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Revista chilena de nutrición

On-line version ISSN 0717-7518

Rev. chil. nutr. vol.44 no.2 Santiago  2017

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-75182017000200005 

ARTICULOS ORIGINALES

 

Fraccionamiento y caracterización electroforética de las proteínas de la semilla de kañihua (Chenopodium pallidicaule Aellen)

Fractionation and electrophoretic characterization of (Chenopodium pallidicaule Aellen) kanihua seed proteins

 

Gladys Moscoso-Mujica1, Amparo Zavaleta1, Ángel Mujica2, Marco Santos1, Robert Calixto1.

1. Laboratorio de Biología Molecular -Facultad de Farmacia y Bioquímica - Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima 1 - Perú.
2. Escuela de Postgrado, Universidad Nacional del Altiplano, Puno - Perú.
Dirigir la correspondencia a: Gladys Moscoso-Mujica. Laboratorio de Biología Molecular - Facultad de Farmacia y Bioquímica - Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Jr. Puno 1002. Lima 1, Perú.
Tel: +51 3281811.
E-mail: gladysmoscoso03@gmail.com


ABSTRACT

Kanihua (Chenopodium pallidicaule Aellen) is a Chenopodiacea of the andean region, that contains between 15 and 19% protein, with essential amino acids. The objective of the study was to fractionate and electrophoretically characterize the proteins of kanihua seed varieties Cupi-Sayhua and Ramis. In the whole meal, the proximal analysis and fractionation were performed, and the flour was fractionated by five techniques according to Osborne solubility to obtain albumins, globulins, prolamins andglutelins. The methodology, solvents and extraction time were optimized; and the electrophoretic profiles of the fractions were identified. The highest protein content (p 0.05) was of kanihua flour and its protein fractions, compared to kiwicha and wheat. The highest percent yield (p 0.05) during 1 h of sequential extraction of the protein fractions, was obtained with the Rodriguez y et.al., technique for albumins and glutelins, and with the technique described by Barba de la Rosa y et.al., for globulins and prolamins. The following results were foundin Ramis and Cupi-Sayhua kanihua: albumins: 15.4±0.3 and 15.8±0.3%, globulins 7S: 24.1±0.5 and 26.3±1.0%, globulins 11S: 25.7±1.0 and 26.7±1.0%, prolamins: 9.6±0.1 and 9.9±0.5% and glutelins: 22.9±0.1 and 21.5±1.4%, respectively The electrophoretic profile showedpatterns similar in number of bands and differences in concentration in both varieties.

Key words: Fractionation; electrophoresis; proteins; Che-nopodium pallidicaule Aellen.


RESUMEN

La kañihua (Chenopodium pallidicaule Aellen) es una Chenopodiacea de la región andina, que contiene entre 15 y 19% de proteínas, con aminoácidos esenciales. El objetivo del presente estudio fue fraccionar y caracterizar electroforéticamente las proteínas de la semilla de kañihua variedades Ramis y Cupi-Sayhua. En harina integral se realizó el análisis proximal y fraccionamiento, luego, la harina se fraccionó mediante cinco técnicas según la solubilidad de Osborne para obtener albuminas, globulinas, prolaminas y glutelinas. Se optimizó la metodología, solventes y tiempo de extracción; e identificaron los perfiles electroforéticos de las fracciones. El mayor contenido proteínico (p 0,05) fue de la harina de kañihua y sus fracciones proteicas, en comparación a kiwicha y trigo. El mayor rendimiento porcentual (p 0,05) durante 1 h de extracción secuencial de las fracciones proteicas, se obtuvo con la técnica de Rodríguez y et.al., para albuminas y glutelinas, y con la técnica de Barba de la Rosa y et.al., para globulinas y prolaminas. Se encontró en kañihua Ramis y Cupi-Sayhua, albúminas: 15,4±0,3 y 15,8+0,3%; globulinas: 7S 24,1±0,5 y 26,3+1,0%; globulinas 11S: 25,7+1,0 y 26,7+1,0%; prolaminas: 9,6+0,1 y 9,9+0,5% y glutelinas: 22,9+0,1 y 21,5+1,4%, respectivamente. El perfil electroforético mostró patrones similares en número de bandas y diferentes en concentración en ambas variedades.

Palabras clave: Fraccionamiento; electroforesis; proteínas; Chenopodium pallidicaule Aellen.


 

INTRODUCCIÓN

La kañiwa (Chenopodium pallidicaule Aellen) se cultiva en los andes entre Perú y Bolivia, y forma parte de la dieta del poblador andino desde épocas incaicas, conteniendo mayor cantidad de proteínas que el trigo, el centeno, la cebada, el arroz y el maíz1. Es un vegetal C4 con una modalidad fotosintética de alta eficiencia en el aprovechamiento de la radiación solar y de la fijación del dióxido de carbono presente en la atmósfera, lo cual le confiere una gran adaptabilidad a distintas condiciones ambientales, como tolerancia a sequías, fuertes vientos, heladas, crecimiento rápido entre 3.000 y 4.200 m de altitud y en suelos arcillosos-salinos2-6.

La kañihua es una dicotiledónea que pertenece al género Chenopodium, contiene proteínas (entre 15 y 19%) y aminoácidos esenciales como lisina (5,0 a 6,3%), metionina (1,4 a 3,0%), treonina (4,4 a 4,7%) y triptófano (0,7 a 0,9%P. Es una buena fuente de aminoácidos esenciales, aproximándose a los valores recomendados por la FAO/WHO/UNU9. Además, posee vitaminas, minerales, polisacáridos y azúcares libres en pequeñas cantidades, alto contenido de fibra insoluble, lípidos con omega 3, 6 y 9; y saponinas que no presentan el sabor amargo a diferencia de otros granos andinos como la quinua y el tarwi10,11.

En diversas investigaciones se han encontrado compuestos y moléculas como proteínas de cereales, leguminosas, granos andinos, verduras, frutas y otros alimentos naturales, con propiedades de retrasar la progresión de enfermedades, inhibir los mecanismos fisiopatológicos o suprimir las actividades de patógenos, entre otros12,13. Por lo tanto, el rol que desempeñan las proteínas como componentes fisiológicamente activos se está reconociendo cada vez más en los últimos años, principalmente porque proporcionan una fuente de péptidos biológicamente activos14.

La kañihua se caracteriza por su contenido proteínico de elevada calidad y cantidad nutricional. Sin embargo, el valor nutricional de este grano no ha sido estudiado exhaustivamente7,8,13. Además, en la búsqueda de proteínas como fuentes de péptidos bioactivos, los estudios se han centrado en las proteínas del trigo, soya, kiwicha (Amaranthus), quinua, pero pocos en kañihua12-21, utilizando principalmente concentrados proteicos2,13,15: y ninguna investigación emplean fracciones proteicas.

La kañihua presenta diversas proteínas que se pueden separar con base en su solubilidad según el criterio de Osborne, por ejemplo, las albuminas son solubles en agua, las globulinas en soluciones salinas diluidas, las prolaminas en soluciones alcohólicas, y las glutelinas en soluciones ácidas o alcalinas22. Las diferentes proteínas presentan elevado contenido proteínico y son fuentes potenciales de péptidos bioactivos con propiedades funcionales y nutracéuticas12-15. El objetivo de esta investigación fue obtener el fraccionamiento y caracterización electroforética de las proteínas de la semilla de kañihua de las variedades Ramis y Cupi-Sayhua, a través de la evaluación de cinco técnicas de fraccionamiento proteico, según la solubilidad de Osborne, considerando solventes, metodologías y tiempo de extracción, para obtener fracciones proteicas con mayores contenidos proteínicos y rendimientos porcentuales, que incentiven a investigaciones posteriores a desarrollar nutracéuticos ricos en péptidos bioactivos.

MATERIAL Y MÉTODOS

Preparación de harina

Los granos de Chenopodium pallidicaule Aellen variedad Ramis y Cupi-Sayhua se obtuvieron de la Universidad Nacional del Altiplano, Puno, Perú. Los granos se limpiaron y molieron en el molino estacionario Thomas Willey (Arthur H. Thomas Company, USA), luego se tamizaron para obtener partículas de 0,250 mm. La harina integral fue deslipidizada con n-hexano en proporción 1:10 (p/v)18 con agitación a 4 °C durante 24 h23, luego se secó a temperatura ambiente por 24 h, se tamizó y conservó en frascos ámbar a 4 °C.

Composición proximal

La composición proximal de la harina integral y deslipidizada fue determinada de acuerdo a los procedimientos oficiales, descritos en AOAC24. La humedad (método 934.01) se determinó con base a la diferencia de peso al ser secada en horno a 110 °C durante 2 h. El nitrógeno (978.04) según el sistema de Kjeldahl. La proteína fue calculada del nitrógeno total usando el factor de 5,87 reportado para kiwicha18,20.

Las cenizas (930.05) se calcularon por peso de la muestra después de calentar a 550 °C durante 2 h. La grasa (930.09) fue obtenida por extracción con éter de petróleo durante 4 h en el sistema Soxhlet. La fibra (934.10) se determinó por digestión con soluciones de ácido sulfúrico e hidróxido de sodio y calcinación. Los carbohidratos y el balance energético se determinaron por cálculo24,25. Estos análisis fueron realizados en el Centro de Control Analítico-UNMSM, Lima, Perú.

Obtención de fracciones proteicas

Se evaluó cinco técnicas de fraccionamiento proteínico según la solubilidad de Osborne reportados para el grano de kiwicha, difiriendo cada una en la metodología, solventes y tiempo de extracción. Todas las extracciones fueron secuenciales. Se empezó por las albuminas, seguida de las globulinas, luego las prolaminas y finalmente las glutelinas. Sólo en la fracción de las albuminas se pesó la harina y se mezcló con el solvente según la técnica, posteriormente se homogenizó con agitación constante durante el tiempo de mayor rendimiento, se prosiguió con la centrifugación a 9.000 x g por 20 min a 4 °C en una centrifuga refrigerada Eppendorf 5810R (EPPENDORF, USA) y los sobrenadantes que contenían la fracción proteica se liofilizaron en un equipo Labconco 2,5 (LABCONCO, Alemania) para los análisis subsecuentes, y los precipitados sirvieron para obtener la siguiente fracción de manera secuencial considerando las mismas condiciones de tiempo de extracción, centrifugación y liofilización. Las técnicas utilizadas fueron: 1) Maldonado-Cervantes y et.al26; 2) Barba de la Rosa y et.al.27; 3) Rodríguez y et.al28; 4) Soriano-Santos y et.al20; y 5) Barba de la Rosa y et.al18.

1. Albuminas. La harina fue resuspendida en agua bi-destilada en proporción 1:10 (p/v) para las técnicas de Maldonado-Cervantes y et.al26, Barba de la Rosa y et.al27, Rodríguez y et.al28 y Barba de la Rosa y et.al18, y para la técnica de Soriano-Santos y et.al20, el solvente fue NaCl al 10% en proporción 1:20 (p/v). Una vez obtenido el sobrenadante conteniendo las albuminas más nitrógeno no-proteico (albuminas + NNP), para el caso de Rodríguez y et.al28, se ajustó el pH a 3 con HCl 2N para precipitar las albuminas. De acuerdo con Soriano-Santos y et.al20, las proteínas del sobrenadante se precipitaron con (NH4)2SO4 a los porcentajes de saturación de 50, 70 y 100%, y luego fueron dializadas por 24 h para obtener las albuminas.

2. Globulinas. El precipitado obtenido en el paso anterior fue resuspendido en diferentes solventes en proporción de 1:10 (p/v). Según la técnica de Maldonado-Cervantes y et.al26 se obtuvo dos tipos, las globulinas 7S (con el tampón K2HPO4 10 mM (pH 7,5), NaCl 0,1 M, EDTA 1mM), y globulinas 11S (con el tampón K2HPO4 10 mM (pH 7,5), NaCl 0,8 M, EDTA 1mM). De acuerdo a Barba de la Rosa y et.al27 se empleó, a) Na2HPO4 0,1 M (pH 7); b) Na2HPO4 0,1 M (pH 7) (NH4)2SO4 5 % (pH 7); c) NaCl 0,8 M; d) Na2HPO4 0,1 M (pH 7), (NH4)2SO4 5% y NaCl 0,8 M. Para el caso de la técnica de Rodríguez y et.al28 se utilizó Na 2HPO4 0,1 M (pH 7,5) ajustando el pH a 3 con HCl 2N. Según a la técnica de Barba de la Rosa y et.al18 se obtuvo dos tipos, las globulinas 7S con Na2HPO4 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, NaCl 0,1 M, y globulinas 11S con Na2HPO4 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM y NaCl 0,8 M.

3. Prolaminas. De acuerdo a las técnicas de Barba de la Rosa y et.al27, Rodríguez y et.al28 y Barba de la Rosa y et.al18 se obtuvo el precipitado de las globulinas el que fue resuspendido en 2-propanol 70% en la proporción de 1:10 (p/v).

4. Glutelinas. Se resuspendió el precipitado de las globulinas 11S según la técnica de Maldonado-Cervantes y et.al26, y el precipitado de las prolaminas en las demás técnicas, en la proporción de 1:10 (p/v). De acuerdo a Maldonado-Cervantes y et.al26 y Rodríguez y et.al28 se usó NaOH 0,1 M. Según la técnica de Barba de la Rosa y et.al27 se empleó, a) NaOH 0,1 M, b) EDTA 1 mM, c) Na 2HPO4 0,1 M (pH 7), d) HCl 0,1 M. Para el caso de la técnica de Barba de la Rosa y et.al18 se usó Na2HPO4 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM y NaOH 0,1 mM.

Tiempo de extracción

Con las técnicas que se obtengan mayores rendimientos porcentuales de extracción de las fracciones proteicas, se evaluó el mejor tiempo de extracción secuencial de fracciones proteicas de kañihua Ramis y Cupi-Sayhua a 4 °C y agitación constante. Se empleó 1 h para extraer albuminas, 1 h para globulinas 7S, 1 h para globulinas 11S, 1 h para prolaminas, y 1 h para glutelinas. De la misma manera se prosiguió con 2, 4 y 8 h. Elegido el tiempo óptimo de la extracción, este se empleó para la obtención de todas las fracciones proteicas secuenciales.

Determinación del contenido proteico

El contenido de proteínas solubles en cada fracción, se determinó por el método descrito por Bradford29, y se utilizó como patrón albúmina sérica de bovino.

Electroforesis

Las proteínas de las diversas fracciones se diferenciaron por geles de poliacrilamida al 10% en presencia de dodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE) de acuerdo al método de Laemmli30, usando el equipo Mini Omni PAGE (Cleaver, USA) a 90 y 100 V para los geles de concentración y separación, respectivamente. Luego, se tiñeron con azul brillante de Coomassie R-250. Los pesos moleculares se determinaron usando los marcadores de peso molecular (MP) Broad range (6,5 a 200 kDa) y Dual color (10 a 250 kDa) (BIO-RAD).

Rendimiento en la obtención de las fracciones proteínicas 

Para el cálculo del rendimiento de extracción de las fracciones proteínicas de kañihua Ramis y Cupi-Sayhua, se tomó como referencia el contenido de la proteína en la harina determinada en el análisis proximal (proteína cruda), de acuerdo a la formula reportada por Gomez31.

Análisis estadístico

El análisis fue realizado utilizando el programa estadístico STATA versión 11,0 (Stata Corp LP, College Station, Texas). Para el análisis diferencial de medias se utilizó chi cuadrado y ANOVA con pruebas post-hoc. Se consideró un intervalo de confianza al 95% y a todo valor de p 0,05 como estadísticamente significativo. Todos los análisis fueron realizados por triplicado, se expresaron como la media (p) ± error estándar de la muestra (SEM).

RESULTADOS

Análisis proximal

Los contenidos proteínicos de la harina integral de kañihua Ramis y Cupi-Sayhua fueron 16,2±0,1 y 18,7±0,1%, respectivamente, valores mayores en comparación al grano andino kiwicha y cereal trigo. Se observó incremento del contenido proteínico en la harina deslipidizada en aproximadamente un 10%. Además, destacó la proporción de grasa de kañihua y kiwicha en comparación al trigo (Tabla 1).

 

TABLA 1

Composición proximal de la harina integral de kañihua (Chenopodium pallidicaule Aellen)
de las variedades Ramis y Cupi-Sayhua en comparación a otros granos.

Datos expresados en base seca. . Harinas: Integral (I), Deslipidizada (D). ELN
(Extracto Libre de Nitrógeno). *Fuente: Mujica y
Chura7, Repo-Carrasco8, Hernández-Ledesma12.

 

Fracciones proteicas

El contenido proteínico de la harina integral de kañihua fue mayor en la variedad Cupi-Sayhua, siendo la fracción con mayor contenido proteínico las albuminas + NNP, seguida de las globulinas, glutelinas, y finalmente las prolaminas (Tabla 2). Las fracciones albuminas + NNP y globulinas de kañihua, presentaron, mayor contenido proteínico (p 0,05) en comparación a kiwicha y trigo.

 

TABLA 2

Contenido proteínico en las fracciones proteicas de la harina integral y deslipidizada de
kañihua (Chenopodium pallidicaule Aellen) de las variedades Ramis y Cupi-Sayhua
(g/100 g de harina seca).

Fracciones extraídas con la técnica de Barba de la Rosa y et.al21 NNP (Nitrógeno No Proteico).
Harinas: Integral (I), Deslipidizada (D).

 

Luego, se prosiguió a determinar el rendimiento porcentual de las fracciones proteicas de la harina de kañihua empleando cinco técnicas de fraccionamiento (Figura 1). Para fines de la investigación no se consideraran a las albuminas + NNP, sólo a las albuminas, por lo tanto, se observó mayor rendimiento (p 0,05) de extracción proteínica en las fracciones albuminas y glutelinas con la técnica de Rodríguez y et.al28, y en las fracciones globulinas y prolaminas con la técnica Barba de la Rosa y et.al18 en comparación a las fracciones obtenidas con la técnica de Maldonado-Cervantes y et.al26, Barba de la Rosa y et.al27, Soriano-Santos y et.al20. De esta manera, se consideró los solventes y metodología de estas dos técnicas como óptimos para extraer las fracciones proteínicas de kañihua en las dos variedades evaluadas.

 

Figura 1. Rendimiento porcentual de las fracciones proteicas de la
harina deslipidizada de kañihua (Chenopodium pal lidicaule Aellen) de la
variedad Ramis según técnicas de extracción (μ ± SEM).
Diferencia significativa *(p 0,05).

 

Continuando con la evaluación de las técnicas de extracción de las fracciones proteicas de kañihua, en la evaluación del tiempo de extracción se observó que no existieron diferencias significativas en el rendimiento porcentual de las fracciones proteicas según el tiempo de extracción de 1, 2, 4 y 8 h. Por lo tanto, se consideró el menor tiempo de 1 h como el óptimo en la obtención de las fracciones proteicas (Figura 2).

 

Figura 2. Rendimiento porcentual de las fracciones proteicas de la harina
deslipidizada de kañihua (Chenopodium pallidicaule Aellen) de las variedades
Ramis y Cupi-Sayhua a diferentes tiempos de extracción (μ ± SEM).
Fracciones extraídas con la técnica de Rodríguez y et.al28 y Barba de la Rosa y et.al18.

 

Finalmente, con los solventes, metodología y tiempo óptimo para la extracción de las fracciones proteicas de kañihua (descritos líneas arriba), se obtuvo un mayor contenido proteico y rendimiento porcentual (p 0,05) de albuminas y glutelinas fraccionadas con la técnica de Rodríguez y et.al28, y globulinas 7S, 11S y prolaminas con la técnica de Barba de la Rosa y et.al18 durante 1 h de extracción, en comparación a kiwicha y trigo (Tabla 3). Además, al combinar estas dos técnicas se obtuvo mayores rendimientos porcentuales de las fracciones proteicas (p 0,05) en comparación a las fracciones obtenidas con las técnicas individuales. También, se observó que las globulinas 11S y 7S presentaron mayores rendimientos porcentuales seguidas de glutelinas, albuminas y prolaminas, en ambas variedades de kañihua. Sin embargo, la variedad Cupi-Sayhua presentó mayor cantidad del contenido proteínico y rendimiento porcentual sin diferencia significativa.

 

TABLA 3

Contenido proteínico y rendimiento porcentual en las fracciones proteicas de harina
deslipidizada de kañihua (Chenopodium pallidicaule Aellen) de las variedades Ramis y
Cupi-Sayhua (g/100 g harina seca)

Fracciones proteicas extraídas con la técnica de Rodríguez y et.al22 y Barba de la Rosa y et.al12.

 

Perfil electroforético de las fracciones proteicas de la harina de kañihua 

El perfil electroforético de las fracciones proteicas obtenidas de la harina de kañihua Cupi-Sayhua, presentó

en la fracción albuminas (línea 1, Figura 3) bandas intensas entre 5 a 95 kDa, con tres dobles bandas en 25, 36 y 46 kDa. En globulinas 7S (línea 2, Figura 3) se observaron bandas de menor intensidad entre 50 a 92 kDa, y de mayor intensidad entre 4 a 55 kDa, doble banda entre 31 a 35 kDa, y 21 a 27 kDa. En globulinas 11S (línea 4, Figura 3) las bandas de mayor intensidad se visualizaron entre 4 a 37 kDa, doble banda entre 31 a 34 kDa y 21 a 25 kDa. En prolaminas (línea 5, Figura 3) las bandas estuvieron entre 110 a 200 kDa, y un conjunto de bandas entre 6,5 a 23 kDa. Finalmente, glutelinas (línea 6, Figura 3) presentó las bandas de menor intensidad entre 60 a 230 kDa, y de mayor intensidad entre 6 a 37 kDa, doble banda entre 31 a 35 kDa y 20 a 25 kDa. La harina sin fraccionar en ambas variedades de kañihua mostró mayor cantidad de bandas que las fracciones, con regiones de polipéptidos entre 5 a 250 kDa, observándose mayor intensidad de las bandas en kañihua Cupi-Sayhua (Línea 8 y 9, Figura 3). Así mismo, en kañihua Ramis se observaron similar número de bandas que kañihua Cupi-Sayhua pero de menor intensidad.

 

Figura 3. Electroforesis SDS-PAGE de las fracciones
proteicas de kañihua (Chenopodium pallidicaule Aellen)
variedad Cupi-Sayhua. Líneas: 1, Albuminas; 2, Globulinas
7S; 3, 7 y 10, MP (Broad range); 4, Globulinas 11S;
5, Prolaminas; 6, Glutelinas; 8, Harina deslipidizada de
kañihua Ramis; 9, Harina deslipidizada de kañihua
Cupi-Sayhua; 11, MP (Dual color).

 

DISCUSIÓN

El análisis proximal de un alimento permite determinar el valor nutritivo en composición y contenido, esta información es importante en el control de calidad del alimento, para obtener un producto final óptimo. Los granos andinos como kañihua se consideran completos por su valor nutritivo y calidad biológica, con elevada cantidad de proteína en comparación a algunos cereales. En el presente estudio la cantidad de proteína de la harina integral fue 16,2 y 18,7% de kañihua Ramis y Cupi-Sayhua, respectivamente (Tabla 1); valores mayores a los reportados por otros autores como Giuliani y et.al32 que presentaron 16,1%. También, Mujica y Chura7 mostraron en kañihua amarilla 14,3%, gris 14,0%, parda 13,8% y plomiza 14,0%. De manera similar, a lo descrito por Repo-Carrasco-Valencia y et.al36 15,2%, Callisaya y Alvarado2 en kañihua amarilla-kallutaca 14,7% y beige-taraco 13,5%, y Espinosa13 15,3%. Las variedades de kañihua Ramis y Cupi-Sayhua presentaron un elevado contenido de proteínas en comparación a la mayoría de cereales, como el trigo que contiene entre 9,61 al 15,4%, arroz con 7,4 a 9,9%, y maíz con 9,2 a 13%32-37. A la vez, el contenido de grasas de kañihua Ramis y Cupi-Sayhua fue de 6 y 4,5%, respectivamente, valores similares a los reportados en kiwicha 6% y quinua 5%, y mayores a cereales como trigo 2,1%, maíz 4,5% y arroz 2%33-35. Los demás parámetros del análisis proximal evaluado en las variedades Ramis y Cupi-Sayhua, estuvieron dentro de los rangos descritos en otras variedades de kañihua por Mujica y Chura7 y Repo-Carrasco8.

El contenido proteínico en las fracciones proteicas de la harina integral de kañihua fue mayor en comparación al grano andino kiwicha y al cereal trigo (p 0,05). Así mismo, se observó mayor contenido proteínico en la fracción albumina + NNP, seguida de globulinas, glutelinas y prolaminas (Tabla 2). Además, la exposición de la harina integral al solvente n-hexano por 24 h disminuyó el contenido de lípidos e incrementó la solubilidad de las proteínas en aproximadamente 10%. En otras investigaciones de fraccionamiento proteico de harina integral de semilla de kiwicha, mostraron que la deslipidización incrementó el contenido de proteínas solubles entre 10 y 75%, e influenció en la distribución de la solubilidad de las fracciones proteicas, siendo menor en prolamina y glutelina. Utilizaron n-hexano en la proporción 1:10 (p/v) en la deslipidización por ser de fácil evaporación y bajo costo, con esta información se usó este solvente para deslipidizar la harina integral de kañihua Ramis y Cupi-Sayhua18,39-41.

El fraccionamiento proteico según la solubilidad de Osborne, perm ite separar fracciones y conocer la cantidad de proteína, cada una con propiedades y características diferentes. Existen investigaciones de fraccionamiento proteico según la solubilidad de Osborne que utilizan diferentes solventes, tiempos de extracción y metodologías para obtener albuminas, globulinas, prolaminas y glutelinas. En el presente estudio se evaluó cinco técnicas de fraccionamiento proteico según solubilidad de Osborne empleadas en la harina de kiwicha, se consideró metodología, solventes y tiempo de extracción óptimos de las técnicas evaluadas para obtener fracciones con mayores contenidos proteínicos y por consiguiente mayores rendimientos porcentuales (Figura 1). De esta manera, se observó en el fraccionamiento proteico de la harina de semilla de kañihua Ramis y Cupi-Sayhua mayores rendimientos porcentuales (p 0,05) con la técnica de Rodríguez y et.al28 para albuminas y glutelinas, y Barba de la Rosa y et.al18 para globulinas 7S, globulinas 11S y prolaminas, en comparación a las otras técnicas evaluadas. Además, la fracción prolaminas mostró menor rendimiento debido a su bajo contenido proteico, también reportado en kiwicha y describen que esta fracción sería la responsables de la patología celiaca10, en consecuencia las fracciones proteicas de kañihua serían una alternativa alimentaria para los intolerantes al gluten. Así mismo, la extracción secuencial durante 1 h de las fracciones proteicas de la harina de kañihua en ambas variedades, mostró mayor rendimiento porcentual en comparación a 2, 4 y 8 h (Figura 2), tiempo análogo al reportado en la obtención de fracciones proteicas en la semilla de kiwicha18,20,26,27,40 pero diferente al de Rodríguez y et.al28, que reportaron mejores resultados a 14 h de extracción de las fracciones proteicas obtenidas en las hojas de kiwicha.

La obtención de las fracciones proteicas de kañihua en condiciones óptimas de solventes, metodologías y tiempo, mostraron el contenido y distribución proteica para kañihua Ramis en albuminas (15,4%), globulinas 7S (24,1%), globulinas 11S (25,7%), prolaminas (9,6%) y glutelinas (22,9%); y para kañihua Cupi-Sayhua en albuminas (15,8%), globulinas 7S (26,3%), globulinas 11S (26,7%), prolaminas (9,9%) y glutelinas (21,5%) (Tabla 3). Estos resultados fueron mayores a los reportados en las semillas de kañihua en albúminas y globulinas (45,0%), prolaminas (28,0%), glutelinas y proteínas insolubles (31,0%); con diferencias en las prolaminas y glutelinas lo cual se explicaría por la metodología de extracción utilizada y la inclusión de proteínas insolubles21. En quinua, reportaron en las semillas albúminas y globulinas (45,0%) prolaminas (23,0%), glutelinas y proteínas insolubles (32,0%)35,42. En kiwicha, describieron en las hojas, albuminas (73,4%), globulinas (65%), prolaminas (6,5%) y glutelinas (60%)28. En las semillas, reportaron albuminas + NNP como la fracción más abundante con 30 a 50%, globulinas 5 a 16%, prolaminas 0,9 a 2%, y glutelinas 16 a 41%18,27. De manera similar, Búcaro y Bressani40, describieron albuminas + NNP, globulinas, prolaminas y glutelinas 29,2; 24,5; 0,95 y 28,8%, respectivamente. En otras investigaciones en semilla de kiwicha que extrajeron sólo albuminas sin considerar NNP, reportaron albuminas 33,0%, globulinas 17,5%, prolaminas 6,9% y glutelinas 1,7%20. También, informaron el contenido de albuminas 20,0%, globulinas 19,1%, prolaminas 0,9% y glutelinas 30,9%43. A diferencia, de la investigación que describió albuminas 10,4%, globulinas 0,8%, prolaminas 0,6% y glutelinas 22,5%44. Los altos contenidos de albuminas y globulinas, seguido de glutelinas son comparables con la soya y en menor proporción con los cereales45.

En el presente estudio, para la extracción de la fracción albuminas se usó la proporción de harina/solvente de 1:10 (p/v), similar al reportado en semilla de kiwicha18,19,26,27,46-48; y diferente al empleado en hojas en la proporción 1:30 (p/v)28. En globulinas 7S y 11S, se obtuvo los mayores rendimientos con los solventes Na2HPO4 y NaCl, igual a los empleados por Barba de la Rosa y et.al18, Silva-Sánchez y et.al19, Paredes-López49, y Konishi y et.al48, en contraste del K2HPO4 y NaCl reportado por Maldonado-Cervantes y et.al26. Así mismo, describieron que Na2HPO4 y NaCl mejoró la solubilidad de globulinas en guisantes50. En prolaminas el mejor rendimiento se mostró con 2-propanol al 70%1827-2840. En glutelinas con el solvente NaOH se obtuvo mejores resultados, análogos a los descritos en kiwicha26-28,40,51.

En la investigación de Barba de la Rosa y et.al18 mencionaron la importancia de la deslipidización de la harina integral para estudios cualitativos de fracciones proteicas, debido a que mejoró significativamente la calidad de los patrones electroforéticos. En el presente estudio el perfil electroforético de las fracciones proteicas de la harina de la semilla de kañihua Cupi-Sayhua (Figura 3), mostró patrones similares en número de bandas y diferentes en concentraciones, siendo más intensos las bandas de Cupi-Sayhua en comparación a la variedad Ramis. Perfil similar, al observado en el arroz52 y kiwicha18-20,27,44,45,49,53.

En la fracción albumina en ambas variedades de kañihua, presentaron regiones de polipéptidos entre 5 y 95 kDa, similar a lo reportado en kiwicha y describieron una banda típica alrededor de 36 kDa18,27,54, otros autores mostraron bandas alrededor de 35 kDa ricas en lisina55, 18 kDa ricas en metionina51, y esta fracción en kiwicha fue comparable en su composición de aminoácidos a la albumina del huevo y fue utilizada como sustitutivo en la industria panificadora19. También, se han reportado a partir de esta fracción péptidos bioactivos con actividad anti-hipertensiva, antioxidante y anti-cancerígena20,53.

En el presente estudio, la globulina 7S presentó regiones entre 4 y 92 kDa, y en globulina 11S entre 4 y 37 kDa, en el grano kiwicha reportaron en globulinas una banda alrededor de 55 kDa denominada precursora de globulinas27, y otras regiones entre 22 y 38 kDa. Además, se describieron péptidos bioactivos derivados de las globulinas con actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina19,27,53. De manera similar, se reportaron bandas de globulinas entre 50 y 90 kDa en el guisante convicilin y soya56,57, la migración de las bandas de globulina 7S y 11S dependen principalmente de la fuerza iónica de sus agentes extractores50.

En la fracción de prolaminas en kañihua Ramis y Cupi-Sayhua se observó varias bandas entre 6,5 y 22 kDa, similar a lo reportado en kiwicha45, denominadas bandas de bajo peso molecular (10 a 14 kDa) y solubles en alcohol. A diferencia, otros autores reportaron bandas entre 24 y 67 kDa y de elevado peso molecular (> 94 kDa)27.

En la fracción de glutelina en ambas variedades de kañihua se presentaron regiones entre 6 y 230 kDa, similar a lo reportado para kiwicha por Barba de la Rosa y et.al27 y Tovar-Pérez y et.al53. Al igual que las prolaminas, presentan regiones de elevada masa molecular unidos por puentes disulfuro que dificultan o no permiten el ingreso de las muestras al gel de poliacrilamida27. Así mismo, se describieron péptidos bioactivos de ésta fracción con actividad anti-hipertensiva y anti-cancerígena18,19,26,53,58.

Es importante mencionar que las investigaciones de nutracéuticos de kañihua hasta el momento fueron realizados en concentrados proteicos13,15, y ninguno en fracciones proteicas, fuentes ricas en contenido proteínico y por consiguiente en péptidos bioactivos.

CONCLUSIONES

Se observó un mayor contenido proteínico en la harina de la semilla en ambas variedades de kañihua, siendo mayor en Cupi-Sayhua, y en sus fracciones proteicas, en comparación a kiwicha y trigo. A la vez, se encontró mayores rendimientos porcentuales en el fraccionamiento proteico con la técnica de Rodríguez y et.al28, para albuminas y glutelinas, y con el de Barba de la Rosa y et.al18, para globulinas y prolaminas. El tiempo óptimo que mostró mayor rendimiento porcentual de extracción secuencial de las fracciones proteicas fue de 1 h. La composición y distribución de proteínas solubles de kañihua Ramis y Cupi-Sayhua con los solventes, metodologías y tiempo óptimo fueron: albuminas 15,4 ± 0,3 y 15,8 ± 0,3%; globulinas 7S 24,1 ± 0,5 y 26,3 ± 1,0%; globulinas 11S 25,7 ± 1,0 y 26,7 ± 1,0%; prolaminas 9,6 ± 0,1 y 9,9 ± 0,5% y glutelinas 22,9 ± 0,1 y 21,5 ± 1,4%, respectivamente. En el perfil electroforético se observó patrones similares en número de bandas y diferentes en concentraciones en las dos variedades de kañihua, encontrándose bandas más intensas en kañihua Cupi-Sayhua.

Agradecimientos. Esta investigación fue financiada por CIENCIACTIVA-CONCYTEC en el marco del contrato 007-2014-FONDECYT. Agradecemos a Mg. Inés Arnao del Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición-UNMSM por la revisión del artículo y Mg. Elizabeth Carranza del Instituto Nacional de Biología Andina, por facilitar su equipamiento.

 

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Este trabajo fue recibido el 10 de septiembre de 2016. Aceptado con modificaciones el 21 de marzo de 2017 y aceptado para su publicación el 5 de mayo de 2017.

 

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