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Revista chilena de anatomía

versión impresa ISSN 0716-9868

Rev. chil. anat. v.19 n.1 Temuco abr. 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-98682001000100002 

ESTUDIO LECTINHISTOQUÍMICO Y MORFOMÉTRICO DE LA GLÁNDULA
MAMARIA DE LLAMA (Lama glama) DURANTE EL PERIODO DE LACTANCIA

LECTINHISTOCHEMICAL AND MORPHOLOGICAL STUDY OF LLAMA (Lama glama)
MAMMARY GLAND DURING LACTATION

Dallard, Bibiana. E.*; Romano, Gabriela**; Lorente, Juan A.*; Lamas, Hugo***; Ortega, Hugo H.*

RESUMEN: Se evaluó la expresión de oligosacáridos en la glándula mamaria de llamas (Lama glama) durante la lactogénesis utilizando lectinas. Mediante análisis morfométrico se evaluó el diámetro nuclear de los lactocitos, diámetro promedio de los alvéolos y el porcentaje del área ocupada por la luz alveolar.

Se realizaron biopsias a 15 hembras, a los 5, 15, 30, 60 y 120 días postparto. Se utilizaron siete lectinas biotiniladas (Con-A, WGA, DBA, SBA, PNA, RCA-I, UEA-I), siguiendo protocolos preestablecidos (Método ABC).

El citoplasma del dominio apical de los lactocitos reaccionó intensamente con las lectinas WGA y RCA; y en forma moderada a Con-A, durante toda la lactogénesis. El glucocálix de los lactocitos reaccionó intensamente con SBA y PNA, en todos los períodos estudiados; desde el día 5 hasta el día 15 la reacción fue marcada para la RCA, y desde el día 15 hasta los 120 días de lactogénesis con la DBA. No hubo marcación del parénquima con UEA-I en ninguno de los períodos estudiados.

Los resultados mostraron que los hidratos de carbono se expresan de diferente manera a medida que progresa la producción láctea, lo que indica la ocurrencia de cambios biomoleculares debidos a una intensa actividad funcional.

El análisis morfométrico reveló que no se producen variaciones en el área relativa ocupada por los alvéolos, pero sí un aumento significativo (p< 0,05) en el tamaño de los alvéolos a partir del día 15 acompañado por una disminución en el tamaño de los núcleos de lactocitos, a partir de los 60 días.

PALABRAS CLAVE: 1. Llamas; 2. Glándula mamaria; 3. Lectinas; 4. Morfometría.

INTRODUCCIÓN

La llama (Lama glama) es un camélido de gran importancia económica para poblaciones que viven en las áreas montañosas de América del Sur y de relevancia estratégica en los sistemas productivos de subsistencia para los habitantes del altiplano argentino.

La importancia de esta especie radica en sus características biológicas, que le permiten su adaptación a las condiciones de la región altiplánica, haciendo de la crianza una actividad rentable en desmedro de la explotación de otras especies domésticas, cuya sobrevivencia en esta zona sería imposible.

La eficiencia en la crianza de la llama se ve seriamente afectada por el medio y depende de dos aspectos fundamentales, el porcentaje de fertilidad que alcanza entre un 40 y 60% (De Carolis, 1987), y la morbilidad/mortalidad de las crías que alcanza el 30% en las primeras semanas de vida (Raggi et al., 1995); período que coincide con la época de alimentación exclusivamente láctea, de vital importancia para un perfecto desarrollo del recién nacido.

En la glándula mamaria, los carbohidratos pueden ser localizados mediante técnicas histoquímicas específicas. La lectinhistoquímica se utiliza para el reconocimiento de los hidratos de carbono incluidos dentro de glucoconjugados y tiene una importante ventaja frente a otros métodos de estudio, ya que permite su localización in situ.

En histología y patología, las lectinas son usadas para identificar oligosacáridos presentes en glucoproteínas y glucolípidos de membranas y constituyentes celulares. En biología se han usado lectinas conjugadas con fluoresceína, enzimas, y sustancias electrodensas, para localizar y caracterizar glucoconjugados en condiciones normales y patológicas en varios tejidos (Damjanov, 1987; Danguy et al., 1988). En ratas y humanos, se han usado numerosas lectinas en tejido mamario normal en hembras lactogénicas (Louis et al., 1983; Walker, 1984; Skutelsky et al., 1988), cada una con un modelo de unión diferente según la especie estudiada y los métodos de fijación utilizados.

Hasta el momento, no se registran antecedentes de la aplicación de técnicas lectinhistoquímica para identificar gluco-conjugados en tejidos mamarios de llama, que permitan inferir sobre la calidad de los procesos biológicos durante el desarrollo, maduración, diferenciación y especialización celulares.

El objetivo principal del trabajo fue evaluar la expresión de diferentes hidratos de carbono en el tejido mamario, para intentar esclarecer e interpretar la intimidad de los procesos biológicos que se producen durante la lactogénesis en la llama. Además, a través del análisis morfométrico se pretendió comparar y establecer diferencias en variables citométricas que reflejen las modificaciones de la glándula durante este período

MATERIAL Y MÉTODO

Se utilizaron 15 hembras lactogénicas de 2 a 6 años de edad, de un hato de 230 animales, en la localidad de Corral Campo, provincia de Jujuy, Argentina (latitud: 22o 18' 14'', longitud: 66o 35' 36'', altitud: 4237 mt snm), pertenecientes a la Cooperativa Agroganadera "Cuenca del Río Grande de San Juan", Cusí-Cusí, Jujuy, Argentina.

Se realizaron biopsias a los 5, 15, 30, 60 y 120 días de lactancia, en la cara interna de los cuartos posteriores de la glándula y se extrajeron muestras de 0,5 a 1 cm, aproximadamente, mediante la técnica incisional en cuña (Withrow, 1993).

Cada muestra fue fijada en formol bufferado al 10 %, lavada con buffer fosfato salino (PBS) y procesada siguiendo protocolos de rutina, hasta su inclusión en parafina (Woods & Ellis, 1994).

Se efectuaron cortes de 4 µm de espesor y se montaron en portaobjetos tratados con Vectabond (Vector Lab. Inc.). Para los estudios morfológicos se utilizó la coloración de hematoxilina-eosina.

Las lectinas utilizadas, incluyendo su especificidad, concentración de uso y azúcares inhibidores específicos, son presentadas en la Tabla I.

Tabla I: Lectinas utilizadas, especificidad, concentraciones y azúcares inhibitorios.

Lectina Grupo
Especificidada
Concentración (µg/ml) Azúcar inhibidor
Con-A (Canavalina ensiformis) 0I a-D-Man, a-D-Glc 30 Man (0.2M)
WGA (Triticum vulgaris) .II a/ß-D-GlcNAc, NeuNAc 10 GlcNAc (0.5M)
DBA (Dolichos biflorus) III a-D-GalNAc 30 GalNAc (0.2M)
PNA (Arachis hypogea) III ß-D-Gal-(ß1à3)-D-GalNAc 30 Gal (0.2M)
RCA I (Ricinus communis) III ß-Gal 30 Gal (0.2M)
SBA (Glycine max) III a-GalNAc ; ß-GalNAc 30 GalNAc (0.2M)
UEA I (Ulex europeus) IV a-L-Fuc 30 Fuc (0.1M)

aMan = manosa; Glc = glucosa; GlcNAc = N-acetil-D-glucosamina; NeuNAc = ácido N-acetil neuramínico (ácido siálico); GalNAc = N-acetil-D- galactosamina; Gal = galactosa; Fuc = fucosa.

Los cortes fueron desparafinados y deshidratados por pasajes en xilol y etanol en concentraciones decrecientes. La peroxidasa endógena fue inactivada con peróxido de hidrógeno al 3% en metanol. Se bloquearon las uniones inespecíficas con albúmina sérica bovina (BSA) al 1%, en PBS, por 30 minutos, a temperatura ambiente.

La incubación con 7 lectinas biotiniladas (Lectin Kit I, Vector Lab. Inc.) se realizó durante 12 h a 4 oC. Posteriormente, se adicionó una solución del complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC, Vector Lab. Inc.) durante 30 minutos. El revelado se realizó con 3,3'diaminobencidina (DAB Substrate Kik, Vector Lab. Inc.) por 1 a 2 minutos.

En los controles negativos las lectinas fueron reemplazadas por BSA al 1%. La especificidad de las lectinas fue testeada mediante preincubuación de cada una de ellas con su respectivo azúcar inhibidor, durante 1 hora (Sigma Chemical Co.)

Las imágenes fueron generadas con un microscopio Olympus CH-2, con fuente de luz estabilizada y capturadas con una cámara de video SONY CCD-IRIS usando una lente objetiva D-plan de 40x. En el análisis de las imágenes se utilizó el sistema Image-Pro Plus 3.0.1.1® (Media Cybernetics, Silver Spring, MA, USA) en un procesador Pentium Intel III de 500MHz®.

Se digitalizaron 100 imágenes por cada preparado histológico, con una calidad de 16 millones de colores y una resolución de 640 X 480 píxels. A la magnificación usada (40x), cada pixel de la imagen corresponde a 0,26µm y cada campo en el monitor representa un área de 0,03mm2.

La evaluación de la técnica de lectinhistoquímica se efectuó mediante un análisis de segmentación de colores en los tonos e intensidades correspondientes a las áreas de reactividad del cromógeno utilizado, en concordancia con lo observado en los controles positivos.

Para el análisis morfométrico se cuantificaron 100 estructuras de cada tipo, evaluándose diámetro nuclear de los lactocitos, diámetro de los alvéolos y área ocupada por alvéolos.

Para detectar diferencias entre los diferentes grupos, se utilizaron las pruebas no paramétricas de Mann-Whitney y Kruskal-Wallis (Siegel, 1956).

RESULTADOS

Los estudios lectinhistoquímicos revelaron una marcación moderada del citoplasma perinuclear de los lactocitos con la Con-A, durante casi toda la experiencia, excepto los 15 días de lactancia donde esta lectina no marcó ninguna estructura celular.

El dominio apical del citoplasma de los lactocitos presentó una reactividad intensa a la marcación con WGA (Fig. 1) y RCA-I y reactividad moderada a la lectina Con-A, durante toda la lactancia.


Fig.1. (a) Citoplasma apical de los lactocitos y secreción marcados con WGA en el día 5 de la lactancia. Las áreas positivas se han identificado mediante un análisis de segmentación de color (b) (Barra = 25 µm).

En los primeros cinco días de lactancia, en el lumen de los alvéolos se observó secreción en grumos pequeños, de aspecto homogéneo, que reaccionaron intensamente con WGA (Fig. 1) y SBA; mientras que en los demás estadios evaluados, la marcación del contenido alveolar con estas lectina fue leve.

El glucocálix de las células alveolares reaccionó intensamente con SBA y PNA durante toda la lactancia (Figura 2). El glucocálix fue marcado con RCA desde el día 5 hasta el 15, mientras que la DBA marcó intensamente el glucocálix de los lactocitos, desde el día 15 al 120 de la lactancia (Fig. 3).


Fig. 2: (a) Glucocálix de los lactocitos marcados con PNA a los 120 días de la lactancia. Las áreas positivas se han identificado mediante un análisis de segmentación de color (b) (Barra = 25 µm).


Fig. 3. (a) Glucocálix de los lactocitos marcados con DBA a los 15 días de la lactancia . Las áreas positivas se han identificado mediante un análisis de segmentación de color (b) (Barra = 100 µm).

No hubo marcación para la UEA-I en el tejido secretor en ninguna de las etapas de la lactancia; sin embargo, una reactividad leve y aleatoria a esta lectina se observó en el tejido conectivo interlobulillar.

El dominio apical del citoplasma de las células epiteliales de los conductos interlobulillares reaccionó intensamente con la WGA durante toda la experiencia, no así con la lectina Con-A la reacción fue moderada. La DBA mostró reactividad marcada hasta el día 30.

Los endotelios reaccionaron con Con-A y WGA y en menor medida frente a la RCA, a lo largo de todo el período de estudio. La sustitución de las lectinas por BSA al 1% en los controles negativos, mostró la ausencia absoluta de reactividad.

El análisis morfométrico mostró que no se producen variaciones en el área relativa ocupada por los alvéolos, pero si un aumento significativo (p< 0,05) en su tamaño, a partir del día 15, acompañado por una disminución en el tamaño de los núcleos de lactocitos, a partir del día 60 de la lactancia (Tabla II).

Tabla II: Resultados del análisis morfométrico del tejido alveolar.

Día de lactancia 5 15 30 60 120
Diámetro núcleos (µm) 05,66 ± 0,33 4,92 ± 0,23 4,75 ± 0,09 04,59 ± 0,27# 04,39 ± 0,38#
Diámetro alvéolos (µm) 58,38 ± 6,45 77,32 ± 4,60# 84,74 ± 4,72# 87,76 ± 1,19# 92,36 ± 6,29#
Area ocupada por alvéolos (%)
29,37 ± 3,04
30,69 ± 3,120 29,67 ± 2,810 29,20 ± 1,670 32,93 ± 4,180
Media ± D.S. # Diferencias significativas (p<0,05) con respecto al día 5.

DISCUSIÓN

En nuestro estudio, la intensa marcación del citoplasma apical del lactocito con la WGA durante toda la lactancia, podría estar asociada con la presencia de a/ß-D-N-acetilglucosamina o ácido acetil neuramínico (NANA), azúcar terminal de la cadena de síntesis y acoplamiento de los sacáridos intracelulares, que se localiza preferentemente en la periferia del glucocálix asociado a la superficie celular (Lamblin et al., 1991).

La marcación positiva a la Con-A reveló la presencia de a-D-Manosa o a-D-glucosa en el citoplasma perinuclear y apical de los lactocitos durante toda la lactancia. En humanos, se ha informado que la marcación con la lectina Con-A es útil para distinguir células malignas y normales en tejido mamario (Louis et al.); En llamas, esta lectina no tendría el mismo significado que en humanos.

La reactividad intensa del contenido alveolar con la WGA, durante los primeros 5 días de lactancia, podría explicar la presencia en el calostro de cantidades importantes de ácido siálico y de sialo-oligosacáridos ligados a la caseína e inmunoglobulinas (Reguillón et al., 1996).

La intensa reactividad a la SBA durante los 5 primeros días de la lactancia, estaría asociada a la presencia de a/ß-N-acetilgalactosamina en el contenido de los alvéolos. En el bovino, se demostró que la mayoría de las glucoproteínas de la membrana del glóbulo graso de la leche (MFGM del inglés: milk fat globule membrane), en leche madura contienen GalNAcß1à4GlcNAc en adición a la estructura de Galß1à4GlcNAc de las cadenas de azúcares con uniones N-glucosídicas (Nakata et al., 1993; Sato et al., 1993 y 1997); y que la expresión de los niveles de oligosacáriodos ß-N-acetilgalactosaminados en las glucoproteínas de MFGM parece aumentar durante la lactancia temprana (Ujita et al., 1993).

La intensa reacción del glucocálix de los lactocitos con SBA y PNA durante toda la lactancia, indicó la presencia de a/ß-N-acetilgalactosamina, ß-D-galactosa y D-N-acetilgalac-tosamina. En ratas, se comprobó una correlación positiva entre el Arachis hypogea agglutinin (aglutinina del cacahuate; PNA) y la diferenciación de la célula epitelial mamaria (Newmann et al., 1979).

La lectina RCA marcó, específicamente, desde el día 3 hasta el día 15 de la lactancia, a la ß-galactosa y la DBA marcó intensamente la presencia de a-D-N-acetilgalactosamina en el glucocálix de los lactocitos, desde el día 15 hasta los 120 días de la lactancia.

En el tejido secretor de la llama no se comprobó la presencia de residuos de a-L-fucosa con la utilización de la UEA-I, al igual que en un estudio realizado por Castagnaro & Canese (1990) en glándulas mamarias de perras lactogénicas en donde no se observó marcación con esta lectina.

Los resultados muestran que los hidratos de carbono se expresan de diferente manera en los lactocitos a medida que progresa la lactancia, lo que indica la ocurrencia de cambios biomoleculares debidos a una intensa actividad funcional. Además, la disminución significativa en el tamaño de los núcleos de los lactocitos a partir del día 60, estaría indicando una baja en la actividad de síntesis de las células y el comienzo de su involución.

* Laboratorio de Investigaciones Histológicas Aplicadas. Cátedra de Histología y Embriología. Departamento de Anatomía e Histología. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional del Litoral. Santa Fe. Argentina.
** Cátedra de Fisiología Veterinaria. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional del Litoral. Santa Fe. Argentina.
*** Instituto de Biología de la Altura. Universidad Nacional de Jujuy. Jujuy. Argentina.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Pablo Beldoménico, por su asistencia técnica en la elaboración de este manuscrito. Al Licenciado Guillermo Casanovas de SIREX S.A., por el aporte del equipo utilizado para el análisis digital de imágenes. Al Dr. Enrique Luque del Laboratorio de Endocrinología y Tumores Hormono-dependientes (F.B.C.B. - U.N.L.), por facilitarnos parte del equipamiento para el procesamiento de los materiales.

SUMMARY: Oligosacarids expression in llama (Lama glama) mammary glands was evaluated during lactation period by means of lectins. The lactocite nuclear diameter, alveoli mean diameter and the percentage of the area occupiedby alveolar lumen were compared by morphometric analysis.

Fifteen females were biopsed on days 5, 15, 30, 60 y 120 after freshening. Seven biotynilated lectines (Con-A, WGA, DBA, SBA, PNA, RCA-I, UEA-I) were used, following the pre-established protocols (ABC Method).

Apical domain cytoplasm of lactocites reacted intensely with lectins WGA and RCA; and moderately with Con-A during the whole lactation period. Lactocites glycocalyx reacted intensely with SBA y PNA in every studied period; fromday 5 to day 15 the reaction was remarkable for RCA, and from day 15 to 120 days of lactation, it was so for DBA. There was not marking of the parenchyma with UEA-I during the whole assay length.

The results showed that carbohydrates express themselves in different ways as the lactation progresses, which indicates the occurrence of bio-molecular changes due to intense functional activity.

Morphometrical analysis revealed that there is not variation in the relative area occupied by alveoli, but it does exist a significative increase (p<0,05) in the alveolus size since day 15, together with a decrease in the lactocites nuclear  size beginning on day 60.

KEY WORDS: 1. Llamas; 2. Mammary gland; 3. Lectins; 4. Morphometry.

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Dirección para orrespondencia:
Prof. Dra. Bibiana E. Dallard
Facultad de Ciencias Veterinarias.
Universidad Nacional del Litoral.
R.P. Kreder 2805
(3080) Esperanza. Santa Fe.
ARGENTINA

Email: bdallard@fcv.unl.edu.ar

Recibido : 16-11-2000
Aceptado: 14-12-2000

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