Información Tecnológica-Vol. 16 N°6-2005, págs.: 13-19

INDUSTRIA ALIMENTARIA

Método Multiresiduo para determinar Pesticidas en Frutas por Extracción con Fluido Supercrítico

Multiresidue Method for Determination of Pesticides in Fruits using Supercritical Fluid Extraction

S. R. Rissato⁽¹⁾, M. S. Galhiane⁽¹⁾ y M. Gerenutti^(2)
(1)Departamento de Química, Universidade Estadual Paulista (UNESP),
Av. Luiz Edmundo Carrijo Coube s/n, Bauru, Sao Paulo-Brasil (e-mail: srissato@fc.unesp.br)
⁽²⁾Centro de Biología e Saúde, Farmacia e Bioquímica - Universidade de Sorocaba (UNISO),
Av. Dr. Eugênio Salerno, 140, Sorocaba, Sao Paulo-Brasil

Resumen

Se presenta un método rápido y seguro para determinar 25 compuestos seleccionados de cuatro clases de pesticidas, teniendo como muestras: manzanas, uvas, peras y fresas frescas, de supermercados locales. Se describen dos métodos de extracción: extracción sólido-líquido, usando acetona, y extracción con fluido supercrítico. La limpieza de las muestras fue realizada con cartuchos de extracción de aminopropil seguido por análisis de cromatografía de gases acoplada con un equipo de detección de captura de electrones. La confirmación de los pesticidas fue realizada con un detector de espectrometría de masa usando un método selectivo de monitoreo de iones. La recuperación de la mayoría de pesticidas en las muestras fortificadas, a un nivel de 0.04-0.10 mg/kg, fue de 77-96 % para ambos métodos. El método de extracción con fluido supercrítico presentó buen límite de detección (menor que 0.01 mg/kg, dependiendo del pesticida y de la matriz). Basado en los resultados del estudio se concluye que el método de extracción con fluido supercrítico minimizó los daños ambientales, tiempo, y el trabajo de laboratorio.

Abstract

A rapid and reliable method for the determination of 25 compounds selected from four classes of pesticides in samples of fresh apples, grapes, pears, and strawberries purchased at a local supermarket, is presented. The study describes two different methods of extraction: solid-liquid extraction with acetone and supercritical fluid extraction. Clean-up was based on aminopropyl cartridge extraction followed by gas chromatography with an electron capture detector for simultaneous determinations. Confirmatory analysis was carried out by gas chromatography with mass spectrometry in the selected-ion monitoring (SIM) mode. Extraction efficiencies were directly compared and the methods were applied to the analysis of real samples. Recoveries for a majority of pesticides from standard samples at enrichment levels of 0.04-0.10 mg/kg ranged from 77 to 96 % for both methods. The supercritical fluid extraction method showed good limits of detection (less than 0.01 mg/kg, depending on the pesticide and matrix) as well as minimizing environmental concerns, time, and laboratory effort.

Keywords: fruit contamination, pesticide residues, solid-liquid extraction, supercritical fluid

INTRODUCCIÓN

El uso de pesticidas promueve muchos beneficios, aumentando la productividad, disminuyendo los costos, promoviendo una mejor calidad de frutas y vegetales. Su aplicación incorrecta puede dejar residuos dañinos, los cuales pueden ocasionar posibles daños a la salud. Consecuentemente, procedimientos de análisis multiresiduos para frutas y vegetales son descritos por algunas agencias con programas de monitorización (FDA, 1994) los cuales son aceptados oficialmente en muchos países.

Análisis de pesticidas en alimentos, a  niveles de trazas, requieren frecuentemente la remoción de los interferentes de alto peso molecular tales como lípidos y resinas naturales antes del análisis de cromatografía gaseosa o cromatografía líquida (Ahmed, 2001). El proceso de extracción es el primer paso y la mayor barrera en los análisis de residuos de pesticidas, involucrando a veces laboriosos procesos que consumen tiempo y grandes cantidades de solventes tóxicos. En los ultimos años, el análisis de residuos de pesticidas en alimentos ha incorporado nuevas tecnologías para el desarrollo y los procedimientos de rutina, que minimizan daños ambientales, tiempo de trabajo y exposición de técnicos a químicos tóxicos (Ahmed, 2001; Zambonin et al., 2004).

La extracción con fluido supercrítico es una alternativa para los procedimientos de aislamiento intensivo de solvente, especialmente para muestras  ambientales. En el área de pesticidas, la extracción con fluido supercrítico ha sido utilizada para la extracción selectiva de pesticidas organofosforados y organoclorados (Nerín et al.,1998; Ling et al.,1999), carbamatos (Lanças, et al., 1996; Sun y Lee, 2003) y diferentes herbecidas (Reighard y Olesik, 1997) para muestras tales como suelos, sedimentos, tejidos de plantas, y alimentos.

Los métodos de multiresiduos fueron desarrollados primeramente para mejorar costos y beneficios, sin sacrificar la realidad de los resultados. La presencia de interferentes en la matriz de extractos de frutas frescas puede afectar la cuantificación e identificación de los compuestos analizados. La limpieza es necesaria para reducir los límites de detección de los métodos y/o prevenir la interferencia de compuestos de la matriz. La técnica de limpieza de la muestra incluye cromatografía de permeabilidad en gel (Goto et al., 2003), extracción líquido-líquido usando varios solventes (Muccio, 1993) y cromatografía por adsorción (sobre sílica, Florisil, carbono activo, alúmina) y membranas (Štajnbaher y Tupanšiš-KraljE, 2003).

Este estudio describe dos métodos de extracción, uno de ellos, fue sólido-líquido y el otro fue fluido supercrítico para análisis multiresiduos de pesticidas. La limpieza fue realizada con cartuchos de extracción de aminopropil seguido por análisis de cromatografía de gases acoplada con un detector de captura de electrones y la confirmación con un  detector de espectrometría de masa usando un método selectivo de monitoreo de iones. La eficiencia de las extracciones fue comparada y los métodos fueron aplicados en los análisis de muestras reales. La extracción con fluido supercrítico presentó ventajas comparándolo con el otro método utilizado, tales como: reducción del consumo de solvente orgánico, menor tiempo de análisis y extracciones potencialmente más eficientes.

MATERIALES Y MÉTODOS

Las muestras del estudio fueron manzanas, uvas, peras y fresas que se obtuvieron en supermercados locales. Para estudios de fortificación de las muestras fueron usadas matrices totalmente libres de cualquier pesticida. Las frutas fueron procesadas siguiendo el protocolo de la Legislación de la Unión Europea (Council Directives, 2000). Aproximadamente 500 g de fruta fueron lavadas, cortadas y mezcladas durante 3-5 minutos, usando un equipo de mezcla compuesto por acero inoxidable, con jarra de vidrio. En seguida fueron pesados y sometidos a los dos procesos de extracción.

Extracción sólido-líquido

El método de extracción sólido-líquido, utilizado en la determinación de multiresiduos, fue basado en la literatura con algunas modificaciones (Adou et al., 2001). Una porción de 25 g de muestra homogénea fue pesada y fortificada, cuando era necesario, con una solución patrón de pesticida. Después de 15 min., período de equilibrio, 40 g de tierra de diatomea fue adicionada y agitada. La mezcla fue extraída con 80 ml de aceton a por 30 min. bajo agitación constante y filtrada al vacío. El residuo fue lavado con 2 porciones de 30 ml de acetona y las fases extraídas fueron deshidratadas pasándolas por una columna de sulfato de sodio anhidro. El solvente fue concentrado en un rota-evaporador y finalmente la muestra fue secada bajo un flujo de nitrógeno. El residuo fue disuelto en 5 ml de acetona y sometido a limpieza.

Extracción con fluido supercrítico

La extracción con fluido supercrítico fue realizada usando un sistema de extracción SFX-220 (ISCO, Lincoln, NE, USA), el cual tiene un extractor SFX-220, un controlador SFX-200, una bomba jeringa 100 DX, un cilindro de dióxido de carbono sifonado y presurizado hasta la presión de trabajo.

Fueron pesadas, dentro de un recipiente de vidrio de 150 ml, 2 g de manzana, uva, pera y fresa. Cuando era necesario, las muestras fueron fortificadas  con una solución patrón de pesticidas. Después de 15 min. fueron adicionados 6 g de tierra de diatomea y la muestra fue agitada siendo inserida en la celda de extracción de acero inoxidable (5.6 cm. x 1.6 mm.). Para proteger los sellos de la celda fue colocada fibra de vidrio silanizada por encima y debajo de la muestra. Antes de la extracción, siempre que era necesario, un modificador (acetona y metanol) fue adicionado hasta obtener 10% v/v volumen de fluido supercrítico. La extracción fue realizada a una temperatura de 70ºC y a presiones de extracción de 200, 450 y 700 bar, usando un flujo expandido de gas de 1.5 ml/min durante 25 min por CO₂ ó CO₂ modificado con 10% de acetona y metanol. Un tubo capilar de sílica fundida (30 cm. x 100 mm)  fue fijado a la salida del extractor para restringir  el flujo y los pesticidas fueron  colectados directamente en un cartucho de aminopropil a 10 °C.

Limpieza de las muestras

Las muestras se limpiaron con cartuchos de aminopropíl, los cuales fueron fijados a un sistema de vacío y preparados por cargas de sulfato de magnesio hasta un tercio del volumen total del cartucho. El condicionamiento de los cartuchos fue realizado por una  solución de 5 ml de acetato de etilo/n-hexano (50:50 v/v). El extracto fue inserido en el cartucho de aminopropil y porciones de 5 ml de acetona/n-hexano, 80:20, 50:50, y acetato de etila/n-hexano 20:80 fueron adicionados. Una vez que la limpieza fue finalizada los extractos fueron colectados y concentrados por flujo de nitrógeno. El residuo obtenido fue disuelto en 1 ml de acetona y sometido al análisis por cromatografía de gases.

Análisis por cromatografía de gases.

El análisis se realizó con un cromatógrafo gaseoso (Hewlett Packard modelo 5890 Series II) equipado con un detector de captura de electrones y una columna de sílica fundida HP-608 (30 m x 0.25 mm; espesor del filme 0.25 mm). Las condiciones de operación fueron las siguientes: temperatura inicial 45 °C (1 min.), con incremento de 20 °C/min hasta alcanzar 150 °C, permaneciendo 5 min a esta temperatura. Luego se incrementaron 4 °C/min hasta 280 °C durante 20 min. La temperatura del inyector fue de 250 °C, el gas de arrastre fue H₂, la temperatura del detector 300 °C y el volumen de inyección 1 ml.

Los análisis de confirmación fueron realizados en un cromatógrafo gaseoso (Hewlett Packard modelo 5890 Series II) equipado con un detector de masa selectivo (HP 5972) y una columna de sílica fundida LM-5- 5% fenil 95% dimetilpolisiloxano (35 m x 0.25 mm; espesor del filme 0.25 mm). Las condiciones de operación fueron las siguientes: temperatura inicial de 45 °C (1 min.), con incremento de 21 °C/min hasta 150°C, permaneciendo 5 min en esta temperatura, y seguidamente se incremento 4 °C/min hasta 280 °C, durante 30 min.; la temperatura del inyector fue de 250 °C; volumen de inyección 1 ml; gas de arrastre He y línea de transferencia 280 °C. Las condiciones de espectrometría de masa fueron: voltaje de impacto electrónico 70 eV; velocidad de barrido 1.5 scan/s; operado con método selectivo de monitoreo de iones, los cuales están relacionados en la Tabla 1.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El solvente más eficiente para extraer los pesticidas polares y apolares de las muestras de frutas fue la acetona. Además, existen otras ventajas en su utilización tales como baja toxicidad y costo, solubilidad de los compuestos de la matriz, siendo también muy sensilla su evaporación debido el bajo valor de presión de vapor Por otro lado, el alto poder de solubilización de la acetona puede generar co-extractivos que normalmente ocasionan

Tabla 1: Residuo (mg/kg) de pesticidas determinados en muestras reales por extracción sólido-liquido y método extracción con fluido supercrítico
(*cuantificación realizada por la sumatoria de las áreas de los isómeros).

daños a las columnas capilares y además podrían aumentar el efecto de la matriz agregando recuperaciones muy elevadas (mayores que 130 %) (Hajšlová et al., 1998). En este trabajo previamente se verificó este efecto, que fue resuelto por la  introducción de cartuchos de aminopropil, en la etapa de limpieza de la muestra.

El detector de captura de electrones es sensible, selectivo y ofrece buenas respuestas, aunque sea en baja concentración. Es por eso, que fue seleccionado para determinar los pesticidas en las muestras de frutas de este trabajo. Inicialmente, se ajustaron a las condiciones cromatográficas del análisis multiresiduo de diferentes familias de pesticidas. Seguidamente, los cromatogramas de las muestras de frutas fueron comparados con los de la mezcla patrón. Las concentraciones fueron calculadas a partir de las áreas de pico por el método del patrón externo. Los resultados mostraron que los pesticidas y sus isómeros fueron separados en la columna seleccionada. Todas las curvas patrón fueron obtenidas dentro de los límites de aceptación de los criterios de linealidad, con excepción del clorotalonil el cual mostró un inadecuado coeficiente de correlación (r²=0,996).

De los 25 pesticidas estudiados, 19 presentaron recuperaciones en un intervalo de 77-85%, lo cual puede ser considerado satisfactorio para la validez del método. Compuestos como diclorvos, dimetoato y clorotalonil presentaron recuperaciones en el rango de 64-71%, la cual podría ser considerada aceptable. Adicionalmente, algunos compuestos presentaron mejores resultados de recuperación en algunas muestras. Los límites de detección fueron menores que 0.01 mg/kg. para detector de captura de electrones, de acuerdo con la cantidad mínima aceptada por la legislación (Codex, 1993; EEC, 2000). La desviación patrón relativa fue de 5-9 % para todas las muestras estudiadas. Los resultados obtenidos mostraron que este procedimiento es confiable y se pueden aplicar en los análisis de rutina.

Extracción con Fluido Supercrítico

Normalmente, muchos métodos para análisis de pesticidas en frutas requieren un trabajo arduo para la extracción y limpieza de la muestra lo que consume mucho tiempo y gran cantidad de solventes tóxicos (Lehotay, 1997). La extracción con fluido supercrítico se presenta como una alternativa a los métodos de extracción de los pesticidas de las matrices sólidas con los solventes orgánicos.

El exceso de agua en matrices como frutas, forma hielo en la salida del restrictor lo que requiere una trampa con solvente orgánico o agua. En este estudio se utilizó tierra de diatomea para controlar el exceso de agua presente en las muestras de frutas. El estudio de optimización fue conducido por fortificación de las muestras, con el objetivo de determinar las condiciones de extracción que pueden maximizar la recuperación de la extracción con fluido supercrítico.

Los resultados mostraron que la polaridad del CO₂ fue muy baja para extraer los pesticidas investigados, presentando recuperación mas baja que 45%. Para mejorar la eficiencia de la extracción con fluido supercrítico la polaridad de fluido fue modificada con una mezcla de: CO₂  + acetona y  CO₂ + metanol.

Para evaluar este efecto, se realizaron experimentos con muestras fortificadas de los compuestos (1 mg/kg.) y con adición de 10% de los modificadores. Como se esperaba, la adición del modificador influenció en la fuerza iónica del fluido, lo cual fue benéfico para la extracción de la mayoría de los pesticidas. Aunque el efecto del modificador en las muestras naturales no es muy claro, en este caso pesticidas como: clorotalonil, endosulfan, tetradifon, imazalil, clorpirifos, diclorvos y dimetoato tuvieron una máxima recuperación cuando se adicionó la acetona. Por lo tanto, en estas mismas condiciones aldrin, bromopropilato, dicofol, hexaclorobenzeno y diazinon presentaron co-extractivos con recuperación mayor que 130%. Los mejores resultados fueron los obtenidos con CO₂ modificado con 10% de metanol sin presentar co-extractivos.

La presión y la temperatura afecta directamente la selectividad, lo cual es una de la mayores ventajas sobre los solventes utilizados en la extracción sólido-líquido. La presión del fluido de extracción es normalmente de gran importancia en la solubilización de los pesticidas en las muestras (Lehotay, 1997). El control de presión en extracción con fluido supercrítico fue capaz, en una única extracción, de separar varias clases de pesticidas presentes en una misma muestra. Se ha mostrado en la literatura (Nemoto et al., 1997) que el efecto de la densidad del CO₂, fue significativo para extraer 88 pesticidas en celite. En ese trabajo se realizó por medio de ajuste de densidad, la separación en dos grupos: polar y apolar obteniéndose una recuperación de más del 80%.

Debido a la importancia del control de la densidad, en el presente trabajo, los experimentos fueron conducidos con la verificación previa del comportamiento bajo diferentes presiones (200, 450 y 700 bar), usando el 10% de metanol como modificador. La presión de 450 bar presentó mejores resultados que 200 bar y una recuperación mayor que el 81% para todas las muestras estudiadas, un aumento de presión para 700 bar no presentó diferencias estadísticamente significantes en la recuperación. El desvío patrón con rango de 3-9% mostró que la extracción con fluido supercrítico es una buena alternativa para el análisis rutinario de multiresiduo de los 25 pesticidas de diferentes clases estudiados en muestras de frutas (Figura 1).

Aplicación del método desarrollado

Los resultados para la determinación de multiresiduos en  ambos métodos  (extracción sólido-líquido y con fluido supercrítico) están descritos en la Tabla 1.

Los métodos fueron aplicados con éxito en las frutas obtenidas en supermercados locales y los pesticidas encontrados estaban en un límite inferior a los establecidos por la ley.

La confirmación de identidad fue necesaria porque las muestras reales pueden presentar contaminantes endógenos, los cuales pueden tener el mismo tiempo de retención del pesticida estudiado. Para esta confirmación se utilizó espectrometría de masas con método selectivo de monitoreo de iones, como fue descrito en la Tabla 1. Los residuos de fungicidas fueron los más encontrados y esto puede ser explicado por su gran aplicación, después de la recolección, con el objetivo de proteger las frutas. Siendo los más abundantes: clorotalonil (órganohalogenado), tebuconazole, triadimefon y triadimenol (órgano-nitrogenados), en muchos casos excediendo los límites permitidos por la legislación. También se encontraron resultados con sustancias de aplicación ilegal como aldrin en fresas y peras.

Como se puede ver básicamente no se encontró en ninguna de las muestras clorotalonil, dicofol, diclorvos, tebuconazole, triadimefon, y diazinon cuando se utilizó el método sólido-líquido o tal vez los residuos fueron menores que los determinados por extracción con fluido supercrítico. Estas diferencias pueden ser explicadas por las propiedades del fluido supercrítico que resultan en mayor eficiencia de extracción de residuo.

Adicionalmente, la extracción con fluido supercrítico simplifica la etapa de preparación de la muestra para el análisis de multiresiduo de pesticidas, presentando ventajas tales como el uso reducido de solventes orgánicos, menor tiempo de extracción, menor cantidad de muestra, y sus propiedades potencializan la extracción.

CONCLUSIONES

La característica principal de la metodología de análisis multiresiduo de pesticidas (órganohalogenados, órganonitrogenados, órganofosforados y piretroides), usando fluido supercrítico, radica en una reducción significativa del consumo de solvente orgánico, menor tiempo de  análisis, extracciones potencialmente más eficientes y selectivas de muestras de frutas.

La técnica propuesta es fácil de utilizar y es una alternativa a los procedimientos de uso intensivo de solvente, debido especialmente a sus propiedades, las cuales potencializan la extracción.

El método propuesto puede ser incorporado a los análisis de rutina de frutas obtenidas en supermercados locales. Este trabajo contribuye al desarrollo de un método de control de pesticidas.

REFERENCIAS

Adou, K, W.R. Bontoyan y P.J. Sweeney, Multiresidue method for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables by accelerated solvent extraction and capillary gas chromatography, J. Agricultural and Food Chemistry, 49 (9), 4153-4160 (2001).        [ Links ]

Ahmed, F.E., Analysis of pesticides and their metabolites in foods and drinks, Trends in Analytical Chemitry 20 (11), 649-661 (2001).        [ Links ]

FAO, Codex Alimentarius, Pesticide Residues in Food – Maximum Residues Limits, vol. 2, FAO/WHO, Roma, Italia (1996).        [ Links ]

EEC, Council Directive 2000/57/EEC of 29 September 2000 on the fixing of maximum levels for pesticides residues in and on fruit and vegetables. Official Journal of the European Communities L244, 76-77, Bruselas, Bélgica (2000).        [ Links ]

Goto, T., Y. Ito y otros 4 autores, Simple and rapid determination of N-methylcarbamate pesticides in citrus fruits by electrospray ionization tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta 487 (2), 201–209 (2003).        [ Links ]

Hajšlová, J., K. Holadová y otros 5 autores, Matrix-induced effects: a critical point in the gas chromatographic analysis of pesticide residues. J. Chromatography A 800 (2), 283-295 (1998).        [ Links ]

Lanças, F.M., M.S. Galhiane y S.R. Rissato, Off-Line SFE-CZE Analysis of Carbamates Residues in Tobacco Samples, Chromatographia 42 (5-6), 323-328 (1996).        [ Links ]

Lehotay, S.J., Supercritical fluid extraction of pesticides in foods, J. Chromatography A 785 (1-2), 289-312 (1997).        [ Links ]

Ling, Y.-C., H.C- Teng y C. Cartwright, Supercritical fluid extraction and clean-up of organochlorine pesticides in Chinese herbal medicine, J. Chromatography A 835 (1-2),145-157 (1999).        [ Links ]

Muccio, A.D., R. Dommarco y otros 7 autores, Application of solid-phase partition cartridges in the determination of fungicide residues in vegetable samples,  J. Chromatography A 643 (1-2), 363-371. (1993).        [ Links ]

Nemoto, S., K. Sasaki y otros 2 autores, Effect of extraction conditions and modifiers on the supercritical fluid extraction of 88 pesticides, J. Chromatography Science 35 (10), 467-477 (1997).        [ Links ]

Reighard, T.S. y S.V. Olesik, Extraction of Phenoxyacid Herbicides from House Dust Using Methanol/CO₂ Mixtures, Analytical Chemistry 69 (4), 566-574 (1997).        [ Links ]

Štajnbaher, D. y E, L. Zupanšiš-Kralj, Multiresidue method for determination of 90 pesticides in fresh fruits and vegetables using solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry. J. Chromatography A 1015 (1-2), 185-198 (2003).        [ Links ]

Sun, L. y H.K. Lee, Optimization of microwave-assisted extraction and supercriticalfluid extraction of carbamate pesticides in soil by experimental design methodology, J. Chromatography A 1014 (1-2), 165–177 (2003).        [ Links ]

FDA, Pesticide Analytical Manual Vol. 1, Multiresidue Methods, U. S. Food and Drug Administration, FDA, Washington, USA (1994).        [ Links ]

Zambonin, C.G., M. Quinto y otros 2 autores, Solid-phase microextraction - gas chromatography mass spectrometry: A fast and simple screening method for the assessment of organocphosphorus pesticides residues in wine and fruit juices. Food Chemistry 86 (2), 269-274. (2004).        [ Links ]

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