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Introducción
Los moluscos bivalvos son un grupo de invertebrados, principalmente marinos, que constituyen recursos de importancia comercial en Chile. Estas especies se alimentan mediante nutrientes que obtienen al filtrar el agua a través de sus branquias (entre 20 y 100 litros de agua al día). Durante este proceso, los moluscos pueden retener microorganismos patógenos tales como bacterias, virus y protozoos presentes en el ambiente, los que se adhieren en el mucus secretado en esta estructura, o bien, pueden pasar hacia su tracto digestivo, acumulándose a lo largo del tiempo1. Algunos autores han reportado la presencia de distintos protozoos patógenos en bivalvos de aguas dulce y/o salada2–5, dentro de los cuales se ha identificado la presencia del coccidio intestinal Cryptosporidium sp., patógeno oportunista del ser humano.
A la fecha, se han identificado más de 20 especies del género Cryptosporidium, cuyos reservorios son el ser humano y/o diversos taxa animales6,7. En Chile, la especie prevalente en el ser humano es Cryptosporidium parvum, la que ha sido observada con mayor frecuencia en exámenes de deposición provenientes de pacientes inmunocomprometidos que presentaban cuadros de diarrea crónica8. Cryptosporidium parvum tiene como principal reservorio a bovinos, y se transmite a diferentes especies animales mediante fecalismo directo9,10. En seres humanos, puede ocasionar cuadros de diarrea aguda en pacientes inmunocompetentes y de diarrea crónica en hospederos inmunocomprometidos, para los cuales no existe un tratamiento efectivo11,12. El ooquiste, su forma infectante, es resistente a las condiciones ambientales, a las concentraciones normales de cloración del agua y desinfectantes comunes, entre otros. Bastan 10 ooquistes para generar una infección7, dosis infectante mínima que lo convierte en un microorganismo potencialmente transmisible hacia la población que consume bivalvos crudos o insuficientemente cocidos, contaminados con deposiciones humanas y/o animales13,14.
En la Región del Bío Bío, numerosos ríos y canales se encuentran contaminados con heces de origen humano y animal debido a que, durante su trayecto reciben descargas de vertederos de aguas servidas, alcantarillados y bostas de producciones animales, vehiculizándose hasta el mar y, por lo tanto, contaminando bancos naturales y cultivos artesanales de bivalvos. Además, corrientes marinas pueden arrastrar este material hacia zonas de producción y extracción de bivalvos. Estudios recientes, atribuyen a estos moluscos la utilidad de ser una herramienta idónea de monitoreo para la evaluación de calidad de agua15.
Al día de hoy, no se cuenta con antecedentes sobre la presencia de C. parvum en moluscos bivalvos de consumo habitual en Chile, por lo que, el objetivo de esta investigación fue determinar la presencia de C. parvum en muestras de bivalvos obtenidos desde bancos naturales y de centros de cultivo artesanales, ubicados en la zona costera, de la Región del Bío Bío (Chile).
Material y Método
Obtención de las muestras
La pesquisa de Cryptosporidium sp. se efectuó en ejemplares de la cholga Aulacomya ater Molina 1782, una de las especies más consumidas por la población. Veinticinco moluscos fueron extraídos desde un centro de cultivo y 30, desde un banco natural. Ambos sectores se encuentran distanciados por 9,5 Km. En ambas localizaciones desembocan cursos de agua dulce (micro esteros, canales, ríos pequeños, etc.) en cuyo trayecto recorren una zona principalmente vinculada a la agricultura y ganadería doméstica. Además, existen numerosas fuentes de aguas servidas que son vertidas directamente a estos cauces llevando este material hacia el mar.
Los especímenes fueron seleccionados de acuerdo a su tamaño (10 a 12 cm) según el criterio señalado por Food and Drug Administration de E.U.A.16. Éstos se transportaron dentro de un recipiente hermético a 4°C, al Laboratorio de Parasitología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción, para su posterior procesamiento. En este lugar los especímenes fueron identificados taxonómicamente, de acuerdo a lo señalado en bibliografía17.
Procesamiento de los ejemplares
Con posterioridad a la apertura de las valvas se hizo disección para extraer hepatopáncreas y branquias. Ambos órganos fueron macerados con mortero agregando 15 ml de tampón fosfato salino (PBS, pH 7.4) para su homogenización. Este material se dejó decantar por 12 horas a temperatura de 20 °C. Al día siguiente, y con el objetivo de pesquisar ooquistes de Cryptosporidium sp., se eliminó el sobrenadante y desde el sedimento se extrajo una alícuota para confeccionar un frotis que fue teñido con tinción Ziehl-Neelsen (TZN) según el protocolo18. Todos los sedimentos se conservaron a 4°C en etanol al 70% v/v para su ulterior estudio.
Microscopía de fluorescencia
Las muestras positivas con TZN se estudiaron mediante inmunofluorescencia directa (IFD) con el fin de identificar C. parvum. Para ello, se utilizó el anticuerpo comercial DynabeadsTM anti Cryptosporidium (J27E)® FITC de acuerdo a las especificaciones técnicas del fabricante (Thermo Fisher, EE.UU). Este anticuerpo no presenta reacción cruzada con otros protozoos parasitos ni otras especies del genero Cryptosporidium (Thermo Fisher, EE.UU).
Las muestras fueron observadas en microscopio de Epifluorescencia (Zeiss Axioplan 2) con objetivo de 40x, el que se encontraba conectado a una cámara digital (Nikon Digital Camera DXM 12000). Para su visualización en multimedia se utilizó un software asociado (Nikon ACT-1 Versión 2).
Resultados
Se analizaron 55 muestras de A. ater, provenientes de un centros de cultivos o de un banco natural (Tabla 1). Se identifico ooquistes del género Cryptosporidium sp. por TZN. El 16,4% de las muestras fue positivo, correspondiendo a 12,7% las muestras que venían desde el banco natural y 3,6% a las de zona de centro de cultivo artesanal (Figuras 1 a 3). Posteriormente, estas muestras fueron analizadas por IFD para identificar especie de C. parvum. En 14,5% se detectó estos ooquistes en las muestras (Figuras 4 a 6), lo que corresponde a 10,9% de muestras del banco natural y 3,6% de centro de cultivo. Estas muestras también fueron evaluadas por reacción de polimerasa en cadena (RPC) en tiempo real; sin embargo, no fue posible la extracción de ADN. Cabe destacar que la especificidad del anticuerpo permite identificar la especie C. parvum con alta selectividad.
Tabla 1 Identificación de C. parvum en muestras de cholga Aulacomya ater, recolectadas desde zonas costeras de la Región del Bío Bío, Chile
| Método | Total muestras (55) | (%) | Banco natural (30) | (%) | Centro de cultivo (25) | (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| TZN (+) | 9 | 16,4 | 7 | 12,7 | 2 | 3,6 |
| IFD (+) | 8 | 14,5 | 6 | 10,9 | 2 | 3,6 |
TZN (+): muestras Tinción Ziehl Neelsen positivos (Cryptosporidium sp.), IFD (+): muestras cuya inmunofluorescencia directa es positivas (Cryptosporidium parvum), (%): porcentaje de muestras positivas.
Figura 1 Ooquiste de Cryptosporidium sp. (flecha negra) en muestras de deposición obtenida desde paciente con criptosporidiosis, aumento 40x (Control positivo de TZN).
Figura 2 Ooquiste de Cryptosporidium sp. (flecha negra) en muestras de A. ater, provenientes de banco natural, aumento 40x (en TZN).
Figura 3 Ooquiste de Cryptosporidium sp. (flecha negra) en muestras de A. ater, provenientes de centro de cultivo, aumento 40x (en TNZ).
Discusión
Cryptosporidium sp. es reconocido mundialmente como un patógeno que afecta la calidad del agua en países desarrollados y en vías de desarrollo19. Su diseminación y sobrevivencia se ve favorecida por las características físico-morfológicas del ooquiste, como su tamaño (4 a 6 µm) y composición de su pared, la que le confiere tolerancia a ambientes adversos.
Este protozoo es difícil de controlar debido a su baja dosis infectante, a su amplia gama de especies hospedadoras y a un prolongado período de patencia. Por ello, el manejo de este parasitismo implica identificar todas las probables fuentes de infección para aplicar las medidas profilácticas respectivas, sobre todo para personas inmunodeprimidas. Además, de que los costos asociados al tratamiento son elevados y no son efectivos11,12,20.
Se pesquisó ooquistes de C.parvum en las muestras provenientes del centro de cultivo y del banco natural, con un porcentaje de 3,6 y 10,9%, respectivamente. Esta diferencia puede tener su origen en las diferencias geográficas de ambos terrenos. El centro de cultivo se encuentra en una caleta donde desemboca un estero, el que se origina desde un río que pasa por zonas de criaderos de distintos animales (vacas y cerdos, principalmente). El estero, antes de desembocar en la caleta, recorre un tramo de 7 km, sirviendo como fuente de extracción de agua para el consumo humano. Por otro lado, corriente abajo del estero los lugareños vierten las aguas lluvias de la misma localidad y se desconoce la posibilidad de vertimientos de aguas servidas21.
A su vez, el banco natural, se ubica en una bahía ampliada alejada de la costa. En la playa, frente al banco natural, existe descargas de aguas contaminadas, que puede ser la principal fuente de C. parvum. Este fenómeno ya ha sido observado en Canadá, España y México22,23,24 donde se encontró contaminación por Cryptosporidium sp. en áreas de cosecha de moluscos bivalvos de interés comercial. Además, para ambas zonas la cercanía de núcleos urbanos implica la realización de numerosas actividades recreacionales, entrada de escorrentía de origen fluvial. Por otro lado, existen deficiencias en tratamientos de aguas residuales que se vierten al mar y la presencia de numerosos perros en la playa25, hospederos definitivos de estos parásitos, los que podrían incidir en la contaminación de estos sectores costeros26.
La cholga como alimento, es el segundo producto bivalvo más consumido por la población después del chorito27. Si bien se describen formas de descontaminación de bivalvos a nivel industrial14, la captura artesanal no mantiene estas prácticas, porque ofrece productos frescos. Por lo cual, se necesita reforzar las medidas profilácticas individuales para evitar la infección, ya sea con campañas dirigidas a las cocinerías de la zona y a los turistas, incentivando preparaciones cocidas, a pesar de las costumbres propias de la población (consumo de mariscos crudos).
Los resultados obtenidos demuestran que A. ater recolectada desde costas chilenas, se encuentran contaminada por parásitos del género Cryptosporidium sp. Cabe destacar, un trabajo realizado en consultorios de la ciudad de Concepción28, el que indica que de 306 muestras de deposición de niños analizadas, 16% mostró positividad de ooquistes de Cryptosporidium sp. Sin embargo, según Neira y cols.8, la especie de Cryptosporidium más frecuente en deposición de personas que cursan una diarrea crónica es C. parvum; esta especie tendría importancia en salud pública. Por lo tanto, su detección es fundamental. En este trabajo, se puede observar una diferencia entre los resultados TZN positivos e IFD positivos, lo que radica en que la primera sólo detecta ooquiste del género, mientras que la IFD es específica para C. parvum, indicando que las cholgas pueden contener más de una especie parasitaria.
En cuanto a la asociación biológica entre A. ater y Cryptosporidium sp., se ha observado que este microorganismo no es capaz de multiplicarse dentro de los bivalvos, comportándose como un vehículo de C. parvum en la cadena trófica29.
Aulacomya ater es un eficiente concentrador biológico30,31, fácil de trabajar en el laboratorio, por lo que resulta un buen indicador para el monitoreo de contaminación con patógenos zoonóticos o antropozoonóticos en el medio acuático32,33. Además, es útil como un bioindicador para análisis de perturbaciones, ya que integran fluctuaciones de contaminantes en un período de tiempo largo31. También son resistentes a contaminación química y bacteriológica, por lo que son capaces de crecer en áreas con polución y acumular en sus tejidos sustancias tóxicas y microorganismos de forma proporcional a las concentraciones ambientales, como los moluscos Mytilus galloprovincialis y Corbicula japonica31,34–38, representando un método alternativo a las técnicas tradicionales para detectar enteropatógenos en muestras de agua38.
Algunas limitaciones del uso de bioindicadores son los muestreos que consumen tiempo, la información es cualitativa y se requiere experiencia para la identificación taxonómica39; además, en algunos países es establecen períodos de veda debido a que algunas especies están protegidas38.
En conclusión, se describe por primera vez la identificación de C. parvum en A. ater de las costas chilenas. Se postula que A. ater se comportaría como un vehículo de transmisión de criptosporidiosis. Por lo tanto, es necesario revisar la cobertura del alcantarillado en las zonas de cultivo de estos bivalvos, y hacer monitoreo de las corrientes marinas. Además, se deben incluir nuevas políticas que ayuden al tratamiento de aguas servidas ya que los procedimientos para la descontaminación de elementos parasitarios son diferentes a los usados para bacterias y virus. Se establece a A. ater como un organismo de monitoreo de contaminación ambiental para C. parvum. Con base a los resultados presentados, el estudio de la contaminación fecal humana y/o animal usando la detección de C. parvum en A. ater, en zonas costeras, será el foco de nuestros futuros estudios.
