Rev Chil Nutr Vol. 33, Nº2, Agosto 2006, pags: 198-203

ARTÍCULOS ORIGINALES

En consecuencia, el objetivo de este estudio fue evaluar en voluntarios sanos cómo el consumo de un producto con La1 afecta las principales poblaciones bacterianas de la microbiota intestinal.

SUJETOS Y MÉTODO

Sujetos, diseño y producto

Se reclutaron ocho voluntarios asintomáticos, 4 hombres y 4 mujeres (27.3 ± 7.6 años; rango [19-40 años]), sin antecedentes de patologías gastrointestinales, historial de tratamiento antibiótico, antiácido, laxantes o prokinéticos en los tres meses previos al inicio del estudio. El protocolo fue aprobado por el Comité de Etica del INTA, y cada voluntario firmó una carta de consentimiento informado. Los voluntarios mantuvieron su dieta normal, pero se les pidió evitar el consumo de otros productos lácteos fermentados y probióticos durante toda la duración del estudio. Después de un periodo basal de cinco días, los voluntarios ingirieron diariamente una botella (100 ml) del producto con La1 durante la primera semana, dos botellas (200 ml) durante la segunda semana, y finalmente cinco botellas (500 mL) durante la tercera semana. Cada botella contenía 14.7 g de carbohidratos (93% sacarosa, 7% lactosa), 0.9 g de proteínas y 0.03 g de lípidos, aportando 63 Kcal. (Chamyto, Nestlé-Chile SA, Santiago, Chile); los recuentos realizados en el laboratorio mostraron que La1 estaba presente en el producto a concentración de 1x10⁸ UFU/ml. Se registró durante el estudio la eventual aparición de sintomatología gastrointestinal derivada de la ingestión del producto. Muestras frescas de deposición fueron obtenidas a nivel basal antes de consumir el producto (día 0), al final de cada periodo de consumo (días 7, 14, y 21) y en los días 28 y 35 del periodo post-ingestión.

Análisis de lactobacilos y de La1 por cultivo

Cada muestra de deposición fue recolectada en frascos estériles y en condiciones de anaerobiosis a 4°C. Alrededor de un gramo de deposición se homogenizó en PBS estéril y luego se centrifugó a 300 g de manera de eliminar las partículas de mayor tamaño. Una alicuota del sobrenadante se diluyó en forma seriada, se sembró en agar MRS y se incubó por 48 horas a 37° en anaerobiosis para cuantificar los lactobacilli totales. Se detectó La1 mediante el aspecto morfológico de sus colonias; luego su identidad fue confirmada mediante ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus sequences-PCR) (14).

Análisis de la microbiota por FISH y citometría de flujo

El estudio de la microbiota se realizó mediante hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH) utilizando la sonda universal (Eub338) para detectar las bacterias totales y sondas específicas para detectar las poblaciones de Bacteroides (Bac303), Lactobacillus/Enterococcus (Lab158), Fusobacterium (Fprau645) y Bifidobacterium (Bif164) (15-19). Con este objetivo una alícuota de deposición previamente homogeneizada y fijada en formalina fue tratada con lisozima y luego incubada con las distintas sondas por 16 horas a 35º C. La detección de las bacterias hibridadas se realizó por citometría de flujo (FacsCalibur, Becton Dickinson). En cada muestra se contaron 100.000 eventos fluorescentes, los cuales fueron posteriormente analizados con el software WinMDI 2.8. Los resultados obtenidos para cada población bacteriana se expresaron como porcentaje del total de bacteria detectado con la sonda EUB338.

Análisis estadísticos

Las concentraciones de Lactobacillus totales y de La1 se expresaron como log (UFC o células) por gramo de deposición (promedio ± SEM) y los resultados de FISH-citometría de flujo como porcentaje del total de eventos marcados con la sonda universal Eub338 (promedio ± SEM). Los cambios cuantitativos observados en la población de Lactobacillus y de La1 a través del tiempo fueron analizados mediante análisis no paramétrico de varianzas de Friedman para muestras repetidas; en caso de significancía estadística, las diferencias fueron analizadas mediante el test de Wilcoxon. Para analizar los cambios de los porcentajes de las poblaciones bacterianas en el tiempo, se realizó primero una transformación angular de los valores obtenidos y luego se les aplicó el análisis de varianzas de Friedman para muestras repetidas.

RESULTADOS

Todos los voluntarios completaron el estudio y mostraron buena tolerancia al producto, reportando solamente un leve incremento en los ruidos intestinales durante la ingestión de cinco unidades del producto diarias.

Los niveles de Lactobacillus totales determinados por cultivo fueron de 8.44 ± 0.33 log UFC/g de deposición durante el periodo basal (figura 1). Se observaron cambios leves en la excreción de lactobacilli a lo largo del estudio, que afectaron principalmente los niveles post-ingestión (Figura 1, Friedman ANOVA: X²=18.4; p=0.049). La cuantificación de lactobacilli total por FISH y citometría de flujo indica niveles básales (8.0 log células/g) similares a los observados anteriormente mediante cultivo; sin embargo no se observaron cambios entre los periodos de ingestión y post-ingestión con este método (Friedman ANOVA: X²=4.50; p=0.72).

Como está indicado en la figura 1, no se detectó excreción fecal de La1 a nivel basal (< al limite de detección del método) y la ingestión de La1 resultó en la excreción de La1 en las deposiciones de todos los voluntarios. Las concentraciones fecales de La1 aumentaron regularmente con las cantidades del producto ingerido (Friedman ANOVA: X²=25.76; p<0.0025), resultando en una concentración de 6.3±0.53 log UFC La1/g al final del período de ingestión de 500 mL de producto. Finalizada la ingestión del producto, las concentraciones fecales de La1 disminuyeron regularmente hacia su completa desaparición. La1 fue encontrado en 7 de los 8 voluntarios siete días después de terminada la ingestión del producto y en solo un voluntario después de 14 días de haber terminado la ingestión del producto.

La figura 2 muestra las distintas poblaciones bacterianas fecales analizadas en el estudio. Se puede observar que las poblaciones de F. prausnitzii y de Bacteroides/Prevotella representaron respectivamente el 18.3% y 13.2% del total de bacterias detectadas por Eub338 y las de Bifidobacterium y Lactobacillus sólo el 2.04% y 0.89% de este total. Por lo tanto las 4 poblaciones bacterianas evaluadas en el estudio representaron alrededor del 35% del total de bacterias detectadas con Eub338.

La figura 2 muestra como el consumo de La1 afecta a estas poblaciones bacterianas: el porcentaje de F. prausnitzii disminuye significativamente al final del período de ingestión y al principio del período post-ingestión, comparado con el nivel basal (Friedman ANOVA: X²=20.1, p=0.005) mientras que los niveles de Bifidobacterium y de Lactobacillus/Enterococcus aumentaron (Friedman ANOVA: X²=13.2, p=0.067 y X²=13.7, p=0.056, respectivamente) y aquellos de bacteroides no fueron afectados por La1 (Friedman ANOVA: X²=7.08, p=0.42).

DISCUSIÓN

A pesar de que La1 es un probiótico cuyos efectos sobre la salud están bien descritos, se sabe poco de su capacidad de regular otras poblaciones bacterianas de la microbiota. Nuestros resultados muestran que la ingestión de La1 aumenta las poblaciones de Bifidobacterium y Lactobacillus mientras que disminuye aquella de F. prausnitzii. Tal efecto se debe probablemente a la capacidad de La1 de sobrevivir durante su tránsito a lo largo del tracto gastrointestinal, como se ve reflejado por la excreción de La1 vivo en las deposiciones de los sujetos. Sin embargo, la presencia de La1 en el intestino es transitoria y una vez terminada la ingestión del producto, La1 se elimina rápidamente del intestino. Estos resultados confirman aquellos obtenidos con otros probióticos y que indican que, a pesar de su origen humano, los probióticos actúan como microorganismos alóctonos que solo transitan por el tracto gastrointestinal del huésped sin colonizarlo permanentemente, debido probablemente al efecto de barrera ejercido por la microbiota intestinal autóctona (20). Es interesante notar que paralelamente a la eliminación de La1, las poblaciones afectadas por su consumo generalmente tienden a volver a sus niveles basales. Esto sugiere que es necesaria una ingestión regular del probiótico para asegurar su capacidad de interactuar con la microbiota intestinal.

Comparado con otros estudios en humanos (20), detectamos altas concentraciones de lactobacilli en nuestros voluntarios (>10⁸/g de deposición) tanto por cultivo como por FISH y citometría de flujo. Es posible que esta importante población autóctona de lactobacilli compita con el aporte exógeno de La1, lo cual explicaría porqué los niveles de La1 no fueron mayores a 10⁷/g de deposición, considerando un consumo durante el último período de ingestión de 5x10¹⁰ UFC La1 diario.

El incremento en las poblaciones de Bifidobacterium y Lactobacillus puede ser favorecido por el descenso en la población de Fusobacterium, y tal vez de otras poblaciones no detectadas con las sondas utilizadas en este estudio. El incremento de las bifidobacterias durante los períodos de ingestión y post-ingestión es interesante y confirma recientes observaciones de nuestro grupo en niños que recibían una fórmula láctea suplementada con La1 por siete semanas (21). En estos niños, la ingestión de La1 incrementa los niveles de Bifidobacterium de un 5% a nivel basal a alrededor de un 20% al final del periodo de suplementación. En relación con el efecto de la ingestión de La1 sobre las poblaciones de bifidobacteria, es interesante señalar que este microorganismo posee las vías metabólicas necesarias para sintetizar y liberar fructanos en el lumen intestinal (5). Estas moléculas son reconocidas por actuar como prebióticos (21, 22), estimulando selectivamente el crecimiento de poblaciones autóctonas de Bifidobacterium en el colon, tal como observamos en nuestro estudio. Es probable que esta propiedad «prebiótica» no sea general a todas las especies de Lactobacillus, ya que por ejemplo, la ingestión regular de L. rhamnosus DR20, no se asocia con cambios en las poblaciones fecales de bifidobacteria en humanos (20). Observamos también que la ingestión de La1 resulta en una menor frecuencia de detección de Fusobacterium. Este fenómeno puede ser interesante para la salud del huésped ya que se ha mostrado que especies del género Fusobacterium aisladas de pacientes con colitis ulcerosa son capaces de inducir colitis en ratas, señalando a estos microorganismos como posibles agentes etiológicos en el desarrollo de enfermedades inflamatorias crónicas del intestino (23).

En conclusión, nuestros resultados muestran que la ingestión de un producto comercial suplementado con La1 modula la microbiota fecal en voluntarios humanos sanos, aumentando los niveles de Lactobacillus y Bifidobacterium y disminuyendo los niveles de Fusobacterium, una especie potencialmente patogénica. También confirman que La1 no coloniza permanentemente el tracto gastrointestinal por lo cual una ingestión regular del probiótico es necesaria para conseguir sus efectos funcionales. Estas observaciones sugieren que la regulación de la microbiota intestinal podría ser un factor importante para explicar los efectos beneficiosos de La1 sobre la salud del consumidor.

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Dirigir la correspondencia a:

Profesor
Martin Gotteland
Laboratorio de Microbiología
INTA, Universidad de Chile
El Líbano 5524, Macul
Santiago, Chile
Teléfono: 9781471
Fax: 221 4030
Email: mgottela@inta.cl

Agradecimientos: Se agradece a Rebecca Montalva por los análisis de citometria de flujo y a Paola Torres por los análisis de FISH. Financiado por Nestlé Chile, Fondecyt 1010673 y ECOS C01S03.

Este trabajo fue recibido el 13 de Diciembre de 2005 y aceptado para ser publicado el 19 de Junio de 2006.