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Revista de biología marina y oceanografía

versión On-line ISSN 0718-1957

Rev. biol. mar. oceanogr. vol.55 no.1 Valparaíso ago. 2020  Epub 01-Ago-2020

http://dx.doi.org/10.22370/rbmo.2020.55.1.2394 

Nota Científica

Evaluación de la respuesta productiva e inmune en juveniles de camarón Litopenaeus vannamei alimentado con mezclas probióticas

Productive response and circulating haemocytes in juvenile shrimp Litopenaeus vannamei, fed with probiotic mixtures

Angel I. Campa-Córdova1 

Cristóbal Yenni-Morales1 

María A. Guzmán-Murillo1 

Gabriel Aguirre-Guzman2 

1Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, Mar Bermejo No. 195, Col. Playa Palo de Santa Rita, La Paz, BCS, México

2Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Tamaulipas, Km 5 Carr. Victoria-Mante, Ciudad Victoria, Tamaulipas, México

Abstract:

Shrimp diets with mixtures of probiotics (bacilli or yeasts) were evaluated on the production response and immunological effect on juvenile shrimp (Litopenaeus vannamei). The results showed a significant effect in growth, food consumption and feed conversion rate when probiotic diet was used. In addition, experimental diets with yeast mixture [C. insectorum (DH5), D. hansenii (DH6, and L1)] had a significantly higher amount of circulating haemocytes than those with bacilli [B. tequilensis (YC5-2), B. endophyticus (YC3-b) and B. endophyticus (C2-2)]. Shrimp fed both experimental diets (3x107 CFU mL-1) had a significantly higher growth and immune parameters when compared with the commercial diet. Both elements can contribute to the sustainable development and health of shrimp farming.

Key words: Bacillus sp.; haemocytes; probiotics; productive response; shrimp; yeast

Introducción

La acuacultura de camarón se ha expandido significativamente a lo largo de mundo, siendo una industria muy tecnificada hoy en día (Aguirre-Guzman et al. 2009). La intensificación de los sistemas es responsable de un mayor estrés de los organismos, deterioro del medio ambiente y presencia de enfermedades (Balcázar et al. 2007). Esta problemática ha fomentado las investigaciones que permitan lograr un buen crecimiento y salud de los organismos bajo cultivo y generar estrategias amigables con el medio ambiente, tales como el uso de los probióticos. Estos productos son microorganismos vivos empleados como aditivos alimenticios que pueden mejorar la biota microbiana gastrointestinal, digestión, crecimiento, resistencia a enfermedades y mejorar la calidad del agua del cultivo. Los probióticos son empleados en el cultivo de diversas especies de camarón tales como: Fenneropenaeus indicus, Litopenaeus vannamei, Marsupenaeus japonicus y Penaeus monodon, entre otras, debido a que mejoran el crecimiento, sobrevivencia y salud del camarón al favorecer el sistema inmune (Subuntith et al. 2011, Zorriehzahra et al. 2016, Qiu et al. 2018). Además, puede disminuir la tasa de conversión alimenticia gracias a la producción de enzimas digestivas (amilasas, celulasas, fitasas, glicosidasas, lipasas, proteasas) (Reyes-Becerril et al. 2008, Kuan-Fu et al. 2010). Algunos probióticos contienen beta-glucanos, quitina, mano-proteína y ácidos nucleicos que estimulan a los hemocitos, los cuales a su vez fomenta la respuesta inmune en los camarones (Chotikachinda et al. 2008).

Especies como Bacillus cereus, B. licheniformis, B. subtilis y B. natto, Candida sake, C. tropicalis, Debaryomyces hansenii, Rhodotorula rubra, R. glutinis, Rhodosporidium paludigenum, Saccharomyces cerevisiae y S. commune son las más empleadas como probióticos en camarón (Lara-Flores & Aguirre-Guzman 2009, Kuan-Fu et al. 2010, Zhen-Ming et al. 2010, Sukumaran et al. 2010, Subuntith et al. 2011, Yang et al. 2013). El efecto de los probióticos en camarón es un área potencial de investigación que puede generar herramientas para mejorar el desarrollo de esta industria. El presente trabajo evaluó la factibilidad de emplear cepas de bacilos o levaduras como aditivos alimenticios a fin de mejorar los parámetros de producción y sistema inmune de juveniles de L. vannamei.

Materiales y métodos

Mezclas de cepas probióticas

Se utilizaron dos mezclas probióticas, una de bacilos aisladas de hepatopáncreas de camarón L. vannamei [B. tequilensis (YC5-2), B. endophyticus (YC3-b) y B. endophyticus (C2-2)] y una de levaduras [C. insectorum (DH5), D. hansenii (DH6 y L1] (Luis-Villaseñor et al. 2011, Pacheco et al. 2012). Los microorganismos fueron recuperados de crioconservación (-80 °C) y cultivados en placas de TSA+2,5% NaCl a 37 °C por 24 h o PDA a 30 °C por 24 h, dependiendo del caso. Las colonias fueron extraídas del agar, suspendidas en 10 mL de solución salina estéril, 3% NaCl hasta alcanzar una absorbancia de 1,0 a 540 nm, equivalente a 1x109 UFC mL-1 de bacilos (Luis-Villaseñor et al. 2011) y de 1,0 a 600 nm equivalente a 3x107 UFC mL-1 de levaduras (Pacheco et al. 2012).

Dietas experimentales

Para la fabricación de la dieta experimental (DE) se utilizaron los ingredientes señalados en la Tabla 1, los cuales fueron pulverizados (Molinos Pulvex, D.F. México), tamizados (250 µm) y almacenados a 4 °C en bolsas de plásticos selladas dentro de cubetas herméticas. La dieta fue formulada con el programa NutrionMR (Guadalajara, Jalisco, México) y suplementada con metionina, lisina y treonina (Tacon 2002). Una dieta comercial (DC) con 35% proteína (PIASA S.A. de C.V.) fue utilizada como control.

Tabla 1 Composición proximal del alimento utilizado en crecimiento de juveniles de camarón blanco L. vannamei / Proximate composition of the feed used in juvenile growth of white shrimp L. vannamei 

La composición del alimento utilizado para el bioensayo está señalada en la Tabla 1. Los pellets elaborados (2 mm de diámetro) fueron cortados manualmente y secados en una estufa con flujo de aire (37 °C) hasta obtener una humedad aproximada del 10%. La mezcla de bacilos o levaduras fue incorporada a la DE por aspersión (106 UFC mL-1), secando el alimento a 37 °C. La DC y las dietas con bacilos (DB) y levadura (DL) fueron embolsadas por separado, etiquetadas, almacenadas a 4 °C y analizadas para proteína cruda (PC), extracto etéreo (EE), fibra cruda (FC), humedad (H), ceniza (C) y extracto libre de nitrógeno (ELN) (Horwitz & Latimer 2005).

Sistema experimental

Los camarones (L. vannamei) fueron aclimatados durante 15-20 días en tanques de 1.500 L a 29 °C, 35 de salinidad y fueron alimentados ad libitum dos veces al día (10 y 16 h) con alimento comercial (35% proteína). El sistema de cultivo consistió en 12 acuarios de 60-L con malla mosquitero para evitar la fuga de camarones. Cada acuario tenía un calentador sumergible de 200 W para mantener el agua a 28 ± 0,5 °C; suministro de aire (oxígeno disuelto ≥ 5 mg L-1) y agua marina filtrada y expuesta a UV (35 ppm, 5 (m). El fotoperiodo fue de 12:12 h de luz-obscuridad con iluminación de luz blanca de neón (200 W).

Para el bioensayo de 45 días, se utilizaron camarones con un peso inicial promedio de 0,14 ± 0,02 g, colocados aleatoriamente a una densidad de 10 camarones/acuario con tres réplicas (acuarios) por tratamiento (n= 120). Los camarones tuvieron una aclimatación de dos días antes de iniciar el bioensayo. Se les suministró el alimento al 10% de la biomasa ajustando el consumo diariamente hasta presentar un excedente. El alimento fue distribuido en tres raciones al día (09:00, 13:00 y 17:00 h).

Diariamente se eliminaron mudas, camarones muertos y restos de alimento por sifoneo. Se realizó un recambio diario del 60% de agua, las biometrías fueron a los 15, 30 y 45 días de cultivo, pesando cada camarón del acuario en una balanza analítica (0,001 g) después de secarlos cuidadosamente. Se evaluó peso promedio final, tasa de supervivencia (TS= 100 x (número final de camarones) / (número inicial de camarones), consumo aparente de alimento (CAA= alimento proporcionado - alimento residual) y tasa de conversión alimenticia (TCA= total de alimento consumido / peso ganado) (Chotikachinda et al. 2008).

Obtención y conteo total de hemocitos circulantes

Se extrajo la hemolinfa de 6 camarones tomados al azar por tratamiento. Esta fue extraída de la base del pleópodo del primer segmento abdominal con una jeringa (3,0 mL) con 500 µL de solución anticoagulante con 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM EDTA-Na2, 10 mM HEPES, pH 7,3, 850 mOsm kg-1 a 4 °C (Leyva-Madrigal et al. 2011), depositándola en tubos Eppendorf estériles mantenidos en una cama de hielo (Pacheco et al. 2012). Cien microlitros (100 µL) de hemolinfa se mezclaron con 400 µL de solución fijadora (anticoagulante + formaldehido, al 10%) para fijar los hemocitos, observándolos bajo el microscopio y cuantificándolos con una cámara Neubauer como conteo total de hemocitos por mililitro (CTH) (Chotikachinda et al. 2008, Pacheco et al. 2012).

Análisis estadísticos

El peso promedio final, TS, CAA, TCA y CTH fueron normales y homocedásticos por lo cual fueron evaluados utilizando un análisis de varianza ANOVA y una prueba a posteriori de Tukey (Chotikachinda et al. 2008, Pacheco et al. 2012) con STATISTICA versión 6,0 (Statsoft®- TIBCO® Statistica™).

Resultados y discusión

Los parámetros fisicoquímicos del agua poseen una gran relevancia en acuacultivos ya que influyen directamente en los requerimientos, crecimiento, metabolismo y toda actividad fisiológica de los camarones. El comportamiento de los parámetros fisicoquímicos del agua evaluados en la presente investigación (5,44 ± 0,3 a 5,84 ± 0,73 mg L-1 de oxígeno y 28,5 ± 0,2 °C) no presentaron variaciones importantes que generaran condiciones adversas al cultivo, estando dentro de los rangos normales sugeridos para la especie (Martinez 1999).

La dieta comercial (DC) registró 35, 8, 3, 8, 8 y 38% de proteína cruda (PC), extracto etéreo (EE), fibra cruda (FC), humedad (H), ceniza (C) y extracto libre de nitrógeno (ELN), respectivamente, mientras que la DE reveló 37,7; 9,35; 1,13; 7,55 y 44,23% de PC, EE, FC, C y ELN, respectivamente. El análisis proximal inicial de las dietas elaboradas (datos no presentados) no mostró cambios en el contenido nutrimental de las dietas experimentales comparado con la dieta control debido a la aplicación de los probióticos (Bacilos o levaduras).

La calidad nutricional de los ingredientes, aunado a un mejor entendimiento de los requerimientos nutricionales de los organismos, permiten diseñar formulaciones específicas eficientes que mejoran el crecimiento y salud de los organismos bajo cultivo, fomentando a su vez una industria sustentable (Nunes et al. 2014). Los camarones alimentados con la dieta experimental (DE) mostraron una diferencia significativa (P < 0,05) en peso final, CAA y TCA con respecto a aquéllos alimentados con la dieta control (Tabla 2). Esta diferencia puede deberse a la adición de los aminoácidos esenciales y/o una mayor frescura de los ingredientes al momento de fabricar la DE, que pudo fomentar una mejor digestión y absorción de los nutrientes como sugiere Nunes et al. (2014). Cabe señalar que las dietas comerciales buscan una buena relación entre costo/beneficio lo que ocasionalmente afecta su calidad. La tasa de supervivencia (TS) obtenida registró diferencias significativas (P < 0,05) en los juveniles tratados con la DL respecto al grupo DC.

Tabla 2 Parámetros de producción de juveniles de L. vannamei / Production parameters of L. vannamei juveniles 

El peso promedio final (2,7 g) y CAA (2,2 g) de los camarones alimentados con la DC presentó valores significativamente inferiores (P > 0,05) comparadas con DB (4 y 5,9 g) y DL (4,2 y 6,1 g). Los tratamientos DB (83,3) y DL (93,3) mostraron valores más altos de supervivencia total comparados a DC (63,3), sin embargo, solo la DL registró diferencia significativa entre tratamientos (Tabla 2). Resultados similares han sido observados para L. vannamei alimentados con probióticos. Gullian et al. (2004) emplearon cepas probióticas de Bacillus sp. (P64), Vibrio heparinus (P62) y V. alginolyticus (LLi), registrando un incremento significativo en el peso promedio de los camarones con respecto a la dieta control (2,8-3,0 y 2,2 g de peso promedio, respectivamente), así como una mejora en la respuesta inmune de L. vannamei (5,1-5,9 y 4,7 de índice inmune, respectivamente). Shi-Ping et al. (2010) emplearon levadura (Rh. paludigenum) como agente probiótico en L. vannamei, encontrando una mejora significativa en peso final comparado con el control (4,1 y 3,6 g, respectivamente). También observaron una mayor actividad antioxidante e inmunológica de diversos factores presentes en la hemolinfa del camarón.

Los hemocitos generan productos antimicrobianos de importancia para el sistema inmune y llevan a cabo procesos como fagocitosis o actividades de encapsulación que generan cambios en el número total de hemocitos circulantes (Aguirre-Guzman et al. 2009, Zorriehzahra et al. 2016). Es por ello, que el incremento de estas células inmunocompetentes en hemolinfa se asocia a un efecto inmunoestimulante de los aditivos utilizados en el alimento (Zokaeifar et al. 2012). En el presente estudio, el conteo total de hemocitos (CTH) mostró que los camarones tratados con levaduras (DL) fue significativamente superior (P > 0,05) comparado con la dieta comercial (Fig. 1). Investigaciones del sistema inmune de camarones han demostrado que es posible aumentar el CTH y resistencia a patógenos mediante la ingestión de aditivos alimentarios, ya que éstos pueden ser empleados como inmunoestimulantes (Aguirre-Guzman et al. 2012, Bai et al. 2014). Se ha reportado que dietas con cepas vivas de levaduras y sus derivados estimulan el sistema inmune de camarones, elevando el número y actividad de hemocitos al incluir 0,1% de β-glucanos en la dieta (Bai et al. 2014). Pacheco et al. (2012) evaluaron el efecto de tres cepas de D. hansenii sobre la respuesta inmune de L. vannamei, concluyendo que las cepas DH6 y LL1 a una concentración de 1x106 UFC mL-1, aumentaron el CTH, contenido de proteínas y respuesta antioxidante en hemocitos.

Figura 1 Conteo total de hemocitos circulantes en juveniles de camarón L. vannamei alimentados con 4 diferentes dietas. Letras distintas indican diferencias significativas (P < 0,05). DC: Dieta comercial, DE: Dieta experimental sin probióticos, DB: Dieta experimental+Bacilos, DL: Dieta experimental+levadura / Total count of circular hemocytes in juveniles of shrimp L. vannamei fed with four different diets. Different letters indicate significant differences (P < 0.05) 

Algunos trabajos previos recomiendan las mezclas de cepas probióticas, ya que son más efectivas que las cepas independientes, debido a su efecto sinérgico que favorece diferentes procesos que pueden mejorar la producción, crecimiento, salud, y condición inmune de los camarones (Aguirre-Guzman et al. 2009, 2012; Kuan-Fu et al. 2010, Zhen-Ming et al. 2010, Subuntith et al. 2011, Zorriehzahra et al. 2016). Las mezclas probióticas también influencian la actividad en la síntesis de vitaminas o cofactores, mejora la digestión de proteínas y otros ingredientes que fomentan la absorción de nutrientes (Kuan-Fu et al. 2010, Powedchagun et al. 2011). Guillan et al. (2004) señalan que estas cualidades de los probióticos influyen en el bienestar de los organismos, mientras que Guo et al. (2006) y Pascual et al. (2006) señalan que esto mejora la síntesis de la hemocianina que forma parte del sistema inmune del camarón y que se relaciona con la construcción, reparación y mantenimiento de tejidos, siendo además una fuente de energía catabólica.

Este trabajo reveló que la dieta experimental (DE) mejoró peso final, consumo aparente de alimento (CAA) y tasa de supervivencia (TS) respecto a la dieta comercial (DC). La inclusión de levaduras o bacilos (DL o DB) a una concentración de 1x106 UFC mL-1 en el alimento (DE), mejoró peso final, CAA, tasa de supervivencia (TS) y conteo total de hemocitos circulantes (CTH) respecto a la DC en juveniles de L. vannamei. Es necesario realizar más estudios para mejorar el entendimiento sobre la relación de los probióticos con la nutrición y el sistema inmune. Estos dos elementos pueden contribuir substancialmente en el desarrollo sustentable de la camaronicultura.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por el apoyo económico en beca para la realización de este estudio, a SEP-CONACYT( Proyecto #243532) y a Diana Fischer por los servicios editoriales de inglés.

Literatura citada

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Recibido: 19 de Marzo de 2019; Aprobado: 23 de Enero de 2020

*Autor corresponsal: gabaguirre@docentes.uat.edu.mx

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