Gayana 66(2): 243-248, 2002

Proceeding of the IV Symposium-Workshop of Chilean Association of Ichthyology

ESTUDIO POBLACIONAL DEL RECURSO ANCHOVETA (ENGRAULIS
RINGENS JENYNS 1842) (CLUPEIFORMES, ENGRAULIDAE), MEDIANTE 
ANALISIS DE ADN

POPULATION STUDY OF THE ANCHOVY RESOURCE (ENGRAULIS
RINGENS JENYNS 1842) (CLUPEIFORMES, ENGRAULIDAE), THROUGH
DNA ANALYSIS

Sandra Ferrada¹, Klaudia Hernández¹, R. Montoya² & Ricardo Galleguillos¹

RESUMEN

Se estudió la variabilidad de 2 genes nucleares, el intrón 4/5 del gen de Calmodulina (CaM) por amplificación PCR y la región ITS (Internal Transcribed Spacers) del ADNr, por PCR y digestión en 139 ejemplares de E. ringens provenientes de las costas de Iquique (20°13'S; 70°09'W) y Talcahuano (36°41'S; 73°06'W). Para CaM se identificaron 8 genotipos en las muestras de Talcahuano y 7 en Iquique, presentando 1 a 3 fragmentos amplificados de 550 a 1.100 pb. En la digestión del fragmento ITS amplificado, sólo la endonucleasa Taq^aI detectó 3 diferentes genotipos, 2 presentes en Talcahuano y 3 en Iquique. Se discuten las frecuencias observadas para cada gen y área de estudio. Los resultados llevan a confirmar la existencia de un solo stock, desde un punto de vista genético.

PALABRAS CLAVES: Engraulis ringens, ITS, CaM, variabilidad genética, stock.

ABSTRACT

The genetic variability of two nuclear genes, the 4/5 intron of the Calmodulin (CaM) and the ITS (Internal Transcribed Spacers) of the DNAr were studied. The methodology applied in 139 anchovies (E. ringens) from Iquique and Talcahuano, were the PCR amplification for CaM samples and the PCR amplification and digestion, for ITS samples. The results exhibited 8 genotypes for CaM in Talcahuano, and 7 were identified in Iquique. The size of the fragments founded (1-3), ranged from 550 to 1100 bp. The ITS amplification and digestion of a fragment determined the existence of 3 genotypes, 2 in Talcahuano and 3 in Iquique. But in the digestion of the ITS amplifications, only the Taq^aI endonuclease showed diferences in the restriction profiles. The genotypic frequencies are discussed for each gene and study area, as well as the presence of only one stock from a genetic point of view.

KEYWORDS: Engraulis ringens, ITS, CaM, genetic variability, stock.

INTRODUCCION

La anchoveta (Engraulis ringens) ocupa un destacado lugar en la trama trófica del sistema pelágico y demersal del Pacífico Suroriental (IIP, 1999), ya que sustenta en forma importante la pesquería pelágica con más del 25% de los desembarques nacionales (Subpesca, 2001). Este pez costero se distribuye latitudinalmente a lo largo de Perú (desde Zorritos 40 ° 30´S) y Chile (hasta Chiloé 42°30'S). Sobre este recurso (dentro del cual Talcahuano es considerado un stock pesquero unitario) opera una flota artesanal e industrial. Actualmente, esta pesquería se encuentra en un estado de plena explotación y sus capturas dependen de la variabilidad anual del reclutamiento, que es claramente influenciado por factores bióticos y abióticos (Arcos et al. 1996). Debido al escaso conocimiento de la estructura poblacional de este recurso, un manejo adecuado requiere la identificación de unidades reproductivas o stock sobre los que se ejerce la acción (Uribe et al. 1996). Por lo tanto, el conocimiento sobre la estructuración genética de su población por medio de las técnicas moleculares es relevante para adecuar estrategias de manejo según su abundancia.

En este contexto, el análisis morfométrico y merístico ha arrojado diferencias entre muestras de anchovetas provenientes de la zona centro - sur (Talcahuano) y norte de Chile (Barrueto 1993; Hernández 1994). Sin embargo, por medio de caracteres electroforéticos, se concluyó que desde un de punto de vista de la genética de proteínas no existen diferencias entre la población de Talcahuano, Iquique y Caldera, entre 1987 y 1988 (Galleguillos et al. 1996). De lo anterior se perfila la necesidad de ubicar atributos moleculares de mayor resolución, que nos permita identificar cambios en el genotipo, eliminando problemas de plasticidad fenotípica (Grijalva-Chon et al. 1994), que interfieren en las técnicas aplicadas a este recurso pesquero. Variados segmentos del ADN (genes) pueden entregar información sobre la variabilidad genética de la anchoveta, que ayudaría a discernir sobre la existencia de un stock puro de este recurso entre la zona norte y centro - sur de Chile (Spanakis et al. 1989). Con este fin se emplearon dos genes nucleares: la región ITS 1 y 2 del ADN ribosomal y el intrón 4/5 del gen de calmodulina, como posibles indicadores de poli-morfismo basados en PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) y RFLP (Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción).

MATERIALES Y METODOS

Se estudió un total de 139 ejemplares, pro-venientes del área de operación de las flotas cerqueras de Talcahuano (36°41'S; 73°06'W) e Iquique (20°13'S; 70°09'W), recolectados en abril y agosto del 2001, respectivamente. De cada ejemplar se extrajo un trozo de músculo del pedúnculo caudal y se preservó en alcohol 70%. Posteriormente se realizó la extracción del ADN según el método de Grijalva-Chon et al. (1994).

El ADN extraído fue usado para amplificar el intrón 4/5 del gen de CaM con los par-tidores universales CALMex4F y CALMex5R descritos por Chow (1998). La PCR se efectuó en un volumen final de 24 ml conteniendo 1U de Taq ADN polimerasa (GIBCO), 0.2 mM de cada dNTPs, 2 mM de MgCl₂, 3.7 pmoles de cada partidor, tampón para PCR 10X y 0.5 ml de ADN de E. ringens. Los ciclos de temperatura se llevaron a cabo en un termociclador Progene con el siguiente programa de temperatura: desna-turalización inicial del ADN a 95°C por un minuto, seguido de 30 ciclos de amplificación (desnaturalización a 95°C por 30 segundos, unión de los partidores a 60°C por un minuto, extensión a 72°C por 2 minutos) y una extensión final de 10 minutos a 72 °C. Los fragmentos de la amplificación PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 2%, y su posterior tinción con bromuro de etidio (5mg/ml). Finalmente, los geles son visualizados con un transiluminador UV y fotografiado con película POLAROID 667.

Para la amplificación de la región ITS se utilizó los partidores 18D y 28U descritos por Hillis & Dixon (1991). La PCR se realizó en un volumen de 25 ml y contenía 1U de Taq ADN polimerasa (GIBCO), 0,1mM de dNTPs, 0.2 mM de cada partidor, tampón de amplificación diluido 10 veces y 0.5 ml de ADN templado. El programa de un ciclo inicial de 5 minutos a 95°C, 1 minuto a 48°C y 1 minuto a 72°C, seguido de 30 ciclos de amplificación (desnaturalización a 95°C por 30 minutos, annealing a 54°C por 1 minuto, extensión a 72°C por 1 minuto) y 5 minutos a 72°C de extensión final. Las condiciones de visualización de los fragmentos amplificados fueron las mismas descritas para CaM. En la digestión del fragmento ITS se usaron 6 endo-nucleasas (Ava II, Dpn II, Hae III, Hha I, Hinf I y Taq^aI). Los fragmentos resultantes de la digestión fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 3%, teñidos y fotografiados en las mismas condiciones que para el gen de CaM.

Los genotipos observados para cada gen y área de estudio se calcularon las frecuencias genotípicas y el Indice de Diversidad Genética (h) (Nei 1987 fide Chow & Takeyama 2000). Para comparar las frecuencias genotípicas entre ambas zonas se elaboró una tabla de contingencia, verificando su homogeneidad mediante un test c² (Richardson et al. 1986).

RESULTADOS

CaM

Para un total de 139 muestras, el 65% amplificó positivamente para Talcahuano (n =79) y 98% para Iquique (n =60). Dentro de las muestras positivas se observó un total de 13 genotipos, que contenían varios fragmentos con un tamaño entre 550 a 1100 pb.

En las muestras de Talcahuano, se identi-ficaron 8 genotipos con uno a tres fragmentos de entre 550 a 975 pb. Para el área de Iquique se identificaron 7 genotipos, presentando 1 y 2 fragmentos con un tamaño de 690 a 1.100 pb.

En cuanto a la presencia de los genotipos, el morfo E, constituido por una banda sencilla de 730 pb aproximadamente (Fig.1), fue el más común para ambas áreas de muestreo. La frecuencia de aparición fue del 68% en muestras de Talcahuano y de un 88% en Iquique presentándose los demás genotipos en muy baja frecuencia. El h para Talcahuano e Iquique, presenta valores de 0.5 y 0.2 respectivamente (Tabla I). La prueba c² del gen CaM, para ambas zonas, presenta valores no significativos (Tabla II).

Figura 1. Perfil electroforético de algunos de los morfos producto de la amplificación del intrón 4/5 del gen CaM en E. ringens. Los genotipos clasificados en orden alfabético se indican sobre la fotografía. fx: marcador de peso molecular. Figure 1. Electrophoretic profile of some morphs obtained from the amplification of the 4/5 intron of de CaM gene in E. ringens. The genotypes classified by alphabetical order are indicated on the photography. fx: molecular weight marker.

Tabla I. Indice de Diversidad Genética h estimado para cada gen y área de estudio.

Table I. Genetic diversity index h estimated for each gene and study area.

Tabla II. Valores del Test- c² para las frecuencias de los genotipos de cada gen analizado.

Table II. c²- test values for genotype's frequencies for each analyzed gene.

ITS

La amplificación del fragmento ITS fue positiva en un 58% de las muestras en las dos áreas estudiadas (n =139). Dentro de las muestras positivas, el 5% amplificó con 2 fragmentos, uno de 1353 pb (alelo Z) y otro de 900 pb (alelo X). El 2% amplificó un fragmento de 900pb y el 93% un fragmento de 1353 pb. Las digestiones y análisis posteriores se realizaron sobre el frag-mento más común, de 1.353 pb. La digestión de este genotipo con las enzimas Ava II, Dpn II, Hinf I, Hae III y Hha I mostró perfiles monomórficos en las zonas de estudio. Sin embargo, la digestión con la enzima Taq^a I mostró polimorfismo, obteniéndose 3 morfos para la zona de Iquique y 2 en Talcahuano (Fig. 2).

Figura 2. Digestión de ITS con Taqa I. Perfil electro-forético con los 3 genotipos identificados en las muestras de E. ringens de la zona de Talcahuano e Iquique. fx: marcador de peso molecular. nd: no digerido. Figure 2. Digestion of ITS with Taqa I. Electrophoretic profile with the 3 identified genotypes in the samples of E. ringens from Talcahuano and Iquique zones. fx: molecular weight marker. nd: no digested.

Tabla III. Genotipos y frecuencias de la digestión de ITS con Taq^a I en el área de Talcahuano.

Table III. Genotypes and frequencies of the ITS digestion with Taq^a I in the Talcahuano (T) and Iquique (I).

El genotipo más frecuente en ambas zonas fue el III, compuesto por 4 fragmentos. Presentándose en un 98% de las muestras en el área de Talcahuano (n=79) y en un 90% en Iquique (n=60).

El h presenta un valor de 0.1 para Talcahuano y 0.2 para Iquique (Tabla I), con un test - c² cuyos valores son no significativos (Tabla II), por lo cual las frecuencias arrojan el mismo patrón de distribución en ambas localidades.

DISCUSION Y CONCLUSIONES

Las amplificaciones positivas para CaM permitieron diferenciar entre 8 y 13 genotipos para E. ringens en las muestras y áreas geográficas muestreadas. Estos resultados confirman la aplica-bilidad de distintos genes analizados con fines comparativos, entre distintas taxas y poblaciones de peces, dentro de los cuales se cuenta el gen CaM (Chow 1998; Chow & Takeyama 2000).

El 40% y 67% de las muestras en el área de Talcahuano e Iquique respectivamente, amplifi-caron un fragmento de 550 pb que no fue considerado en el análisis final por su baja resolución y reproducibilidad. Este fragmento podría reflejar una forma adicional del intrón, producto de loci de CaM (Côrte-Real et al. 1994a); o bien derivar de genes emparentados con CaM, con una secuencia igual ó muy parecida a la de los partidores usados (Côrte-Real et al. 1994a; Côrte-Real et al. 1994b). En la actualidad es conocido que la proteína CaM está presente en todos los eucarióticos (Yiu 1982), y según nuestros resul-tados en la anchoveta estaría codificada por al menos 2 loci o genes distintos. Dado el número de fragmentos obtenidos de la PCR; se trataría de un gen parálogo, si se considera al morfo más común (E) como el genotipo ancestral y los demás genotipos las condiciones derivadas por duplicación, semejante al caso de la familia génica de las globinas (Strickberger 1993). Queda abierta la posibilidad de que algunos de los fragmentos amplificados sean producto de genes emparentados con CaM (genes ortólogos) o pseudogenes no funcionales.

En cuanto a la frecuencia de los genotipos de CaM, se observa que el más común se distribuye aproximadamente con la misma frecuencia en las dos muestras geográficas estudiadas. La presencia de morfos en muy baja frecuencia puede deberse a varias razones; la primera es que la presencia de estos genotipos sería un indicio de que están ocurriendo variaciones genéticas que aún no definen grupos separados (González et al. 1996). La segunda es que dado el bajo número de ejemplares analizados y sabiendo que CaM es un marcador más bien conservativo (Chow 1998), se justifica la baja frecuencia de aparición de estos genotipos. Este carácter conservativo no sería tan evidente en otros organismos como erizos, ranas, anguilas, aves, ratas e incluso el pez espada (Hardy 1989; Matsuo et al. 1992, Chow & Takeyama 2000).

En cuanto al ITS, aun cuando su secuencia entre diferentes taxa se presenta conservativa (Yu et al. 2000), compuesto por unidades repetidas, que se localizan en diferentes zonas del genoma, es posible que algunas de estas unidades presenten algún grado de variabilidad intraespecífica o hasta intragenómica, que se traduce en que algunas de estas variantes posean sitios particulares de restricción o carezcan de ellos. Esto pareciera ser el caso del fragmento ITS de E. ringens de las costas chilenas, que al ser digerido con la restrictasa Taq^a I, el genotipo más común (III) se distribuye en forma homogénea en las áreas de estudio, hecho ratificado por los resultados del test-c².

Considerando el análisis estadístico de las frecuencias de ambos genes en las zonas de estudio, se concluye que las muestras provienen de una población panmíctica. Esta afirmación se fortalece con los bajos valores de Fst (0.006) entregados por Galleguillos (com. pers) en base al análisis de aloenzimas, lo que indica la ausencia de diferenciación genética. Adi-cionalmente, con este valor se estimó el número efectivo de ejemplares migrantes (Nm) entre ambas poblaciones, con un valor de 41; este resultado nos señalaría que no existen restricciones al flujo génico entre ambas áreas estudiadas.

En resumen, utilizando herramientas mole-culares, del análisis de los genes nucleares ITS e intrón 4/5 de CaM, se puede considerar en principio la presencia de un stock puro de E. ringens a lo largo de las costas chilenas, encon-trándonos con una población panmíctica. Estos resultados representan un avance para del conocimiento de la genética en anchoveta, empleando calmodulina como un marcador más eficiente que ITS. Sin embargo es necesario secuenciar para eliminar artefactos de la técnica, y ampliar el número de muestras

AGRADECIMIENTOS

Los autores manifestan su agradecimiento al laborante Sr. José Luis Vera, en el desarrollo de los experimentos, y a la DAAD, (Beca a KH).

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Fecha de recepción: 03.04.02
Fecha de aceptación: 04.06.02 

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¹Departamento de Oceanografía, Facultad de Ciencias Naturales y Oceanográficas, Universidad de Concepción. Casilla 160-C, Concepción, Chile.

²Depto. de Biología Molecular, U. de Concepción, Casilla 160-C, Concepción, Chile. sferrada@udec.cl, khernan@udec.cl