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Revista chilena de anatomía

versão impressa ISSN 0716-9868

Rev. chil. anat. v.16 n.2 Temuco  1998

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-98681998000200007 

EXPRESION DE CITOQUERATINAS EN EL EPITELIO ORAL DE LA MUCOSA GINGIVAL HUMANA Y DE RATON

CYTOKERATIN EXPRESSION IN HUMAN AND MOUSE GINGIVAL EPITHELIA

Angélica Montenegro
Gumy C. Ibarra
Mariana Rojas

Programa de Morfología, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Chile.

MONTENEGRO, M. A.; IBARRA, G. C. & ROJAS, M. Expresión de citoqueratinas en el epitelio oral de la mucosa gingival humana y de ratón. Rev. Chil. Anat., 16(2):211-217, 1998.

RESUMEN: Utilizando la técnica de inmunoperoxidasa y un panel de anticuerpos monoclonales, se realizó un estudio para caracterizar la expresión de citoqueratinas (CK) constituyentes de los filamentos intermedios, en el epitelio de la mucosa gingival humana y de ratón.

El epitelio que reviste la encía humana varía de ortoqueratinizado a paraqueratinizado y no cornificado, predominando el paraqueratinizado. Este epitelio se caracteriza por un estrato córneo con núcleos picnóticos y un estrato granuloso pobremente definido. La expresión de citoqueratinas es ligeramente diferente del ortoqueratinizado.

El epitelio gingival ortoqueratinizado se caracteriza por la presencia de CK 1 - 10, queratinas específicas de la diferenciación tipo epidermis. En cambio el epitelio gingival no queratinizado se diferencia del queratinizado porque todas sus células suprabasales contienen las CK tipo esófago 13 y 14, pero no las de tipo epidermis. Todas las capas celulares de estos epitelios reaccionan negativamente con los anticuerpos anti CK 18 y 19.

El epitelio gingival de ratón es principalmente ortoqueratinizado y muestra un patrón de expresión de citoqueratinas similar a este tipo de epitelios.

Existen diferencias notorias en la expresión de citoqueratinas en el epitelio gingival, que están relacionadas con el grado de queratinización que puede ser comprobado histológicamente. Las citoqueratinas siguen siendo los mejores marcadores de la diferenciación epitelial en la cavidad oral.

PALABRAS CLAVE: 1. Citoqueratinas; 2. Epitelio paraqueratinizado; 3. Mucosa gingival; 4. Filamentos intermedios.

INTRODUCCION

Las citoqueratinas constituyen el principal componente del citoesqueleto de las células epiteliales, donde forman un gran grupo de filamentos intermedios cuyo diámetro oscila entre 8 y 10 nm. En la especie humana forman una compleja familia codificada por, al menos, 20 genes diferentes, cuyo peso molecular varía entre 40 y 70 kDa y su punto isoeléctrico oscila desde 5.2 a 7.8 (CREWTHER et al., 1983; STEINERT & ROOP, 1988).

Las citoqueratinas corresponden a un grupo de 19 proteínas que se caracterizan por su estabilidad y su baja solubilidad en tampones fisiológicos. Mediante métodos electroforéticos e inmunológicos con anticuerpos monoclonales, se han clasificado en 2 subfamilias: la primera comprende proteínas básicas relativamente grandes (56 a 67 kDa), numeradas de 1 a 8; mientras que la segunda está constituida por proteínas más pequeñas, más acídicas y son numeradas de 9 a 19.

Los dos grupos de citoqueratinas se comportan como heteropolímeros obligados, es decir, se requiere un miembro de cada grupo para la formación de un filamento de queratina, con excepción de la citoqueratina 19. Como consecuencia de esto, cada epitelio expresa por lo menos dos citoqueratinas diferentes. Por ejemplo, las queratinas 5 y 14 se encuentran juntas en todos los queratinocitos, la 1 y 10 están en los epitelios queratinizados, la 4 y 13 en epitelios estratificados no queratinizados y la 8 y 18 en epitelios simples. La queratina 19 aparece sola, en epitelios simples. Pero dependiendo de la complejidad del epitelio, el número y tipo de queratinas presentes puede variar (CREWTHER et al.; STEINERT & ROOP).

Se ha establecido que las citoqueratinas de bajo peso molecular (40 kDa) se encuentran en epitelios simples y glandulares, las de peso molecular intermedio en epitelios estratificados y las de alto peso molecular (~ 67 kDa) en epitelios queratinizados. Su expresión es afectada por factores ambientales y cambios patológicos (SAWAF et al., 1991).

El epitelio que tapiza la encía es un epitelio estratificado escamoso que puede tener distintos grados de cornificación, variando desde el epitelio ortoqueratinizado al paraqueratinizado y no cornificado (TEN CATE, 1994).

Las células epiteliales experimentan cambios morfológicos y composicionales a medida que migran desde la capa basal hacia la superficie y aunque, se han encontrado algunas queratinas en tejidos no epiteliales como los órganos linfoides, éstas todavía siguen siendo los mejores marcadores de la diferenciación epitelial.

En este trabajo se estudia la expresión de algunas citoqueratinas a nivel de epitelio gingival humano y de ratón.

MATERIAL Y METODO

Para este estudio se utilizaron cinco encías humanas y cinco de ratón. Las encías humanas sanas fueron obtenidas de piezas dentarias de pacientes adultos, con indicación de extracción. Las encías de ratón se obtuvieron de especímenes adultos normales, mantenidos en vivero, bajo condiciones controladas de luz, temperatura y alimentación.

Las muestras se fijaron en formol tamponado al 10%, se postfijaron en Dubosq Brasil y se procesaron por el método histológico corriente que consiste en deshidratación en alcoholes ascendentes, impregnación e inclusión en parafina, cuidando de no exceder los 60°C para no alterar los antígenos del tejido.

Se realizaron cortes seriados de 5 µm, algunos de los cuales se tiñeron con hematoxilina-eosina y azul de Alcián. Otros cortes se sometieron a la técnica de inmunoperoxidasa para identificar citoqueratinas en el epitelio de la mucosa gingival, utilizando los siguientes anticuerpos primarios:

- Anticuerpo monoclonal AE1, en una dilución de 1:200 (Sigma, producto N° C2562). Este anticuerpo es específico para identificar queratinas 1 - 10 - 13 - 16 - 18 - 19.

- Anticuerpos monoclonales antiqueratinas 18 y 19, en una dilución de 1:200 (Sigma, productos N° C7765 y C6930, respectivamente).

Para la técnica de inmunoperoxidasa, se procedió de la siguiente forma:

- Desparafinación de las muestras en baterías de xilol y posterior hidratación con alcoholes descendentes.

- Inhibición de la peroxidasa endógena del tejido con perhidrol al 3% (H2O2 al 3%).

- Digestión enzimática (tripsina al 0.1% en cloruro de calcio a pH 7.8).

- Bloqueo con suero de bovino no inmune diluido 1:20 (Dako).

- Incubación con el anticuerpo primario diluido 1:200 para todas las citoqueratinas utilizadas, en cámara húmeda.

- Incubación con el anticuerpo secundario (antisuero biotinilado) diluido 1:400 (Zymed).

- Incubación con estreptavidina-peroxidasa diluida 1:800 (Zymed).

- Revelado con diaminobenzidina (DAB).

- Tinción nuclear de contraste con hematoxilina de Harris.

- Deshidratación, aclaramiento con xilol y montaje con entellán (Merk).

Entre cada paso se hicieron lavados en buffer fosfato (PBS) a pH 7.2, excepto entre el bloqueo con suero no inmune y el anticuerpo primario.

Para asegurar la especificidad de la reacción inmune, se realizaron controles positivos y negativos. Para el control positivo se utilizaron cortes de tejidos que, se conoce, dan positiva la reacción con los anticuerpos primarios usados. Para el control negativo se utilizaron cortes adyacentes a los tratados con el anticuerpo primario y se sometieron a la misma técnica, con la excepción que el anticuerpo primario se reemplazó por suero de ratón no inmune (Dako). En estos casos no se observó reacción positiva.

RESULTADOS

El análisis histológico de las muestras indicó que la mucosa gingival humana está constituida principalmente por un epitelio paraqueratinizado, pero que en algunas zonas puede variar a ortoqueratinizado y hacia la zona del surco gingival pierde la cornificación, pasando a constituir un epitelio no queratinizado (Figs. 1, 2, 3). La mucosa gingival del ratón en cambio, presenta un epitelio queratinizado en toda su extensión, incluyendo parte del surco gingival (Figs. 4 y 5).

Fig. 1. Corte coronal de encía humana libre. Se observa el epitelio paraqueratinizado (puntas de flechas) y no queratinizado (flechas). H&E, azul Alcián. 40 X.

Fig. 2. Encía marginal con epitelio paraqueratinizado. H&E, azul Alcián. 100X.

Fig. 3. Encía humana marginal con epitelio ortoqueratinizado. H&E, azul Alcián. 200 X.

Fig. 4. Encía libre de ratón con epitelio ortoqueratinizado (punta de flecha). Dentina (D). Surco gingival (S). H&E, azul Alcián. 200 X.

Fig. 5. Encía marginal de ratón con epitelio ortoqueratinizado (puntas de flechas). Dentina (D). Surco gingival (S). H&E, azul Alcián. 200 X.

Los resultados obtenidos con el anticuerpo AE1 se resumen en la Tabla I. Este anticuerpo no se expresa en el estrato basal en ninguno de los tipos de epitelio, pero su expresión es intensa en el estrato poliédrico o espinoso, especialmente en las capas celulares inferiores de este estrato, en las distintas variedades del epitelio gingival. El estrato granuloso es fuertemente positivo en el epitelio ortoqueratinizado, lo mismo que el estrato superficial de células aplanadas del epitelio paraqueratinizado (Figs. 6, 7, 8).

Tabla I. Patrón de tinción de las células del epitelio gingival humano con anti-queratina AE1.


 
Epitelios estratificados
 
Ortoqueratinizado
Paraqueratinizado
No queratinizado

Estrato basal --- --- ---
Estrato poliédrico +++ +++ ++
Células profundas      
       
Estrato poliédrico + ++ ++
Células superficiales      
       
Estrato granuloso +++    
Estrato plano   +++ ++
Estrato córneo +    

--- = tinción negativa; + = algunas células positivas y otras negativas
++ = todas las células positivas; +++ = todas las células fuertemente positivas

Fig. 6. Inmunoexpresión de citoqueratina AE1 en epitelio gingival humano paraqueratinizado. Se observa expresión positiva en las células inferiores del estrato poliédrico (puntas de flechas) y en el estrato plano y reacción negativa en el estrato basal. 200 X.

Fig. 7. Inmunoexpresión de citoqueratina AE1 en epitelio gingival humano ortoqueratinizado . Se observa expresión fuertemente positiva en las células inferiores del estrato poliédrico (puntas de flechas) y en el estrato granuloso (flechas) y reacción negativa en el estrato basal. 200 X.

Fig. 8. Inmunoexpresión de citoqueratina AE1 en epitelio gingival humano no queratinizado. La expresión es marcada en el estrato poliédrico (puntas de flechas). 200 X.

Con las citoqueratinas 18 y 19, el resultado fue negativo en todas las células de los distintos tipos epiteliales (Figs. 9 y 10).

Fig. 9. Inmunoexpresión de citoqueratina 18 en epitelio gingival humano paraqueratinizado. La tinción es negativa en todos los estratos celulares. 100 X.

Fig. 10. Inmunoexpresión de citoqueratina 19 en epitelio gingival humano ortoqueratinizado. Se observa tinción negativa en todos los estratos celulares. 200 X.

En el ratón, la expresión de citoqueratinas es similar a la observada en el epitelio ortoqueratinizado de la encía humana, existiendo una fuerte expresión en el estrato espinoso y en el estrato granuloso (Figs. 11 y 12).

Fig. 11. Inmunoexpresión de citoqueratinas AE1 en epitelio gingival de ratón ortoqueratinizado. Se observa tinción fuertemente positiva en el estrato poliédrico (puntas de flechas) y reacción negativa en el estrato basal. 100 X.

Fig. 12. Inmunoexpresión de citoqueratinas AE1 en epitelio gingival de ratón ortoqueratinizado. Se observa tinción fuertemente positiva en el estrato poliédrico (puntas de flechas) y reacción negativa en el estrato basal. 100 X.

Fig. 13. Distribución de citoqueratinas en el epitelio gingival de las diferentes zonas de la encía humana.

 DISCUSION

En este trabajo se utilizaron algunos anticuerpos monoclonales específicos para identificar filamentos intermedios de citoqueratinas en el epitelio gingival humano y de ratón. En general, nuestros resultados corresponden con algunos de los descritos previamente (CLAUSEN et al., 1986; SAWAF et al.).

La expresión de citoqueratinas de un epitelio está íntimamente relacionada con su estado de diferenciación. En la encía humana, cada uno de los tres fenotipos de epitelio gingival (ortoqueratinizado, paraqueratinizado y no queratinizado) mostraron un patrón de citoqueratinas característico.

En nuestro estudio, las evidencias de la expresión suprabasal de queratinas, se basaron en la reacción de la queratina AE1 que indica presencia de queratinas 1 - 10 - 13 y 16. Efectivamente, en el estrato poliédrico se observó una fuerte expresión del anticuerpo AE1, especialmente, en las células profundas de esta capa. Además, la reacción fue intensa en el estrato granuloso del epitelio ortoqueratinizado y en el estrato plano de los epitelios paraqueratinizado y no querati- nizado. En el estrato córneo la expresión fue también positiva pero menos marcada. Los anticuerpos para las queratinas 18 y 19 fueron negativos.

Estas observaciones están de acuerdo, en general, con lo descrito en otros epitelios de la cavidad oral de similares características, excepto que en este estudio se encontró mayor expresión en las células profundas del estrato poliédrico, lo que difiere de lo descrito previamente, con una mayor expresión en las células superficiales de este estrato (CLAUSEN et al., 1983, 1986; SAWAF et al.).

El epitelio oral ortoqueratinizado que se encuentra en el paladar duro, tuberosidad del maxilar, punta de las papilas filiformes y en los bordes desdentados, se caracteriza por la presencia de citoqueratinas 1 - 2 - 10 y 11, que son específicas de la diferenciación tipo epidermis. Estas citoqueratinas se expresan bien en las células superiores del estrato poliédrico y en el estrato granuloso, pero están ausentes en el estrato basal y en las células profundas del estrato poliédrico (CLAUSEN et al., 1983, 1986; MACKENZIE et al., 1991; SAWAF et al.). Además, las células suprabasales sintetizan queratinas 6 y 16 que, se supone, son marcadores de queratinocitos con alto recambio como son los del epitelio oral. En el estrato basal contienen citoqueratinas 5 y 14 que son específicas de la estratificación (Fig. 13).

El epitelio oral no queratinizado que reviste la mucosa alveolar, el surco gingival, la superficie interna de labios y mejillas, el piso de la boca, la superficie ventral y lateral de la lengua, el paladar blando y la mucosa interpapilar, expresa polipéptidos diferentes del epitelio queratinizado, donde faltan las citoqueratinas de alto peso molecular ( CLAUSEN et al., 1986). En estos epitelios, todas las células suprabasales contienen citoqueratinas 4 y 13 (como en el esófago), pero no las de tipo epidérmico 1 - 10 y 11, mientras que la capa basal contiene queratinas 5 y 14 específicas de la estratificación (SAWAF et al.).

El epitelio paraqueratinizado que reviste la encía, se caracteriza por tener un estrato córneo con núcleos picnóticos y un estrato granuloso pobremente definido. En este epitelio el patrón de citoqueratinas es algo diferente al ortoqueratinizado, ya que expresa también la citoqueratina 14 en la capa basal y 1 y 10 en las células suprabasales que son típicas de la estratificación y cornificación, respectivamente, pero además posee citoqueratina 13 que es específica de las capas suprabasales del epitelio no queratinizado (MACKENZIE et al.; LU et al., 1997; TOMAKIDI et al., 1997).

Las citoqueratinas siguen siendo los mejores marcadores de la diferenciación epitelial, en la cavidad oral en general y en la mucosa gingival en particular, ya que se ha descrito que el epitelio de unión, que es un tejido no queratinizado y no diferenciado, sintetiza queratinas 19 - 5 y 14, éstas dos últimas son específicas de la estratificación. Es el único epitelio de la cavidad oral que no sintetiza CK 4 y 13, típicas del esófago y aunque el recambio de este epitelio es muy alto, no expresa CK 6 y 16 que son propias de la hiperproliferación (MATSUYAMA et al., 1997). La presencia de CK 19, típica de epitelios simples, indica que este epitelio tiene características de un tejido de transición (TOMAKIDI et al.).

Existen diferencias notorias en la expresión de citoqueratinas en el epitelio gingival, que están relacionadas con el grado de queratinización que se observa histológicamente.

MONTENEGRO, M. A.; IBARRA, G. C. & ROJAS, M. Cytokeratin expression in human and mouse gingival epithelia. Rev. Chil. Anat., 16(2):211-217, 1998.

SUMMARY: Using immunoperoxidase technique, an established panel of antibodies was used to characterise the cytokeratin (CK) intermediate filament profile of human and mouse oral stratified epithelia from gingival mucosa.

The epithelium covering the human gingiva is a combination of orthokeratinized, parakeratinized and non-keratinized epithelia but it is mainly parakeratinized. This epithelia is characterized by a stratum corneum with pycnotic nuclei and a poorly-defined stratum granulosum. The cytokeratin pattern of this epithelium was slightly different from that of orthokeratinized epithelia.

Stratified orthokeratinized gingival epithelia is characterized by the presence of CK1 and 10, which are specific to epidermal-type differentiation. The non-keratinized gingival epithelia can be distinguished from keratinized epithelia because all the suprabasal cells contain esophageal-type CK 13 and 14 , but no epidermal-type CK 1 and 10. The parakeratinized gingival epithelia presents both CK 1 - 10 and 13 - 14. All the cell layers of these three kinds of epithelia reacted negatively with antibodies against CK 18 and 19.

The mouse gingival epithelium is mainly orthokeratinized, and it shows a similar pattern of keratin expression of this type of epithelia.

There are, distinct differences in the keratin expression of gingival epithelia which are related to the pattern of keratinization assessed histologically.

KEY WORDS: 1. Cytokeratins; 2. Epithelium; 3. Gingival mucosa; 4. Intermediate filaments.

Dirección para correspondencia:
Prof. Dra. María Angélica Montenegro
Programa de Morfología
Instituto de Ciencias Biomédicas
Facultad de Medicina
Universidad de Chile
Independencia 1027, Casilla 70079, Santiago 7, Chile
Fax 56-2- 678 6264

Recibido : 06-08-1998
Aceptado : 21-09-1998

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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