 1990). Con el porcentaje de saturación de Al mayor (SAl4) las cepas R-113 y R-115 resultaron ser las más tolerantes, con incrementos de aproximadamente 80% y 60% sobre el testigo con cepas nativas, mientras la cepa R-109 resultó ser la más sensible.

A través de los cortes se observó un aumento en la materia seca debido a las condiciones climáticas favorables que prevalecieron en el invernadero durante el transcurso del ensayo, con mejores condiciones de luminosidad y temperatura que implicaron una mayor actividad fotosintética de las plantas y microorganismos, ya que la temperatura incide en la FBN como en las distintas etapas relacionadas con la formación y funcionamiento de los nódulos (Pinilla, 1983).

Respecto al proceso de FBN, en el suelo natural (SAl2) todas las cepas nodularon (Cuadro 2), pero sólo se observaron nódulos efectivos de color rojo en las raíces con cepas nativas (T0) y con R-109, los que probablemente se encontraban fijando N2 por la presencia de leghemoglobina. La inoculación de R-113 y R-115 produjo nódulos blancos, señalando que estarían en una etapa de formación aún joven. La menor saturación de Al en el suelo (SAl1) incrementó la nodulación de las cepas nativas (T0), R-109 y R-113 por el aporte de Ca al Andisol; según Alva et al. (1990) el proceso de nodulación se resiente al descender el contenido de Ca y pH en el suelo; por el contrario, con R-115 el proceso de nodulación disminuyó.

Cuadro 2

Efecto de la inoculación con tres cepas de Rhizobium de colección a un Andisol serie Gorbea con distinta saturación de Al sobre la nodulación de Trifolium repens

*+: nódulos pequeños, redondos, algunos alargados blancos;
++: nódulos pequeños, redondos y algunos alargados rojos;
+++: nódulos grandes, alargados, rojos.

Al aumentar la saturación de Al (SAl3) se inhibió completamente la actividad del microbionte. Wood et al. (1984) en soluciones de concentración de Al igual a 1,3 ppm encontraron toxicidad ya sea en el hospedero como inhibición en la multiplicación y nodulación de Rhizobium. En el tratamiento SAl4 las cepas nativas y R-113 presentaron escasa nodulación. Según antecedentes de la literatura en determinadas circunstancias las cepas nativas resultan ser más eficientes que las de colección, por encontrarse mejor adaptadas a las condiciones edafoclimáticas, lo que incide en el proceso de FBN que resulta más eficiente (Urzúa y Torres, 1985).

En el Andisol, además de los microorganismos FN se encontraban presentes otros microorganismos importantes en el ciclo del P y que también forman asociaciones simbióticas con las leguminosas, los HMA. Tales hongos han demostrado actuar sinérgicamente con los Rhizobium en el proceso de FBN (Azcón et al., 1991). De los parámetros fúngicos medidos como número de esporas HMA en el suelo, la mayor cantidad se aisló desde el tratamiento inoculado con R-113 y con el porcentaje más bajo de saturación de Al (Figura 3C), coincidiendo con el mayor rendimiento alcanzado por T. repens (Figura 3A), mientras que con la menor saturación de Al se inhibió la esporulación en el Andisol inoculado con R-115 que no presentó diferencias significativas con el testigo. Al respecto, Borie et al. (1990) encontraron que leguminosas crecidas en suelos adicionados de P-fertilizante y con una dosis intermedia de CaCO3 la doble simbiosis Rhizobium-HMA funcionó en forma efectiva. El número de esporas fúngicas en el suelo de manera similar a los nódulos de las raíces fueron afectadas por la presencia de Al en el tratamiento SAl3, especialmente con la inoculación de la cepa R-109. Por el contrario, la inoculación con R-113 en SAl4 produjo un notable aumento de esporas HMA con un incremento de un 600% sobre el testigo. El proceso de FBN requiere P, nutriente que es aportado por los HMA, pero la respuesta de la planta dependerá de una combinación particular de cepas de Rhizobium con los hongos, sugiriendo una compatibilidad específica entre hospedero y microorganismos asociados en la simbiosis tripartita (Azcón et al., 1991).

Respecto al otro propágulo fúngico evaluado, la colonización HMA en las raíces de T. repens presentó distinto comportamiento de acuerdo a la cepa de Rhizobium inoculada. La inoculación en el suelo natural (T0) produjo un descenso en la colonización por HMA en las raíces de trébol respecto al testigo, siendo más afectados los tratamientos inoculados con R-113 y R-115, no encontrándose grandes diferencias en el porcentaje de colonización HMA entre SAl1 y SAl2 (Figura 3B). Para los niveles tóxicos de Al, la inoculación con R-113 y R-115 produjo un descenso significativo de la colonización HMA en las raíces del trébol, mientras en SAl4 la cepa R-109 incrementó la colonización en un 20% en relación al testigo. Según Siqueira et al. (1984) bajo condiciones de acidez un aumento en la disponibilidad de Al en la solución del suelo resulta ser un factor primordial de inhibición del desarrollo fúngico. Los beneficios de la simbiosis tripartita bacteria-HMA-leguminosa relacionados con el proceso de nodulación de las BFN y el establecimiento de las micorrizas arbusculares podrían ocurrir simultánea y sinérgicamente; así, mientras los hongos movilizan P desde el suelo las bacterias suministran N no sólo a la planta, sino que también a los HMA (Rabie et al., 2005).

En general, la colonización de las raíces en el tratamiento con baja saturación de Al no presentó diferencias con el suelo original (SAl2) debido a que T. repens es una especie más tolerante a Al que T. pratense. Los propágulos HMA en el suelo con alta saturación de Al se comportaron en forma bastante infectiva pero poco efectiva de acuerdo con los rendimientos alcanzados (Figura 3A) especialmente en SAl4 donde con la inoculación de R-109 se obtuvo la mayor colonización HMA asociada con el más bajo rendimiento. Por el contrario, la inoculación con R-113 resultó efectiva ya que se alcanzó una baja colonización asociada con el mayor rendimiento. El tratamiento SAl1 inoculado con los Rhizobium R-109 y R-115 favoreció la colonización de los HMA nativos. De acuerdo con lo anterior, la diferencia encontrada en los porcentajes de colonización HMA entre las dos cepas R-109 y R-113 muestra que la respuesta del macrobionte dependerá de una combinación particular de cepas de Rhizobium y especies HMA, sugiriendo una cierta compatibilidad específica del hospedero con los microorganismos asociados en la simbiosis tripartita. Estos resultados se ven corroborados por lo informado por Ianson y Linderman (1989) y von Alten et al. (1989) quienes encontraron que la inoculación de cepas de Rhizobium produjeron crecimientos diferentes en el hospedero de acuerdo con distintas combinaciones HMA. Sin embargo, Xavier y Germida (2003) encontraron en lenteja que una asociación Rhizobium-HMA incompatible redujo la eficacia de bacterias efectivas, mientras una compatible mejoró la eficiencia de una cepa inefectiva, lo que también podría ocurrir en otras leguminosas.

Además, en el suelo se determinaron las enzimas fosfatasas relacionadas con la mineralización del P orgánico. En SAl1 la inoculación con la cepa R-113 favoreció los contenidos de enzima que se vieron incrementados en un 80% sobre el testigo. En SAl3 nuevamente se produjo la mayor liberación de enzima, mientras en SAl4 no se encontraron diferencias entre las cepas de colección (Figura 3D). Al respecto, Borie et al. (1998) encontraron en suelos con alta saturación de Al cultivados con trigo que la adición de enmienda aumentó el contenido de enzima en el suelo. En general, los contenidos de fosfatasas resultaron ser menores a los informados por Borie (1981) en Andisoles con lupino, leguminosa no micorrizable; sin embargo, la cuantía de la enzima es diferente entre especies y cultivares dentro de una especie (Borie et al., 1996). Por otra parte, Chong et al. (1987) informaron que el pH de la rizósfera al modificarse por los exudados excretados por las plantas posibilita la nodulación en los suelos ácidos.

Figura 3:

Efecto de la inoculación con tres cepas de Rhizobium de colección en un Andisol serie Gorbea con distinta saturación de Al sobre: A) rendimiento de Trifolium repens, B) colonización por HMA en las raíces, C) número de esporas HMA y D) actividad fosfatásica del suelo.

ANÁLISIS DEL SUELO Y FOLIAR

El análisis químico del suelo muestra que el encalado aumentó el contenido de Ca, bases y CICE, disminuyendo el porcentaje de saturación de Al y el Al intercambiable, mientras que con el mayor nivel de Al se incrementó su saturación (Cuadro 1). Los tratamientos SAl3 y SAl4 movilizaron la menor cantidad de P, produciéndose la mayor movilización con SAl1 señalando un efecto directo de la nutrición fosfatada por efecto de la micorrización. Al respecto, Asimi et al. (1980) encontraron un mayor contenido de P en leguminosas inoculadas con microorganismos asociados a las dos simbiosis. Por otra parte, la absorción y translocación de P y Ca se reduce por la presencia de Al (Andrew et al., 1973).

Los contenidos minerales de los tejidos de T. repens principalmente el P fueron afectados por la toxicidad de Al (Cuadro 3). En el tratamiento SAl3, el contenido de Ca se alteró por la cepa R-109, mientras la inoculación con R-113 no afectó la concentración del nutriente a dosis tóxicas de Al, mostrando una tendencia similar R-115. Finalmente, los contenidos de Mg no fueron afectados ya sea por toxicidad de Al o inoculación con distintas cepas de Rhizobium.

Cuadro 3

Análisis químico de Trifolium repens crecido en un Andisol serie Gorbea con distinta saturación de Al inoculado con tres cepas de Rhizobium de colección

CONCLUSIONES

Niveles de toxicidad por Al afectaron el crecimiento de las doce cepas de colección; así, de los tres Rhizobium previamente seleccionados, la asociación SAl1-Trifolium repens-Rhizobium R-113-HMA nativos presentó la mayor efectividad expresada como sinergismo positivo que incrementó la biomasa foliar del hospedero. En suelos ácidos del tipo Andisol que poseen una baja disponibilidad de P, el rol que cumplen los HMA como suministradores de P en simbiosis tripartita con leguminosas forrajeras sería importante cuando la fijación de N se encuentra restringida por un inadecuado suministro del nutriente.

 

AGRADECIMIENTOS

A Probical Ltda. y al Proyecto Fondecyt 1950842.

 

LITERATURA CITADA

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Fecha de Recepción: 23 Mayo 2007
Fecha de Aceptación: 20 Agosto 2007

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