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Introducción
Las rickettsiosis son enfermedades infecciosas de carácter zoonótico, causadas por bacterias patógenas del género Rickettsia y Orientia , transmitidas al hombre a través de artrópodos vectores como garrapatas, pulgas, piojos y ácaros 1 . Actualmente son reconocidas mundialmente como enfermedades emergentes o re-emergentes 2 y su epidemiología se encuentra estrechamente relacionada con la presencia del vector específico 2 . Hasta hace pocos años, Rickettsia rickettsii era el único patógeno rickettsial transmitido por garrapatas en América; sin embargo, el avance de los métodos de diagnóstico molecular ha permitido describir nuevas especies en las últimas décadas, como es el caso de Rickettsia parkeri3 . Aunque para algunas especies de Rickettsia su patogenicidad aún no ha sido confirmada, las bacterias de este género pueden ser consideradas como potenciales patógenos 3 .
En Chile, se han identificado a la fecha tres agentes rickettsiales: Rickettsia felis , en pulgas de gato Ctenocephalides felis y Rhipicephalus sanguineus sensu lato (s.l.)4,5; “ Candidatus Rickettsia andeanae” detectada en garrapatas del género Amblyomma (i. e. Amblyomma tigrinum y Amblyomma triste ), agente del que aún se desconoce su rol patógeno para las personas o mascotas6,7 y “ Candidatus Orientia chiloensis” 8 relacionada con larvas de ácaros de la familia Trombiculidae encontrada en roedores y lesiones de personas del sur de Chile, Chiloé y Chile continental 9 .
Dieciséis especies de garrapatas duras (Ixodidae) pertenecientes a tres géneros ( Amblyomma, Ixodes y Rhipicephalus ) han sido descritas para Chile; tres de éstas parasitan a caninos domésticos: R. sanguineus s.l., A. tigrinum y A. triste. Debido a su relevancia económica, de salud pública y distribución, la mayoría de los trabajos a nivel mundial se enfocan en especies del grupo R. sanguineus s.l.10,11, cuya distribución geográfica abarca de los 50° latitud norte hasta los 35° latitud sur 12 .
En América, R. sanguineus s.l. está conformada por al menos dos linajes con distinta distribución biogeográfica y posiblemente distinta competencia vectorial 13 . El linaje tropical se encuentra relacionado filogenéticamente con garrapatas de África, mientras que, el linaje templado ( R. sanguineus sensu stricto [s.s.]), que se distribuye en localidades templadas de Argentina, Chile y Uruguay, se relaciona con garrapatas del oeste de Europa14-16.
En Chile, este complejo de especies se distribuye desde Arica en el extremo norte (18 °29’01 “S) hasta Valdivia en el sur (39 ° 49′11” S) 17,18 , siendo el último antecedente a nivel nacional documentado por Oyarzún-Ruiz y cols., (2021) que demostró su presencia en Osorno (Región de los Lagos) 19 . Anteriormente, Díaz y cols., (2018), demostraron una distribución más amplia para el linaje tropical, abarcando hasta la latitud 22°S en Chile (Argentina, 23°S; Paraguay, 25°S; Brasil, 28°S). Estos autores establecen el límite norte del linaje templado en Chile en la latitud 20°S y sugieren que las distribuciones de los linajes tropical y templado se superponen, formando una zona de transición de aproximadamente 200 km en la costa norte de Chile (desde Iquique en la Región de Tarapacá, hasta Tocopilla en la Región de Antofagasta) 20 . Además, R. sanguineus s.l. se ha registrado en San Juan Bautista, en la Isla Robinson Crusoe 21 y en Rapa Nui-Isla de Pascua 22 .
Rhipicephalus sanguineus s.l. puede ser portador de diversos patógenos bacterianos y parasitarios como Anaplasma platys, Babesia vogeli, Ehrlichia canis, Hepatozoon canis y Rickettsia spp.23,24.
Basado en los antecedentes de la presencia de garrapatas del complejo R. sanguineus s.l. en Chile insular, y hallazgos moleculares de Bartonella y Rickettsia en pulgas en Rapa Nui-Isla de Pascua 25 , nuestro objetivo fue evaluar la presencia de bacterias del género Rickettsia en garrapatas de caninos de Rapa Nui-Isla de Pascua, Región de Valparaíso.
Materiales y Métodos
Área de estudio
Rapa Nui-Isla de Pascua se encuentra en el extremo este del territorio polinésico, en el Océano Pacífico (27°09’30” S de latitud y 109°24’14” W de longitud) y forma parte del territorio nacional de Chile. Posee un clima marítimo templado cálido con un rango de temperatura mensual promedio de aproximadamente 5°C, con mínimas en julio-septiembre (aproximadamente 18°C) y máximas en enero-marzo (aproximadamente 23°C) 26 . Según registros del año 2017, la isla tiene alrededor de 7.750 residentes y los caninos criados en libertad son frecuentes 27 . Basado en registros de la Subdere (Subsecretaría de Desarrollo Regional y Administrativo) para los años 2017-2018, se estima una población de 3.200 perros con propietario en Hanga Roa (único poblado de la isla) de los cuales 81% recibe atención municipal gratuita.
Colecta de garrapatas
El muestreo de tipo dirigido se realizó durante el mes de octubre de 2018, en Hanga Roa, Rapa Nui-Isla de Pascua, donde se obtuvieron ocho garrapatas (cinco machos y tres hembras) de siete caninos sin supervisión, de un total de 20 animales sin raza definida deambulando por las calles. Las garrapatas fueron extraídas de forma manual28,29, para luego ser transportadas en alcohol al 96% y almacenadas en el Laboratorio de Parásitos y Enfermedades de Fauna Silvestre la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Concepción, Campus Chillán.
Análisis morfológicos
Las garrapatas fueron separadas por estadio utilizando una lupa y se identificaron a nivel de especie por medio de descripciones publicadas10,30.
Diagnóstico molecular
Se realizó extracción de ADN a cada espécimen colectado utilizando la técnica de isotiocianato de guanidina y fenol cloroformo 31 . Para confirmar las extracciones y además identificar genéticamente a las garrapatas, se realizó una reacción de polimerasa en cadena (RPC) convencional, donde se amplificó un fragmento parcial (~460 pares de bases [pb]) del gen ARNr de 16S mitocondrial siguiendo un protocolo establecido 32 . Para detectar ADN de Rickettsia se utilizaron los partidores CS-78 y CS-323 diseñados para anillar con un fragmento conservado de 401 pb del gen codificante para citrato sintetasa ( gltA ), presente en todas las especies de Rickettsia33 . Las muestras positivas fueron secuenciadas en ambas direcciones, editadas en el software Geneious R9 34 y posteriormente comparadas con la base de datos GenBank utilizando BLASTn (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
Análisis filogenéticos
Dos alineamientos fueron construidos con MAFFT 35 , uno para secuencias del gen ARNr de 16S mitocondrial y otro para gltA . Las relaciones filogenéticas se evaluaron con el método de máxima verosimilitud aproximada utilizando FastTree 36 . Se construyeron dos árboles utilizando el modelo generalizado de tiempo reversible (GTR por sus siglas en inglés) con cinco categorías de sitios, optimizando el análisis para verosimilitud Gamma20. Las secuencias de Rhipicephalus decoloratus (EU918193), Rhipicephalus annulatus (L34311), Rhipicephalus microplus (EU918176) y Rickettsia canadenesis Mickel (CP000409) fueron utilizadas grupo externo en ambos árboles.
Resultados
Mediante los análisis morfológicos y empleando BLASTn confirmamos el segundo registro R. sanguineus en la isla, ya que las secuencias de ADNr de 16S mitocondrial obtenidas para las ocho garrapatas de Rapa Nui-Isla de Pascua fueron 99% (379 pb) idénticas a R. sanguineus de Estados Unidos de América (MH018852). El análisis filogenético confirmó que las garrapatas colectadas en Rapa Nui-Isla de Pascua corresponden al linaje templado de esta especie, es decir a R. sanguineus s.s. ( Figura 1 ).
Figura 1 Árbol filogenético inferido para un fragmento parcial del gen ARNr de 16S mitocondrial para un subgrupo de garrapatas del género Rhipicephalus . Los valores de soporte se indican sobre o bajo las principales ramas del árbol. La secuencia generada en este estudio se encuentra marcada en negrita.
En dos garrapatas (macho y hembra) se logró amplificar el gen gltA para Rickettsia (25%) y las secuencias obtenidas fueron 100% (350/350 pb) idénticas a una secuencia de “ Ca . R. andeanae” obtenida de Amblyomma parvum en Brasil (KY402176). Los haplotipos de “ Ca . R. andaenae” recuperados de R. sanguineus s.s. de Rapa Nui-Isla de Pascua forman un clado con secuencias de “ Ca . R. andaenae” obtenidas de Ixodes boliviensis (Perú), A. parvum (Brasil) y A. triste (Chile) ( Figura 2 ). Las secuencias generadas en este estudio fueron depositadas en la base de datos GenBank con los números de acceso MZ393412 ( R. sanguineus s.s.) y MZ398137 (“ Ca . R. andeanae”).
Discusión
Los ejemplares de R. sanguineus colectados fueron identificados genéticamente y corresponden al linaje templado de esta garrapata, coincidente con el único antecedente publicado 21 , donde se registró en Rapa Nui-Isla de Pascua, una garrapata con el haplotipo D de R. sanguineus , también registrado en la zona sur de Chile. De este modo, es probable que la presencia de esta garrapata en la isla tuvo su origen en especímenes transportados desde Chile continental.
Este estudio reporta la presencia de “ Ca . R. andeanae” en R. sanguineus s.s. en Rapa Nui-Isla de Pascua. Esta bacteria pertenece al grupo etiológico de las fiebres manchadas 37 y fue descrita por primera vez en América del Sur en 2004 en A. maculatum e Ixodes boliviensis en Perú37,39. Posteriormente, fue reportada en A. parvum y Amblyomma pseudoconcolor en Argentina40,41,42 y en A. parvum de Brasil 43 . En particular, “ Ca . R. andeanae” fue el primer agente rickettsial identificado en garrapatas del género Amblyomma en Chile, específicamente en A. triste en la Región de Arica-Parinacota 6 y además en A. tigrinum en las regiones de Coquimbo y La Araucanía 7 .
En este estudio se detectó Ca . R. andeanae en dos de ocho especímenes analizados (25%) de R. sanguineus s.s., siendo éste el segundo reporte de bacterias del género Rickettsia en este complejo de especies de garrapatas en Chile, posterior al hallazgo de R. felis en la Región Metropolitana en Santiago, y en localidades urbanas y rurales de Arica, realizado por Abarca y cols., en el año 2013 5 . En este mismo estudio R. sanguineus s.l. colectados en la Región de Coquimbo y en Angol (Región de la Araucanía) resultaron negativos para “ Ca . R. andeanae”.
El único antecedente a nivel mundial de “ Ca . R. andeanae” en R. sanguineus, fue reportado por Flores-Mendoza y cols., quienes detectaron esta bacteria en dos garrapatas obtenidas de perros en Perú 44 . Por lo tanto, los resultados de nuestro estudio representarían el segundo reporte a nivel mundial y el primero para Chile.
Aun cuando “ Ca . R. andeanae ” ha sido cultivada en líneas celulares de mamíferos 45 su rol como patógeno en humanos y animales es aún desconocido. Sin embargo, es importante mencionar que varias especies de Rickettsia inicialmente consideras como apatógenas fueron documentadas posteriormente como virulentas en humanos46. Por ello, toda especie de Rickettsia encontrada en un hospedero invertebrado debe considerarse a priori como potencialmente patógena.
