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Revista chilena de infectología

versión impresa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. vol.38 no.1 Santiago feb. 2021

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182021000100061 

Laboratorio e Infectología

Evaluación de spoligotyping a partir de baciloscopías como metodología alterna e independiente de cultivo para la genotipificación de Mycobacterium tuberculosis

Evaluation of spoligotyping-smear sputum as an alternative and culture-independent methodology for Mycobacterium tuberculosis genotyping

Nancy Montserrat Alvarez-Corrales1 

Lelany Pineda-García1 

Jorge Alberto  Carrasco Cáceres1 

Paula Yessenia  Aguilar Molina1 

1Universidad Nacional Autónoma de Honduras.

Resumen

Introducción:

Tuberculosis (TBC) sigue siendo la segunda causa de muerte por una enfermedad infecto-contagiosa después del síndrome de inmunodeficiencia humana adquirida (SIDA). Actualmente, el escenario de técnicas y metodologías de laboratorio para la identificación y drogo-sensibilidad está cambiando gradualmente. Se han recomendado e introducido ensayos rápidos basados en la amplificación de ácidos nucleicos (NAAT's) que se desarrollan mediante la reacción de polimerasa en cadena (RPC). Bajo este principio, se destaca spoligotyping –una herramienta de genotipificación y epidemiología molecular en TBC– estandarizada a partir de aislados bacterianos, que permite el estudio del genoma de Mycobacterium mediante la amplificación de 43 secuencias cortas no repetitivas, localizadas en la región de repetición directa (RD1).

Objetivo:

Evaluación de spoligotyping a partir de baciloscopías, como una opción independiente de cultivo, para la caracterización de Mycobacterium tuberculosis a partir de muestras de esputo en pacientes del Instituto Nacional Cardiopulmonar de Tegucigalpa, Honduras.

Método:

De 37 pacientes con cultivo (y baciloscopía) positivos para M. tuberculosis, se obtuvieron 50 muestras de expectoración. Se realizó estudio microbiológico y molecular en muestras respiratorias conteniendo ADN de micobacterias, a partir de baciloscopías, concentrados y cultivo, para la identificación y análisis genotípico a través de la técnica de spoligotyping.

Resultados:

El spoligotyping fue positivo en 37/37 de muestras de cultivo positivo (S: 100%), en 36/37 (S: 97,3%) de muestras con baciloscopía positiva y en 6/10 (S: 60%) de muestras de concentrado de esputo. La intensidad de la baciloscopía positiva tuvo una relación directa con la sensibilidad de spoligotyping.

Discusión:

El fusionar el potencial de una herramienta útil en epidemiología molecular para analizar muestras de ADN proveniente de baciloscopías, visualiza una plataforma diagnóstica y genotípica para países en vías de desarrollo como una alternativa innovadora y altamente sensible en la hibridación de oligonucleótidos específicos a partir material genético en baciloscopías (P+, P++, P+++), pero requiere mejorar la concordancia entre patrones genéticos obtenidos, comparables con el uso estandarizado de aislados de cepas de M. tuberculosis.

Palabras clave: tuberculosis; spoligotyping; baciloscopía; esputo; Honduras

Abstract

Background:

Tuberculosis (TB) remains as the second cause of death by an infectious disease preceded by the acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Currently, laboratory techniques and methodologies of diagnosis and drug susceptibility testing are constantly changing. Therefore, it has been recommended the introduction of rapid assays based on the amplification of nucleic acids test (NAAT's) through a polymerase chain reaction (PCR). Based on this principle, outstands spoligotyping - as a genotype and molecular epidemiology tool in tuberculosis – it is standardized to use isolated bacteria for the study of Mycobacterium genome through the amplification of 43 non-repetitive sequences, located at the direct repetitive region 1 (RD1).

Aim:

Evaluation of spoligotyping from acid fast staining smears as an independent option from bacterial isolation to characterize Mycobacterium tuberculosis by using sputum samples from TB patients from National Cardiopulmonary Institute in Tegucigalpa, Honduras.

Method:

Of 37 patients with positive culture (and smear microscopy) for M. tuberculosis, 50 expectoration samples were obtained. Microbiological and molecular tests were performed in respiratory samples containing mycobacterial DNA from sputum smears, concentrates and solid culture, for identification and genotype analysis by spoligotyping technique.

Results:

Spoligotyping was positive in 37/37 of positive culture samples (S: 100%), in 36/37 (S: 97.3%) of smear-positive samples and in 6/10 (S: 60%) of concentrate samples sputum. The intensity of positive smear microscopy had a direct relationship with the sensitivity of spoligotyping.

Discussion:

This study combined the potential of a molecular epidemiology tool to analyse DNA from sputum samples in smears acid fast staining, it visualizes diagnosis and genotyping platform in developing countries gathering innovation and high sensitivity in the hibridization of specific olignonucleotides from positive smears (P+, P++, P+++). However, the low specificity showed the need to improve better agreement among genetic patterns compared to the standardized bacterial isolation from M. tuberculosis strains.

Keywords: tuberculosis; spoligotyping; acid fast staining; smear sputum; Honduras

Introducción

Mundialmente, la tuberculosis (TBC) afecta 10,4 millones de personas al año, y mata alrededor de 1,8 millones13. Uno de los principales retos para el control mundial de la TBC es el diagnóstico oportuno para evitar la transmisión de la enfermedad entre los pacientes.

En Honduras, el diagnóstico primario de la TBC suele recaer sobre la evaluación microscópica y correlación clínica. La evaluación de baciloscopía continúa siendo la técnica de menor costo y es la prueba de discriminación en el laboratorio más utilizada en todo el mundo. Asimismo, el cultivo en medios con base de huevo es ampliamente utilizado y tiene mayor sensibilidad que la microscopía; sin embargo, tiene limitaciones en cuanto al alcance y sostenibilidad del mismo en los laboratorios del país4,5.

Para disminuir la incidencia de la TBC en el mundo, en los últimos años se han desarrollado diversas formas diagnósticas, entre ellas la modificación de metodologías básicas de baciloscopía y cultivo, otros ensayos como los serológicos e inmunológicos, enzimáticos y técnicas de identificación y tipificación molecular para Mycobacterium tuberculosis6. La evolución diagnóstica ha profundizado en la detección de genotipos, patrones de resistencia y linajes que mejoran la comprensión, manejo y control de casos79.

La carencia o acceso limitado a dichas metodologías conduce a un retraso en el diagnóstico temprano, así como en el tratamiento oportuno de los pacientes. En Honduras, existen obstáculos que incluyen el costo y acceso al diagnóstico, junto al tiempo de crecimiento prolongado de las micobacterias in vitro. Así mismo, la capacidad, espacio y equipos instalados en los laboratorios del sistema de salud se encuentran limitados a ciertos hospitales regionales del país10.

Desde 1997, Honduras ha contribuido con estudios de investigación mediante el uso de técnicas de epidemiología molecular capaces de detectar y rastrear la transmisión de cepas entre un paciente y otro, tales como RFLP, MIRU-VNTR y spoligotyping. Esta última metodología, descrita por Kamerbeek J. y cols., utiliza amplificación de ADN bacteriano mediante la reacción de polimerasa en cadena (RPC), para determinar el polimorfismo del locus cromosómico DR, detectando la presencia o ausencia de 43 secuencias cortas no repetitivas llamadas oligonucleótidos. Dichas herramientas diagnósticas contribuyen a los esfuerzos de control y prevención de la TBC a nivel nacional, siendo una plataforma para apoyar y fortalecer la vigilancia y epidemiología tradicional11,12.

En este estudio, se utilizó la técnica de spoligotyping partiendo de una muestra de ADN estandarizada obtenida a partir de lisados provenientes de colonias de cultivo M. tuberculosis13 - como control - para comparar la sensibilidad de la técnica utilizando muestra de ADN estandarizada a partir de lisados provenientes de baciloscopías y concentrado de cultivos, con el fin de simplificar la técnica y acortar la brecha de tiempo para la obtención del material de estudio, y a la vez, ofertar un diagnóstico oportuno. Se comparó y evaluó una técnica de epidemiología molecular, –spoligotyping- adaptada al uso de muestras de baciloscopías para demostrar por medio de ensayos de laboratorio, su aplicabilidad, reproducibilidad, efectividad y uso en nuestro contexto de país.

Métodos

Diseño del estudio

Enfoque cuantitativo con un diseño experimental y de tipo transversal, donde se desarrolla una técnica de epidemiología molecular basada en el principio de RPC14 para caracterización de cepas de M. tuberculosis, establecido para una colección de muestras de esputo colectadas durante cinco meses, desde junio a noviembre del año 2017.

Unidad de análisis

Muestras de esputo, proveniente de pacientes sintomáticos respiratorios, con expectoración por más de 15 días y sospecha clínica de TBC. Así mismo, se obtuvo información epidemiológica de registros de laboratorio bajo los estándares de anonimato, confidencialidad y aprobación ética institucional. Los pacientes son atendidos primariamente en la consulta externa u hospitalización del Instituto Nacional Cardiopulmonar (INCP) de Tegucigalpa, Honduras, y proveen la muestra de esputo al laboratorio clínico de dicho centro asistencial. El estudio de las baciloscopías realizadas en el laboratorio pueden tener el siguiente objetivo clínico: diagnóstico o control terapéutico al segundo y quinto mes, basados en las normas nacionales.

En resumen, el procedimiento se realizó de la siguiente manera:

  • Extendido, tinción Ziehl Neelsen, observación y confirmación microscópica de baciloscopías en el Laboratorio de Investigación de Enfermedades Tropicales (LIET-UNAH).

  • Cultivo de esputo, revisión y obtención de cepas realizado en el Laboratorio Nacional de Vigilancia de Tuberculosis (LNV-TB), en medios de Lowenstein Jensen, usando el método de Petroff y realizando revisiones semanales hasta su identificación bioquímica.

  • Durante el proceso de descontaminación, también se obtuvo concentrado de esputo para realización de lisados y posterior comparación.

  • Obtención de ADN de cultivo, baciloscopías y concentrado se realizó por medio de lisis celular a 95 °C durante 25 min.

  • Amplificación de ADN por RPC con cebadores específicos DRa (5’-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3’) y DRb (5’-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3’) de la región DR1 en las diversas muestras.

  • Por último, spoligotyping se realizó a cada amplicón, exponiéndose a 43 oligonucleótidos de la región DR1, inmovilizados sobre una membrana de nylon para hibridación específica y revelado en film auto-radiográfico por medio de quimioluminiscencia11.

  • Validación y uso de cepas control durante los ensayos y análisis mediante cepas de referencia de M. tuberculosis H37Rv, 14323 y M.bovis.

Análisis cuantitativo y estadístico:

Se realizó sobre las metodologías aplicadas y los tipos de baciloscopías positivas (P+++, P++, P+) realizando estimaciones de sensibilidad, así como intervalos de confianza de tipo Clopper Pearson del 95%.

El análisis de datos se realizó en varias etapas que incluye: i) la creación de base de datos en hojas de cálculo Excel; ii) elaboración de tablas, gráficos, figuras para la presentación de resultados; iii) valoración de la técnica de spoligotyping frente a concentrados de cultivo y baciloscopía; iv) análisis y comparación de códigos octales y patrones genéticos entre sí. Luego del acoplamiento y reconocimiento entre ADN y sondas de oligonucleótidos en el film auto-radiográfico, continuamos bajo los lineamientos y guías estandarizadas para crear un código que es característico de la cepa y posteriormente compararlo con bases de datos internacionales15. Para crear los códigos octales, primero se crea un código binario de 0 y 1, se coloca el número 1 donde existe la presencia de un spot y se coloca un 0 donde hay ausencia del mismo; luego es agrupado en tripletes y, por último, estos códigos se transforman en octales asignándoles un nuevo valor de cero a siete como se designa a continuación: 000 = 0, 001 = 1, 010 = 2, 011 = 3, 100 = 4, 101 = 5, 110 = 6, 111 = 7. Para nuestros fines utilizaremos estos códigos para interpretar la presencia o ausencia de reconocimiento de sondas de oligonucleótidos propias de la región DR1. El fin último de los códigos es hacer uso de los números octales para la diferenciación del complejo M. tuberculosis, como crear y comprender dendogramas y figuras capaces de analizar variaciones genéticas de las moléculas de ADN de diferentes especies o poblaciones.

Resultados

El estudio incluyó un total de 37 pacientes sintomáticos respiratorios atendidos en el INCP, quienes brindaron de forma variable entre 1 y 3 muestras de esputo bajo el esquema nacional de obtención de muestras respiratorias, para el estudio de TBC. La muestra obtenida es no probabilística, resultando en 50 muestras de esputo independientes y positivas por baciloscopía.

La distribución de género entre los participantes corresponde a 68% (n: 25) al género masculino y 32% (n: 12) al género femenino.

Los pacientes tenían como lugar de procedencia cinco departamentos de Honduras, teniendo mayor frecuencia el Departamento de Francisco Morazán (n: 29), luego Colón (n: 4), Cortés (n: 2), Comayagua (n: 1) y Yoro (n: 1).

Distribución etaria

La frecuencia de pacientes con TBC se muestra mayormente en el rango de 20-39 años (n: 15)- población en edad activamente productiva- seguido del rango de 60-79 años de edad (n: 12) y, en menor escala se encuentran (n: 7) pacientes entre 40-59 años y (n: 3) en un rango de 80-89 años de edad.

Categorización porcentual de baciloscopías

Fueron clasificadas como casos nuevos de TBC 76% (n: 28), 11% (n: 4) como pacientes antes tratados con fármacos anti tuberculosos, 11% (n: 4) con historia clínica de recaída y en 2% (n: 1) correspondía a baciloscopía de control en la segunda fase de tratamiento antituberculoso.

Las muestras de esputo se caracterizaron por ser de buena calidad, clasificándose como mucopurulenta (72%) y sanguinolenta (10%), a la vez se consideró saliva (18%) como muestra de mala calidad.

Variabilidad cuantitativa de las baciloscopías

Con el objeto de comparar la sensibilidad de detección de oligonucleótidos en ADN obtenido a partir de láminas con variabilidad cuantitativa de bacilos alcohol ácido resistentes (BAAR) presentes, se efectuó la observación microscópica de láminas (n = 50) y se les clasificó de acuerdo a la normativa nacional como: P+++ (42%, n: 21) más de 10 BAAR/campo/100 campos, P++ (28%, n: 14) 1-10 BAAR/campo/50 campos y P+ (30%, n: 15) 1-99 BAAR/100 campos).

La Tabla 1 resume la variabilidad de resultados obtenidos, así como la sensibilidad de la técnica de spoligotyping donde los 43 oligonucleótidos acoplados en una membrana son capaces de reconocer material genético obtenido a partir de lisados de cultivo M. tuberculosis positivo, lisado de concentrado y de baciloscopías, independientemente de la positividad, mostrando reconocimiento o señal (spots). Sin embargo, esa hibridación entre sondas de oligonucleótidos es inespecífica a lo largo de las 43 secuencias de repetición propias de la región DR1 de M. tuberculosis presentando un reconocimiento variado y no reproducible, a pesar de ser material genético de la misma muestra obtenido en distintos momentos del procesamiento. La alta sensibilidad y reproducibilidad de la metodología molecular se obtiene a partir del uso de cebadores específicos y cultivos puros; no obstante, se observa que en lisados de baciloscopías y concentrados el patrón de reconocimiento es inespecífico (Figura 1, Tabla 4).

Tabla 1 Detección de oligonucleótidos en la región DR1 - M. tuberculosis por medio de la técnica spoligotyping utilizando lisados de baciloscopias, concentrados y cultivos positivos 

Patrones de oligonucleótidos presentes (+) y ausentes (-) en spoligotyping usando lisados de diversas muestras Clasificación de baciloscopía
P+++
n = 18
P++
n = 12
P+
n = 7
Cultivo Spoligotyping (+) Spoligotyping (-) 18 12 7
0 0 0
Baciloscopía Spoligotyping (+) Spoligotyping (-) 17 12 7
1 0 0
Concentrado Spoligotyping (+) Spoligotyping (-) n = 9 n = 0 n = 1
5 0 1
4 0 0

Figura 1 Validación de ensayos de spoligotyping mediante la identificación y clasificación de patrones genéticos de cepas de referencia. 

Determinamos la sensibilidad de spoligotyping en el reconocimiento de oligonucleótidos a partir de lisados de cultivo, baciloscopía y concentrado, mediante parámetros de validación de una técnica, comparando los valores verdaderos positivos y falsos negativos mostrados en la Tabla 2, donde se calcula sensibilidad estimada de tipo Clopper Pearson y sus respectivos intervalos de confianza de 95% aplicado a las metodologías empleadas. Resultando en sensibilidad para cultivo: 100%, baciloscopía: 97,3% y concentrado: 60%.

Tabla 2 Sensibilidad de spoligotyping en el reconocimiento de oligonucleótidos según la metodología aplicada para la obtención de ADN 

Reconocimiento de oligonucleótidos en spoligotyping Cultivo Baciloscopía Concentrado
Oligonucleótidos presentes 37 36 6
Oligonucleótidos ausentes 0 1 4
Total 37 37 10
Sensibilidad 100% 97.3% 60%
Intervalo de confianza 95% 90,51-100 85,84-99,93 26,24-87,84

Considerando la carga bacilar en la expectoración del paciente, asociado a la baja reproducibilidad de una baciloscopía, analizamos el impacto y positividad de baciloscopía en la capacidad de detección de spoligotyping. La Tabla 3, detalla las estimaciones de la sensibilidad aplicada al tipo de metodología y según positividad de baciloscopía, considerando la variabilidad asociada al tamaño de la muestra e intervalos de confianza de 95%. Se observa un valor de sensibilidad real y elevado de 94% con un IC de 72,7-99,8% cuando corresponde al uso de material genético extraído de una baciloscopía P+++. Igualmente, se observa sensibilidad elevada en baciloscopias P++ y P+ pero con un intervalo de confianza intermedio-alto. En contraste, la sensibilidad a partir de ADN obtenido en el concentrado se ve afectado por el bajo número de muestras analizadas y la alta discordancia de patrones genéticos entre sí, resultando una sensibilidad estimada de 55% con un IC de 21,2-86,3%.

Tabla 3 Sensibilidad estimada según clasificación y variabilidad bacteriana en baciloscopía en comparación con el método de obtención de ADN para el uso de spoligotyping 

Método de obtención de lisado Tipo de positividad de baciloscopía Sensibilidad estimada (%) IC 95%
Cultivo P+++ 100 81.47-100
P++ 100 73.54-100
P+ 100 59.04-100
Baciloscopía P+++ 94 72.71-99.86
P++ 100 73.54-100
P+ 100 59.04-100
Concentrado P+++ 55 21.20-86.30
P++ - -
P+ 100 2.50-100

Al desarrollar los ensayos de spoligotyping, éstos se validaron con cepas de referencia (Figura 1) visualizando la señal complementaria entre los patrones genéticos de oligonucleótidos específicos de la región DR1 de M. tuberculosis. En la parte inferior de la Figura 1, se revela la diversidad de patrones de un mismo paciente respecto al ADN contenido en las modalidades de baciloscopía, concentrado y cultivo; dicha co-variabilidad de patrones genéticos entre sí se observó a repetición entre pacientes, reflejando baja reproducibilidad e inespecificidad en el reconocimiento de sondas.

Así mismo, la Tabla 4, señala la comparación e interpretación de los auto-radiogramas y lectura individual de cultivo vs baciloscopía respectiva, a través de dígitos binarios, permitiéndonos la obtención de códigos octales en cada ensayo de spoligotyping. Es de notar que los códigos obtenidos pertenecen al mismo paciente; sin embargo, no son semejantes entre sí, limitando así el uso de la baciloscopía y fortaleciendo el uso de aislados puros y descontaminados de M. tuberculosis.

Tabla 4 Lectura binaria y códigos octales obtenidos en el auto-radiograma de spoligotyping a partir de ADN de cultivo y baciloscopía de Mycobacterium tuberculosis correspondiente a 37 pacientes de este cohorte 

# Cultivo Baciloscopía # Cultivo Baciloscopía
1 776177607760771 775757777777771 20 777777037720771 555247637742261
2 777777607760771 775357777766671 21 700037607760771 777777777766771
3 677777607760771 No se observa spots 22 777774000060771 777777777766771
4 777775000060771 777777777776771 23 777743777760771 555347777766771
5 777777601560731 775757777776771 24 776077777760771 777777777767771
6 376177607760771 575357677766771 25 777777037720771 555347777766261
7 376177607760771 777757777766771 26 700036777560771 777776777760771
8 376177607760771 777777777776771 27 777777037700071 777777777766771
9 777777347760471 777777677760771 28 777777037700071 777757777766771
10 376177607760771 775777777767771 29 777777037720771 777777777764771
11 777737777760731 775757777760771 30 777776777760771 777756777766771
12 776177607760771 775657777777771 31 757777630760771 777777777777771
13 740701607760771 777757677760771 32 777777037700071 777777777766771
14 637760000020771 777777777777771 33 740777607760771 755357777767771
15 777777037720771 575757777767771 34 376177607760771 555347637746671
16 376177607760771 777757777767771 35 776177607760771 557347637740261
17 636377607760771 577357777766771 36 777777607760771 777777777767771
18 777777606760771 777777677760771 37 376177607760771 777777777767771
19 777777037720771 777347777767661

Discusión

La TBC es una realidad en el sistema de salud pública local, regional y global. Esta enfermedad requiere constante monitoreo, prevención y vigilancia epidemiológica que se logrará mediante la suma de esfuerzos que incluyen la detección temprana y tratamiento oportuno de los pacientes.

Una prioridad remarcable es el impacto de nuevas soluciones diagnósticas que sean económicas, prácticas y fáciles de usar e implementar en beneficio de individuos, así como en el sistema de salud pública del país cuya probabilidad de éxito está acompañado de capacidades técnicas y monetarias.

En Honduras, al igual que varios países en vías de desarrollo, la baciloscopía sigue siendo la mejor alternativa diagnóstica, siendo un método de bajo costo, fácil, rápido, pero con baja especificidad y sensibilidad16. En nuestras condiciones de país, especialmente a nivel estatal, las técnicas de tipificación molecular no son rutinarias, limitadas a ciertos grupos de riesgo poblacional y/o laboratorios con capacidad instalada. Particularmente, el spoligotyping ha sido utilizado como investigación, para detectar y monitorear la distribución de cepas circulantes del complejo de M. tuberculosis, complementando la epidemiología convencional y permitiendo el estudio de la transmisibilidad entre pacientes (Rosales, 2010, Pineda-Garcia, 1997).

Las técnicas moleculares tienen la ventaja de ser altamente sensibles y específicas en muestras con baciloscopías positivas y con un número bajo de copias de ácidos nucleicos de la secuencia blanco; no obstante, se ve afectada en muestras con baciloscopías negativas y formas extra pulmonares además de la posibilidad de contaminación cruzada en la extracción de ácidos nucleicos.

Diversos autores han desarrollado ensayos moleculares partiendo del uso de láminas de tinciones y baciloscopía de muestras respiratorias y extra-pulmonares, aplicables a la identificación, genotipificación y drogo-resistencia de M. tuberculosis y otros, aplicables al estudio de lepra y microsporidiosis bajo el mismo principio, reportando ventajas y desventajas sobre la microscopía convencional y obteniendo mejores resultados a partir de una RPC anidada para la amplificación de la secuencia blanco. El éxito de la técnica recae sobre el método de extracción, cantidad, calidad e integridad de ADN extraído19.

En 1998, van den Zander y cols., detectaron ADN del complejo M. tuberculosis en 23 muestras clínicas de tejido en parafina, diferenciando e identificando 20 de ellas. Así mismo, detectaron y genotipificaron por medio de la hibridización de 43 oligonucleótidos el complejo de M. tuberculosis en 8 de 10 baciloscopías, obteniendo patrones genéticos idénticos a aquellos obtenidos en ADN de cultivo20. Otros autores han observado en estudios similares efectuados en Belem, estado de Para, Brasil, que la genotipificación para M. tuberculosis por spoligotyping a partir de láminas de Ziehl Neelsen suele ser discrepantes en pequeña proporción entre baciloscopías y cultivo18.

El spoligotyping tiene la ventaja de detectar 20-50 nanogramos de ADN en una cepa bacteriana, mediante el uso de cebadores específicos, lo que permitiría utilizar otras muestras que tienen una cantidad más reducida de BAAR, simplificando la detección de M. tuberculosis; sin embargo, el desarrollo de ensayos y comparación de patrones de cultivo vs baciloscopía - en algunos casos- no presenta igualdad entre los resultados. El uso de cepas de referencia (14323, H37Rv, M. bovis) como controles de validación muestra sus códigos binarios y patrones de “spots” con completa certeza y calidad de los resultados.

Es notable considerar que el ADN obtenido en baciloscopías y concentrados no es completamente puro, ya que proviene de una muestra altamente contaminada y acompañada de microbiota del tracto respiratorio superior; esto se convierte en una variante importante para la especificidad y sensibilidad de la técnica17. Adicionalmente, las muestras fueron sometidas durante el procesamiento, a la exposición de alcohol acido, durante la tinción de Ziehl Neelsen, o una base de NAOH 4% durante el proceso de descontaminación, los que podrían alterar o dañar la integridad celular o del ADN si no se mantiene la neutralidad del pH, afectando el reconocimiento y revelado específico de las sondas de oligonucleótidos; esto podría interferir en crear y reproducir con certeza el patrón genético de la cepa causal de la enfermedad a partir de lisados de baciloscopía o concentrado.

El análisis de resultados de sensibilidad y concordancia entre cultivo y baciloscopía nos lleva a profundizar en una fase subsiguiente para relacionar la distribución de variantes genéticas obtenidas a partir de cepas y/o aislados bacterianos obtenidos en esta cohorte. Asimismo, se considera que la variabilidad de perfiles spoligotyping discordantes, mostrados en este estudio debe analizarse en detalle explorando infecciones mixtas, reactivaciones o re-infecciones que mediante técnicas más discriminatorias como MIRU-VNTR o RFLP-IS61107, cuyos principios de secuenciación de unidades repetitivas y patrones de RFLP basados en IS 6110 proporcionan mayor especificidad para discriminar entre aislados.

Las limitantes de este estudio radican en el número de muestras analizadas pudiéndose robustecer aún más las sensibilidades estimadas y los coeficientes de confianza establecidos. La alta sensibilidad de la técnica de spoligotyping puede variar y decrecer si se emplea ADN de lisados de concentrados. Asimismo, debe considerarse la reproducibilidad per se de la baciloscopía, variaciones en la carga bacilar en las expectoraciones del paciente, así como la observación microscópica entre operadores. La conservación y condiciones de almacenamiento de las láminas deben ser idóneas para el aseguramiento e integridad de la riqueza génica para la identificación y tipificación del complejo M. tuberculosis.

Este estudio potencia la aplicabilidad de baciloscopías positivas (P+, P++, P+++) como diana para la obtención de material genético con alta sensibilidad en la hibridación de sondas de oligonucleótidos específicos de la región DR1. Sin embargo, aunque la técnica de spoligotyping es muy sensible, no se evidencia una fuerte concordancia entre los patrones genéticos obtenidos a partir de cultivo, que es la muestra por elección y estándar de oro para desarrollar la técnica.

La caracterización y genotipificación de M. tuberculosis a través de técnicas diagnósticas moleculares fusionadas con técnicas convencionales, nos permitirán acortar la brecha en la obtención de ADN bacteriano, mayores alcances en el control de TBC de forma más rápida y pertinente, para rastrear la transmisibilidad entre pacientes, identificación de cepas circulantes, fortalecimiento del diagnóstico y vigilancia en la comunidad, grupos de riesgo y brotes. Siendo trascendental la necesidad de crear políticas nacionales y estrechas colaboraciones que permitan impulsar estas metodologías en beneficio de los pacientes en cada unidad de salud del país.

Establecimiento (s) donde se realizó el trabajo: Laboratorio de Investigación de Enfermedades Tropicales, UNAH.

Fuente de Financiamiento: Dirección de Investigación Científica (DICU/UNAH). Beca básica No 11-2017.

Agradecimientos.

A la Dirección de Investigación Científica (DICU) de la Universidad Nacional Autónoma de Honduras por el financiamiento económico para este estudio. Asimismo, a nuestros colaboradores en las instituciones estatales: Laboratorio Nacional de Referencia y Vigilancia de Tuberculosis, Laboratorio del Instituto Nacional Cardiopulmonar, Laboratorio de Inmunología, Laboratorio de Investigación de Enfermedades Tropicales y los colaboradores en Suecia, Sida/SAREC por ser parte de la capacidad instalada y base fundamental para la implementación y desarrollo de los ensayos. Agradecidos con MSc. Javier Aguilar y su aporte estadístico, y especial gratitud a los pacientes del Instituto Nacional Cardiopulmonar que son parte esencial y motivación para seguir trabajando junto a ellos.

Referencias bibliográficas

1.- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018: Executive summary [CC BY-NC-SA 3.0 IGO licence] [citado el 13 de enero de 2020]. Disponible en: URL: https://www.who.int/tb/publications/global_report/tb18_ExecSum_web_4Oct18.pdf. [ Links ]

2.- OMS. Tuberculosis Nuevas políticas y actividades de renovación tecnológica en los sistemas de cultivos líquidos: World Health Organization [citado el 13 de enero de 2020]. Disponible en: URL: https://www.who.int/tb/research/retooling/es/. [ Links ]

3.- Pestana L M S. Informe mundial sobre la tuberculosis 2016: Synopsis [gtbr2016_executive_summary_es]. OMS [citado el 13 de enero de 2020]. Disponible en: URL: https://www.who.int/tb/publications/global_report/gtbr2016_executive_summary_es.pdf. [ Links ]

4.- Organización Panamericana de la Salud. Manual para el diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis. Parte I: Normas y Guía Técnica. Parte I Baciloscopía. Oficina Regional de la Organización Mundial de la Salud 2008. https://iris.paho.org/handle/10665.2/782. [ Links ]

5.- Organización Panamericana de la Salud. Manual para el diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis. Parte II Cultivo: Normas y Guía Técnica. Oficina Regional de la Organización Mundial de la Salud 2008. https://iris.paho.org/handle/10665.2/18616. [ Links ]

6.- Pai M, Nicol M P, Boehme C C. Tuberculosis diagnostics: state of the art and future directions. Microbiol Spectr. 2016; 4 (5). doi: 10.1128/microbiolspec.TBTB2-0019-2016. [ Links ]

7.- CDC. TB genotyping 2018 [citado el 13 de enero de 2020]. Disponible en: URL: https://www.cdc.gov/tb/publications/factsheets/statistics/genotyping.pdf. [ Links ]

8.- Ei P W, Aung W W, Lee J S, Choi G E, Chang C L. Molecular strain typing of Mycobacterium tuberculosis: a review of frequently used methods. J Korean Med Sci. 2016; 31 (11): 1673-83. doi: 10.3346/jkms.2016.31.11.1673. [ Links ]

9.- Kato-Maeda M, Metcalfe J Z, Flores L. Genotyping of Mycobacterium tuberculosis: application in epidemiologic studies. Future Microbiol. 2011; 6 (2): 203-16. doi:10.2217/fmb.10.165. [ Links ]

10.- OMS. Fortalecimiento de los servicios de laboratorio y de diagnóstico de la tuberculosis: World Health Organization; https://www.facebook.com/WHO [citado el 13 de enero de 2020]. Disponible en: URL: https://www.who.int/tb/laboratory/es/. [ Links ]

11.- Rosales S, Pineda-García L, Ghebremichael S, Rastogi N, Hoffner S E. Molecular diversity of Mycobacterium tuberculosis isolates from patients with tuberculosis in Honduras. BMC Microbiol. 2010; 10: 208. doi: 10.1186/1471-2180-10-208. [ Links ]

12.- Pineda-Garcia L, Ferrera A, Hoffner S E. DNA fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis strains from patients with pulmonary tuberculosis in Honduras. J Clin Microbiol. 1997; 35 (9): 2393-7. PMID:9276422. [ Links ]

13.- van Embden J D, Cave M D, Crawford J T, Dale J W, Eisenach K D, Gicquel B, et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology. J Clin Microbiol 1993; 31 (2): 406-9. PMID:8381814. [ Links ]

14.- Kamerbeek J, Schouls L, Kolk A, van Agterveld M, van Soolingen D, Kuijper S, et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol 1997; 35 (4): 907-14. PMID:9157152. [ Links ]

15.- Dale J W, Brittain D, Cataldi A A, Cousins D, Crawford J T, Driscoll J, et al. Spacer oligonucleotide typing of bacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex: recommendations for standardised nomenclature. Int J Tuberc Lung Dis 2001; 5 (3): 216-9. PMID:11326819. [ Links ]

16.- Gordin F, Slutkin G. The validity of acid-fast smears in the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Arch Pathol Lab Med 1990; 114 (10): 1025-7. PMID: 1699506. [ Links ]

17.- Cohen T, van Helden P D, Wilson D, Colijn C, McLaughlin M M, Abubakar I et al. Mixed-strain Mycobacterium tuberculosis infections and the implications for tuberculosis treatment and control. Clin Microbiol Rev. 2012; 25 (4): 708-19. PMID:1699506. [ Links ]

18.- Furlaneto I P, Conceição E C, Brito M L de, Costa A R F d, Monteiro J J B, Gonçalves N V, et al. Genotipagem por spoligotyping de Mycobacterium tuberculosis obtidos de lâminas de Ziehl-Neelsen em Belém, Estado do Pará, Brasil. Rev Pan-Amaz Saude. 2013; 4 (1): 33-41. http://dx.doi.org/10.5123/S2176-62232013000100005. [ Links ]

19.- Rakotosamimanana N, Sylvianne Rabodoarivelo M S, Palomino J C Palomino, Martin A, Razanamparany V R. Exploring tuberculosis by molecular tests on DNA isolated from smear microscopy slides Int J Infect Dis. 2017; 248-52. doi: 10.1016/j.ijid.2016.12.005. [ Links ]

20.- van der Zanden A G, Hoentjen A H, Heilmann F G, Weltevreden E F, Schouls L M, van Embden J D. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis complex in paraffin wax embedded tissues and in stained microscopic preparations. Mol Pathol 1998; 51 (4): 209-14. doi: 10.1136/mp.51.4.209. [ Links ]

Recibido: 14 de Enero de 2020; Revisado: 23 de Noviembre de 2020; Aprobado: 27 de Noviembre de 2020

Correspondencia a: Nancy Montserrat Alvarez-Corrales, nancy.alvarez@unah.edu.hn; montseac26@yahoo.com

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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