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Revista de biología marina y oceanografía

versión On-line ISSN 0718-1957

Rev. biol. mar. oceanogr. vol.49 no.3 Valparaíso dic. 2014

http://dx.doi.org/10.4067/S0718-19572014000300016 

 

NOTA CIENTÍFICA

Inhibición de la cepa patogénica de Vibrio cholerae (tor1) por Bacillus pumilus aislados del ambiente marino

Inhibition of pathogenic strain Vibrio cholerae (tor1) by Bacillus pumilus marine environment isolated

 

Yanett Leyton1, Katherine Pohl1 y Carlos Riquelme1

1Laboratorio Mesocosmos Marino, Centro de Bioinnovación de Antofagasta (CBIA), Departamento de Biotecnología, Facultad de Ciencias del Mar y Recursos Biológicos, Universidad de Antofagasta, Angamos 601, Antofagasta, Chile. yanett.leyton@uantof.cl


ABSTRACT

This work evaluated the inhibitory activity of 53 marine bacteria against Vibrio cholerae, a recognized human pathogen. Strains that showed activity were identified by sequencing the 16S rRNA gene and tested for optimal growth at different temperatures. The pathogen was inhibited by 19 strains, which were identified as Bacillus pumilus, optimal growth was at 30 and 37°C. This is the first study that reveals to B. pumilus as a growth inhibitor of the pathogenic strain V. cholerae, which could be evaluated in further studies for potential use as a control of this pathogen.

Key words: Bacillus, Vibrio cholerae, pathogen, inhibition


INTRODUCCIÓN

Vibrio cholerae es un agente etiológico que se encuentra en aguas salobres o marinas, cuyas variaciones climáticas locales de temperatura o aumento en la población del plancton pueden favorecer su proliferación (Ghose 2011). Estas bacterias provocan consecuencias clínicas a nivel internacional al consumir productos marinos contaminados por este patógeno, los síntomas que manifiesta el paciente van desde gastroenteritis, infección de la piel, septicemia, llegando a la mortalidad en el caso de pacientes inmunocomprometidos (Rowe-Magnus et al. 2006). Existen focos importantes en África hace ya 40 años debido al difícil acceso de agua potable y mala cobertura de salud (Mengel 2014). En Haití, luego del terremoto del 2010 se registró la presencia de V. cholerae, después de analizar 301 muestras (Liu et al. 2014). La patogenicidad de esta bacteria para el ser humano ha generado una intensiva investigación clínica y científica en la formulación de estrategias de tratamientos efectivas para prevenir los brotes de esta enfermedad (Ghose 2011).

Por años se ha usado antibióticos como medida de control contra patógenos, a pesar de su efectividad se ha demostrado que su uso permite la selección de bacterias resistentes a los antibióticos (Palmer & Kishony 2013) las cuales proliferan y posteriormente su descendencia es resistente a tratamientos con antibióticos específicos. Una alternativa al uso de antibióticos es el uso de probióticos que son bacterias que presentan capacidad de inhibir el crecimiento de otras bacterias patógenas controlando su proliferación (Pérez-Sánchez et al. 2014). La adición de bacterias vivas y en cantidades adecuadas como alimento o suplemento alimenticio generan un beneficio en el equilibrio biológico intestinal del hospedador (Sihag & Sharma 2012).

A bacterias del género Bacillus se les ha atribuido actividad antibacteriana (Oguntoyinbo 2007). Estas bacterias se encuentran distribuidas ampliamente en ambientes terrestres y acuáticos (Siefert 2000), incluidos los sedimentos marinos (Miranda et al. 2008). Al respecto, Leyton et al. (2012) identificaron a una dicetopiperacina que es un péptido extraído de un Bacillus pumilus marino con actividad inhibidora contra una bacteria del género Vibrio como V. parahaemolyticus que es un patógeno causante de enfermedades gastrointestinales en personas. Igualmente, Yuehua et al. (2013) han reportado otro péptido aislado de Bacillus subtilis quien presentó inhibición contra el patógeno V. parahaemolyticus. A la bacteria Bacillus licheniformis igualmente se le ha reportado actividad contra V. parahaemolyticus (Vinoj et al. 2014). En base a la necesidad que existe por controlar las enfermedades en la industria acuícola y a los antecedentes científicos que comprueban la potencialidad del género Bacillus como productores de antibióticos, este estudio tuvo como objetivo buscar bacterias marinas del género Bacillus inhibidoras del crecimiento del patógeno Vibrio cholerae.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención del patógeno y bacterias antagonistas

La bacteria patógena Vibrio cholerae (Tor 1) y las 53 cepas bacterianas marinas fueron obtenidas del cepario de colección del Laboratorio Mesocosmos Marino, Centro de Bioinnovación de Antofagasta de la Universidad de Antofagasta. Las bacterias fueron aisladas previamente desde cápsulas de huevo de Concholepas concholepas, según lo descrito por Leyton & Riquelme (2010). Las cepas fueron descongeladas y mantenidas en placas con agar de Tripticasa de Soya (TSA, Oxoid) suplementadas al 2% con Cloruro de Sodio (NaCl, Oxoid) e incubadas a 20°C.

 

Selección de bacterias inhibidoras de patógenos

Para cada bacteria se evaluó la actividad antibacteriana mediante el método de `doble capa' Dopazo (Dopazo et al. 1988) modificada según Leyton & Riquelme (2010). En una placa de Agar Mueller-Hinton (M-H) se inoculó 10 µl de un cultivo de 18 h de la cepa de interés crecida en caldo de tripticasa de soya (TSB-Oxoid), suplementados con 2% de NaCl. El inoculo fue incubado por un período de 48 h a 20°C. Una vez verificado el crecimiento bacteriano la macro colonia fue inactivada por exposición a vapores de cloroformo por un período de 45 min. Posteriormente, se utilizaron medios de agar blando de TSB suplementados con 2% NaCl y 0,5% agar bacteriológico (Oxoid) los cuales fueron inoculados con 100 µl de un cultivo de 18 h de la bacteria patógena V. cholerae cultivada en TSB. Luego, el medio se agitó suave y brevemente vertiendo sobre la placa con la macro colonia de la cepa antagonista. Las placas se incubaron a 20ºC durante 24 h. Posteriormente, se verificó inhibición o crecimiento de la cepa patógena alrededor de la cepa antagonista. El bioensayo se realizó por triplicado, y el nivel de actividad antibacteriana se determinó midiendo el diámetro del halo de inhibición, considerando como actividad inhibidora diámetros de halo mayores de 5 mm, según Avendaño-Herrera et al. (2005).

 

Evaluación del crecimiento a diferentes temperaturas

Para cada bacteria antagonista se evaluó por triplicado el crecimiento a diferentes temperaturas (12, 16, 20, 30, 37 y 60°C) para lo cual se inoculó 50 µl de un cultivo de 18 h en tubos de ensayo con 5 ml de medio de cultivo TSB, que fueron incubados durante 48 h. Tras el tiempo de incubación se evaluó cualitativamente el crecimiento bacteriano, según la turbidez del cultivo se usó el siguiente criterio: crecimiento suave (+); crecimiento medio: (++) y crecimiento alto (+++).

 

Identificación bacteriana

De un cultivo estéril de cada bacteria antagonista fue extraído el fragmento 16S ARNr mediante el Kit Genomic DNA Purification (Promega, siguiendo las instrucciones del fabricante), y amplificado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Buffer 5x, MgCl2 25 mM, dNTPs 10 mM, BSA 1X, 1 µm de cada oligonucleótido, y 0,04 U/µl Taq ADN polimerasa (Fermentas), usando los siguientes primers universales: 8F (52-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-32) / 1542R (5`-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3`). El protocolo de PCR se basó en: Buffer 2 µl, MgCl2 1 µl, dmlpr, F, R 0,5 µl para cada uno, taq 0,1 µl, H2O 14,4 µl, ADN 1 µl. La amplificación de los productos se analizó en un termociclador Px2 (Thermo Corporation), las condiciones de PCR fueron 30 min a 35°C, 4 min a 95°C, 30 min 95°C, 30 min 56°C, 1,30 min a 72°C y 1,7 min a 72°C. Los productos amplificados fueron visualizados en gel de agarosa al 1% cargado con 1 µl de muestra y buffer de carga Blue juice 10x y como marcador 100 bp plus. El producto de PCR fue purificado con el kit de purificación (UltraCleanTM15 DNA, MoBio Laboratories, CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuenciación de los fragmentos se realizó en Macrogen Inc. (Corea). Las secuencias fueron analizadas usando el programa Bio Edit y Blast en GenBank1. Los alineamientos fueron realizados con Clustal W (Thompson et al. 1994) y la secuencia fue comparada con aquellas que se encontraron disponibles en la base de datos GenBank.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Estudios científicos comprueban que V. cholerae ha presentado resistencia a antibióticos como lo evaluado por Raytekar et al. (2014) quienes expusieron la resistencia a antibióticos de 28 cepas de V. cholerae O1 aislados desde 544 muestras de pacientes con gastroenteritis aguda de un hospital rural en India. Todos los aislados fueron resistentes a cotrimoxazol, ácido nalidíxico y ampicilina. Sin embargo la sensibilidad máxima se observó a la norfloxacina, gentamicina y cloranfenicol. Estos autores discuten que se requiere una vigilancia continua para V. cholerae en lo que respecta a la aparición de cepas resistentes a antibióticos para investigar las estrategias de gestión adecuadas. El aumento en la frecuencia de brotes de cólera hace convincente el complementar medidas de control, además de las ya existentes. Al respecto, en África, hoy en día una forma de hacer frente a la problemática del cólera, se basa en la aplicación de una vacuna oral contra el cólera, iniciativa apoyada por African Cholera Surveillance Network (Africhol) (Mengel 2014). Los mecanismos de acción de estos antibacterianos, impiden a los patógenos colonizar el tracto digestivo, o al menos reducir su concentración o capacidad de producir toxinas (Hemaiswarya et al. 2013).

Los resultados de esta investigación revelaron que con los análisis de 16S ARNr, se confirmó que la secuencia del gen de todas las cepas bacterianas anti- V. cholerae analizadas pertenecen al género Bacillus, compartiendo un porcentaje de similitud entre el 99 y 100% con la especie Bacillus pumilus. Del total de 53 cepas bacterianas analizadas 19 cepas (36%) inhibieron el crecimiento de V. cholerae, los halos de inhibición variaron entre 11 y 40 mm de diámetro (Fig. 1). Las cepas Bacillus pumilus con mayor actividad inhibidora fueron C31 (35 mm) y C32 (40 mm). Estos resultados de actividad inhibidora representada por los halos, fueron reproducibles y no se observaron diferencias entre las réplicas. Bacterias del género Bacillus marinos como Bacillus sp. fueron importantes agentes antibacterianos contra V. cholerae (halos de inhibición de 12 mm) cuya actividad fue atribuida a proteínas y ácidos grasos de esta bacteria (Sujith et al. 2014). Estos resultados de actividad inhibidora observada contra V. cholerae fueron mucho menor al compararlos con los presentes resultados.

 

Figura 1. Actividad inhibitoria de B. pumilus C42 contra el patógeno V. cholerae
Figure 1. B. pumilus C42 inhibitory activity against the pathogenic V. cholerae

 

Respecto a B. pumilus se ha evidenciado actividad inhibidora contra Vibrio (Murni et al. 2013). Por ejemplo, se ha reportado que B. pumilus inhibió el crecimiento de V. parahaemolyticus (Leyton & Riquelme 2010, 2013; Leyton et al. 2012) cuya actividad inhibidora fue atribuida al péptido dicetopiperacina aislado desde la bacteria (Leyton et al. 2012). Similares resultados fueron revelados por Brack et al. (2014) quienes analizaron al menos 13 dicetopiperazinas (DKPS) secretadas por 2 cepas de B. pumilus quienes presentaron actividad inhibidora contra la bacteria Arthrobacter citreus. Por otro lado, se ha sugerido que el uso de B. subtilis en el cultivo de camarones (Penaeus monodon) mejora su crecimiento y resistencia a patógenos como Vibrios (Nimrat et al. 2013). Los resultados de Ambas et al. (2014) demostraron que B. subtilis (PM3) y Bacillus sp. (PM4) presentaron una fuerte inhibición contra Vibrio mimicus y V. cholerae no-01. Las bacterias del género Bacillus no sólo se han estudiado como antibacterianos, sino que también como probióticos en el área acuícola (Del´Duca et al. 2013), agrícola (Orberá et al. 2014) y clínica (Hanifi et al. 2014), así como actualmente se ha reportado la búsqueda en Bacillus sp. de metabolitos anticancerígenos (Mishra et al. 2014).

La susceptibilidad con la temperatura de las diferentes cepas se clasificó cualitativamente según la densidad del cultivo. Los resultados demostraron que todas las cepas crecieron a las 48 h de cultivo entre los 12 y 37°C, observándose diferentes densidades entre ellas. Y solo las cepas C29; C30; C35; C36 y C51 presentaron crecimiento (+) a los 60°C. El crecimiento óptimo (+++) de todas las cepas bacterianas se observó entre los 30 y 37°C (Tabla 1). Estos resultados coinciden con Ramírez (2000) quien reportó que Bacillus sphaericus tiene un crecimiento entre los 20 y 40°C con un máximo crecimiento a los 37°C. Las bacterias del género Bacillus son muy importantes industrialmente, ya que, producen metabolitos secundarios como antibióticos (Al-Dohail 2011), bioinsecticidas y probióticos (Cutting 2011). Además sus enzimas son muy eficaces en transformar en unidades más pequeñas una gran variedad de hidratos de carbono, lípidos y proteínas. Otra ventaja de este género es que crecen eficientemente en bajas concentraciones de carbono y fuentes de nitrógeno.

 

Tabla 1. Bacterias que presentaron actividad inhibidora contra el patógeno V. cholerae y
su crecimiento a diferentes temperaturas
Table 1. Bacteria that showed inhibitory activity against the pathogen V. cholerae and
its growth at different temperatures

 

Existen pocos estudios sobre Bacillus marinos contra patógenos (Ki et al. 2009). Durante la elaboración de este manuscrito no se encontró investigación que indique a Bacillus marinos como inhibidores del V. cholerae. Por esta razón, los resultados obtenidos en esta investigación representan una contribución científica a futuras investigaciones de antibióticos y quimioterapéuticos obtenidos desde bacterias. En estudios posteriores se puede considerar: aislar e identificar los productos activos; optimizar la producción del cultivo de estas bacterias para obtener mayor concentración de los productos activos para usarlos como una estrategia de control bacteriológico; estudiar y comprender los mecanismos de acción de los antagonistas para un mejor uso de los mismos como biocontrol. Finalmente, los resultados obtenidos en este estudio representan una contribución a la investigación sobre bacterias del género Bacillus productoras de sustancias antibacterianas, demostrando que en el ecosistema marino existen Bacillus marinos con propiedades antibacterianas que inhiben el crecimiento del patógeno V. cholerae que causan grandes problemáticas a nivel clínico.

 

AGRADECIMIENTOS

Esta investigación fue financiada por los proyectos FONDEF: MRO7I1006 y D10I1050.

 

NOTA

1<www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi>

 

LITERATURA CITADA

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Recibido el 5 de noviembre de 2013 y aceptado el 4 de septiembre de 2014
Editor: Claudia Bustos D.

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