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INTRODUCCIÓN
Los hongos silvestres han sido parte de la dieta humana desde hace varios siglos, debido principalmente a sus características nutricionales y organolépticas1. En Latinoamérica, México y en menor medida Guatemala y Honduras, poseen un arraigado conocimiento micológico y la gran riqueza de especies presentes se ha incorporado en múltiples actividades como la cocina, la medicina tradicional y particularmente en rituales religiosos2. En Chile existe una gran diversidad de hongos comestibles, esto debido al alto grado de endemismo que presentan los bosques nativos, lo que se ve favorecido por las condiciones ambientales y ecológicas predominantes3. En este sentido, desde hace años diversos hongos han sido recolectados como alimento por las comunidades indígenas, donde se destaca la recolección de especies de Cyttaria conocidas comúnmente como “Digüeñes”, “Quireñes” o “Lihueñes”4.
El género Cyttaria Berk., pertenece a la familia Cyttariaceae (División Ascomycota) y es de carácter monotípico. Cuenta con 11 especies conocidas a nivel mundial5, siete procedentes de Sudamérica5,6 y cuatro originarias de Australia y Nueva Zelanda7. En Chile, los digüeñes (Cyttaria spp.) están distribuidos desde la zona centro-sur hasta la Patagonia, siendo todas especies parásitas exclusivas del género Nothofagus donde se incluyen robles, coigües y otros árboles del género8.
Los hongos comestibles generalmente presentan bajo contenido en lípidos (<5% en peso seco), ácidos grasos insaturados (ácido oleico y linoleico, 688-840 mg/g de lípidos en peso seco), carbohidratos digeribles y no digeribles entre un 35 a 70%. Además, generalmente el contenido de proteína cruda de hongos comestibles oscila entre el 15 y el 35% de peso seco, vitamina D (ergosterol y ergocalciferol, 0,6% peso seco) y minerales entre 6 y 11%9,10,11,12. Además, ciertos hongos también son una fuente importante de compuestos que presentan diversas actividades biológicas entre las que se destacan: actividad antioxidante, cardioprotectora, hipotensora, hepatoprotectora, antidiabética, antiviral, inmunomoduladora y antitumoral13. Debido a esto, a nivel mundial se ha intensificado el cultivo y el consumo de este tipo de hongos y sus compuestos bioactivos14.
En esta línea, los hongos tienen un alto contenido de polisacáridos, en particular, los β-glucanos aislados principalmente de la pared celular, los cuales se han descrito como antitumorales, debido a que interfieren tanto en los procesos fisiológicos como en las alteraciones celulares asociadas a cáncer15.
En los últimos años los hongos están siendo evaluados como una potencial fuente de compuestos nutracéuticos, pues al ser considerados un alimento funcional-nutricional, también son fuente de compuestos fisiológicamente beneficiosos sin efectos secundarios negativos para ser humano16. En consecuencia, considerando que el cáncer es la segunda causa de muerte que cobra más de 6 millones de vidas cada año en el mundo17, es necesario prevenir su aparición y es aquí donde los compuestos biológicamente activos provenientes de los hongos cobran gran importancia. En este sentido, se ha demostrado que polisacáridos extraídos del champiñón común (Agaricus bisporus), poseen actividad antitumoral directa contra varios tumores y además previenen la metástasis de éstos, pudiendo evitar la oncogénesis e incrementar su actividad cuando se utiliza en conjunto con la quimioterapia. Por ejemplo, el lentinan un β –glucano de 27,5 kDa aislado de Lentinula edodes (Shiitake), es utilizado en Japón como una medicina anticancerígena, debido a que estimula la secreción de citoquinas por células T, lo que incrementa la generación de linfocitos T citotóxicos y células Natural Killer (NK) en presencia de IL-218. Además, se ha comprobado que la administración de lentinan durante el tratamiento con quimioterapia incrementa la calidad de vida en pacientes con cáncer de estómago, de colon y otros carcinomas en comparación con aquellos pacientes que sólo son tratados con quimioterapia19.
En esta investigación, se determinó la composición proximal de las especies comestibles Cyttaria berteroi Berk. (Figura 1a) y Cyttaria hariotii E. Fisch (Figura 1b) que crecen en Chile y la actividad citotóxica de sus polisacáridos sobre líneas tumorales de cáncer de colon, leucemia y cáncer de mama. Esto con la finalidad de otorgar un nuevo atributo a estas especies que pueda ser utilizado para generar algún producto nutracéutico.
MATERIALES Y MÉTODOS
Recolección de C. hariotii y C. berteroi
El trabajo en terreno se realizó en primavera y verano entre los meses de septiembre y diciembre del año 2018, en localidades geográficas donde se observó una dominancia arbórea de Nothofagus spp., hospederos de estos hongos parásitos comestibles. La especie C. hariotii fue recolectada en el sector Vilches Alto, Región del Maule, Chile, asociada a Nothofagus dombeyi (Mirb.) Oerst. Mientras que la especie C. berteroi fue recolectada en el sector Palos Quemados, Región del Biobío, Chile, asociada a Nothofagus obliqua (Mirb.) Oerst.
Posteriormente, los estromas de Cyttaria spp. recolectados, fueron procesados de acuerdo a la metodología descrita por Marchionatto20. Los estromas fueron seleccionados de acuerdo a su estado de madurez, considerando sólo los ejemplares maduros en la recolección. Los caracteres macroscópicos de los estromas fueron observados y documentados en campo a través de fotografías in situ a color realizadas con una cámara réflex Canon modelo T6 y en laboratorio bajo una lupa estereoscópica.
La determinación taxonómica de los especímenes recolectados, se realizó observando los caracteres microscópicos bajo un microscopio óptico trinocular AmScope modelo T670B sobre secciones de material fresco y/o deshidratado previamente a 45 °C en un deshidratador de alimentos Blanik, montado en agua, KOH al 5%, floxina y reactivo de Melzer, utilizando bibliografía base5,21,22. Las muestras de cada especie se depositaron en el Fungario de ONG Micófilos (MICOCL).
Liofilización de los estromas recolectados
Una vez recolectados los estromas de Cyttaria spp. se rotularon y se almacenaron en un congelador a una temperatura de −20 °C. Luego, las muestras se liofilizaron durante 36 h en un liofilizador automático modelo Lyophilizer Cryodos, Telstar (trampa de frío −60 °C, 1 atm de presión). Posteriormente, las muestras se molieron para disminuir su tamaño de partícula y aumentar su superficie de contacto con una trituradora Moulinex DP800.
Análisis de la composición nutricional
Se realizó un análisis químico-proximal a las muestras liofilizadas, utilizando procesos estandarizados por la Association of Official Analytical Chemist23. Se analizaron parámetros, tales como: humedad (AOAC 927.05/925.09), cenizas (AOAC 923.03), lípidos (AOCS Ce 2b-11), proteínas (AOAC 2001.11/AN300 FOSS), fibra dietaria (AOAC 985.29) y carbohidratos (21CFR1017). El porcentaje de materia seca fue determinado por el método gravimétrico.
Para determinar el contenido de lípidos totales se realizó una extracción continúa con hexano en equipo Soxhlet. La fibra dietaria se determinó mediante la ebullición de la muestra en hidróxido de sodio diluido, ácido clorhídrico diluido, alcohol y éter. Finalmente, la proteína total se determinó a través del método Kjendahl utilizando 6,25 como factor de conversión24.
Extracción de polisacáridos totales
La extracción de polisacáridos se realizó de acuerdo al método descrito por Figueroa et al25 con algunas modificaciones. Se suspendieron 10 g de muestra liofilizada en 300 mL de etanol durante 12 h, para la eliminación de pigmentos. Posteriormente, se centrifugó a 3000 rpm por 3 min y se recolectó el precipitado. Esto se repitió hasta que el precipitado resultó incoloro. Seguidamente el precipitado se re-suspendió en 500 mL de agua destilada, y se calentó hasta llegar al punto de ebullición durante 40-45 min con agitación constante y se dejó reposar durante 1 h para permitir la liberación completa del polisacárido en el agua. Luego se centrifugó a 4500 rpm por 10 min a 4 °C (este proceso de extracción se repitió dos veces). Posteriormente, se extrajo el sobrenadante y para reducir volumen se concentró en rotavapor (IKA HB10 digital, Staufen, Germany) a 120 rpm durante 20 min a 45 °C.
La precipitación de polisacáridos se realizó utilizando etanol absoluto frío en la proporción 3:1 y se mantuvo por 15 min a −20 °C. Una vez pasado ese tiempo se centrifugó a 3000 rpm por 5 min. Finalmente, el precipitado de polisacáridos fue purificado utilizando una solución 4 M de NaCl. Una vez frío, se precipitó con etanol 96% v/v y se centrifugó durante 7 min a 4000 rpm. Posteriormente, los polisacáridos se dializaron a una presión osmótica baja de 1,5 M NaCl durante 4 h con agitación constante, favoreciendo el intercambio iónico. Luego, el contenido se precipitó con etanol al 96% y se centrifugó durante 7 min a 4000 rpm para finalmente ser liofilizados (Lyophilizer Cryodos, Telstar) (trampa de frío −60 °C, 1 atm de presión) durante 24 h y almacenados a 4 °C para su utilización.
Ensayo de citotoxicidad y determinación de la actividad antitumoral
El ensayo de citotoxicidad se realizó de acuerdo a lo descrito por Abdala-Díaz et al26, utilizando las líneas de cáncer de colon (HCT-116), leucemia (U-937) y cáncer de mama (MCF-7). Las líneas tumorales se mantuvieron en el medio DMEM, antibiótico/antimicótico, L-glutamina, suero fetal bovino al 5% e incubado a 37 °C en 5% de CO2.
Cada línea celular se incubó en una placa de 96 pocillos durante 48 h (37 °C, 5% de CO2 en una atmósfera húmeda). Posteriormente, se añadió a cada pocillo un volumen de 10 μL de la solución MTT (5,0 mg mL-1 en solución salina tapada con fosfato) y las placas se incubaron a 37 °C durante 4 h. La sal de tetrazolio MTT amarilla se redujo por la deshidrogenasa mitocondrial de células metabólicamente viables para formar cristales de formazán morados insolubles que se disolvieron mediante la adición de isopropanol-ácido (150 μL de 0,04 N HCl-2 propanol) y se midieron espectrofotométricamente a 550 nm (MicroPlate Reader 2001, Whittaker Bioproducts, EE. UU.). La citotoxicidad anticancerígena de las muestras de C. berteroi y C. hariotii se realizó mediante el recuento de las células viables en comparación con las células no tratadas. Adicionalmente, se determinó la concentración mínima inhibitoria (IC50), de ambos extractos (muestras), definida como la concentración a la cual los polisacáridos (C. berteroi y C. hariotii) reducen el número de células viables al 50%. Las determinaciones se llevaron a cabo por triplicado en experimentos independientes.
Análisis estadístico
Todos los resultados fueron expresados como media ± desviación estándar de tres experimentos (n= 3). Para comparar las diferencias de cada tratamiento de citotoxicidad se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía. Seguida de una prueba post-hoc HSD de Tukey para la comparación entre las medias de cada tratamiento. Se consideraron diferencias significativas cuando p<0,0527. Los análisis se realizaron utilizando el programa SPSS 15.0 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA).
RESULTADOS
Composición nutricional de Cyttaria spp
La tabla 1 muestra las propiedades químico-nutricionales que aportan las especies de C. berteroi y C. hariotii en base a % en peso seco. Se puede observar que el contenido de proteínas es mayor en la muestra de C. berteroi, llegando a ser hasta cuatro veces mayor que en la especie C. hariotti. Adicionalmente, se observa que un 85,3% de la biomasa de C. hariotii corresponde a carbohidratos, un 23,6% más que lo reportado en C. berteroi.
Tabla 1 Composición proximal de las especies de C. berteroi y C. hariotii en % de humedad, cenizas, lípidos, proteína, fibra e hidratos de carbono (n= 3).
| Especie | % Humedad | % Cenizas | % Lípidos | % Proteína | % Fibra | % HC |
|---|---|---|---|---|---|---|
| C. berteroi | 8,70 ± 0,001 | 4,40 ± 0,100 | 2,40 ± 0,300 | 19,1 ± 0,002 | 3,80 ± 0,600 | 61,7 |
| C. hariotii | 4,50 ± 0,100 | 2,00 ± 0,100 | 1,20 ± 0,100 | 4,10 ± 0,010 | 2,90 ± 0,300 | 85,3 |
*Valores expresados en porcentaje de peso seco.
Efecto citotóxico de polisacáridos aislados de Cyttaria spp. en líneas tumorales
Los polisacáridos crudos extraídos desde C. berteroi y C. hariotii exhiben un efecto dosis-respuesta en la supervivencia celular de las líneas tumorales HCT-116, U-937 y MCF-7 (Figuras 2, 3, 4).
Figura 2 Efecto de los polisacáridos crudos extraídos de C. hariotii y C. berteroi expresados en porcentaje de supervivencia ± desviación estándar en la línea celular de cáncer de colon (HCT-116). IC50 C. hariotii: 3700 µg/mL; IC50 C. berteroi: 9270 µg/mL.
Figura 3 Efecto de los polisacáridos crudos extraídos de C. hariotii y C. berteroi expresados como porcentaje de supervivencia ± desviación estándar en la línea celular de leucemia (U-937). IC50 C. hariotii: 2100 µg/mL; IC50 C. berteroi: > 10000 µg/mL.
Figura 4 Efecto de los polisacáridos crudos extraídos de C. hariotii y C. berteroi expresados en porcentaje de supervivencia ± desviación estándar en la línea celular de cáncer de mama (MCF-7). IC50 C. hariotii: 9470 µg/mL; IC50 C. berteroi: > 10000 µg/mL.
Se determinó que los polisacáridos crudos de C. hariotii, inhiben significativamente (p<0,05) la proliferación celular de las líneas de cáncer de colon, leucemia y cáncer de mama, reportándose un IC50 de 3700 µg/mL, 2100 µg/mL y 9470 µg/mL respectivamente. De igual manera, al someter las líneas de cáncer de colon, leucemia y cáncer de mama a concentraciones crecientes de polisacáridos crudos extraídos de C. berteroi se evidenciaron diferencias significativas (p<0,05) en la proliferación celular de estas líneas tumorales, reportándose un IC50 de 9270 µg/mL para la línea HCT-116, mientras que, para las líneas celulares de leucemia y cáncer de mama, se reportaron valores de IC50 >10000 µg/mL.
DISCUSIÓN
Los hongos silvestres comestibles tienen un alto valor económico y gastronómico, debido a sus propiedades nutricionales y medicinales. Son considerados alimentos funcionales, ya que además de sus propiedades nutricionales, han demostrado tener efectos benéficos para la salud humana que pueden ser utilizados para prevenir o tratar diversas enfermedades degenerativas28. Por lo anterior, se hace necesario conocer la composición químico-nutricional de los hongos comestibles, en especial, de aquellos que son nativos de nuestro país y cuya información puede ser muy útil para la población, así como para promover su conservación.
El valor nutricional de los hongos comestibles se debe a su alto contenido en proteínas, fibra dietaria, vitaminas, minerales y bajos niveles de lípidos totales. En esta investigación, se determinó la composición nutricional que tienen dos especies de Cyttaria en base a % en peso seco mediante un análisis proximal. Las especies C. berteroi y C. hariotii, presentan diferencias en el contenido de proteínas, evidenciándose un valor medio de 19,1% en peso seco mayor para C. berteroi y un valor medio de proteínas igual a 4,1% en peso seco en C. hariotii, llegando a ser casi cuatro veces mayor en C. berteroi. Estos resultados coinciden con lo reportado por Schmeda-Hirshmann et al29, donde reportaron valores similares en el contenido de proteínas presentes en especies recolectadas en la Región del Maule, con un valor promedio de 12,6% en peso seco para C. berteroi y 7,5% en peso seco para C. hariotii, respectivamente. Asimismo, Toledo et al30 reportaron 3,3% de proteínas al analizar muestras de C. hariotii provenientes de la Patagonia, mientras que Inzunza31 obtuvo un porcentaje de proteínas igual a un 13% para C. hariotii, analizando muestras provenientes de la Región del Ñuble.
De acuerdo con la literatura, las proteínas y carbohidratos son los dos principales componentes presentes en los hongos comestibles32, siendo estos dos parámetros donde se observaron mayores diferencias entre C. berteroi y C. hariotii. En este contexto, el contenido de proteína cruda de hongos comestibles puede cambiar dependiendo de la especie, variedades y etapa de desarrollo del cuerpo fructífero33,34. Sin embargo, de acuerdo a la FAO, la calidad de estas proteínas es mejor que la mayoría de las proteínas vegetales, pues proveen aminoácidos esenciales convirtiéndose en una buena fuente de nutrición para el ser humano, particularmente, para quienes no consumen carne en su dieta35,36. Bajo estas condiciones, C. berteroi presentó un alto contenido de proteínas, lo que se traduce en un mejor aporte nutricional frente a C. hariotii.
Por otra parte, si bien las muestras de C. hariotii presentaron un menor contenido de lípidos y no fueron tan ricas en proteínas (1,2% y 4,1% en peso seco en promedio), comparadas con la especie C. berteroi, éstas presentaron un mayor contenido de carbohidratos. Los carbohidratos, se encuentran en altas proporciones en hongos comestibles y contienen fibra, β-glucanos, hemicelulosas y otras sustancias, tales como algunos azúcares37, siendo la glucosa el mocosacárido más común detectado en ambas especies, pero mayormente en C. hariotii, especie utilizada por el pueblo mapuche y otros pueblos originarios para preparar un brebaje alcohólico conocido como “chicha” en el sur de Chile7.
Dentro de las propiedades medicinales de los hongos, se destacan sus propiedades anticancerígenas, representadas por diversos principios activos, tales como: lectinas, β-glucanos, ergosteroles y argininas, que actúan en la estimulación del sistema inmunológico, antiproliferación y daño celular38. Dentro de los resultados obtenidos en este estudio, se destaca la acción de los polisacáridos crudos obtenidos de la especie C. hariotii, mostrando un efecto citotóxico sobre cáncer de colon y leucemia al ser tratados con un IC50 de 3700 µg/mL y 2100 µg/mL, respectivamente. Por otro lado, los polisacáridos de C. berteroi tuvieron un efecto citotóxico menos potente sobre las células de las líneas tumorales de leucemia y cáncer de mama, a diferencia de lo observado contra cáncer de colon donde se necesitó un IC50 de 9270 µg/mL para disminuir la viabilidad celular.
De las dos especies de Cyttaria estudiadas, los polisacáridos de C. hariotii mostraron los resultados más promisorios. El mejor efecto citotóxico de C. hariotii se observó sobre la línea celular de leucemia (U-937), lo que coincide con lo expuesto por Schmeda-Hirshmann et al39 quienes utilizando extractos hidrosolubles de cuatro especies de Cyttaria evaluaron su efecto inmunomodulador en ratones con linfoma L5178Y, en los cuales sólo C. hariotii fue capaz de modificar la respuesta inmune. En base a estos resultados, es recomendable realizar estudios con otras líneas celulares que permitan conocer el potencial medicinal de nuestros hongos silvestres comestibles.
Los resultados obtenidos en este estudio constituyen una aproximación a los posibles usos alimenticios y/o nutracéuticos de las especies de Cyttaria más consumidas distribuidas a lo largo de Chile y ha permitido conocer cuáles de estas especies presentan mayor potencial nutricional y medicinal. Es preciso estudiar en profundidad las especies que tuvieron mayor bioactividad, buscar formas de cultivarlas en laboratorio y trabajar en la búsqueda de nuevas soluciones en beneficio de la salud humana.
CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados obtenidos en este estudio, se sugiere que C. berteroi presenta un alto contenido de proteínas y lípidos en comparación con C. hariotii. Además, los polisacáridos extraídos de C. hariotii y C. berteroi presentan una actividad citotóxica diferenciada en líneas tumorales de leucemia, cáncer colon y mama. Destacándose, una fuerte actividad citotóxica de los polisacáridos de C. hariotii sobre la línea celular de leucemia humana (U-937), con un IC50 igual a 2100 µg/mL. Por lo tanto, estos polisacáridos podrían utilizarse como un potencial producto nutracéutico. Sin embargo, investigaciones futuras deben ser orientadas a dilucidar la estructura y conformación química de los polisacáridos responsables de esta actividad biológica. Por otra parte, es necesario realizar más estudios sobre el género Cyttaria en Chile, realizando una caracterización químico-nutricional de todas las especies y la evaluación de sus componentes biológicamente activos.
