Introducción

Las micosis causadas por levaduras patógenas oportunistas, son frecuentes en pacientes con diversos estados de inmunosupresión y en inmunocompetentes; su identificación es indispensable para la selección del tratamiento adecuado. La mayoría de ellas están incluidas en dos géneros: Candida y Cryptococcus, y en menor proporción: Trichosporon, Geotrichum entre otras^1,2. La identificación se hace mediante técnicas convencionales (bioquímicas, morfológicas) y moleculares (RPC), y cada una de ellas varía en sensibilidad, costo y disponibilidad³. MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry), es un método proteómico de ionización suave que fragmenta proteínas ribosomales, para obtener un espectro de masas específico para cada taxón fúngico, conocido como “huella dactilar de masas” (Protein Mass Fingerprinting)^4–8. El objetivo de este estudio fue la identificación de levaduras aisladas de micosis mediante MALDI-TOF MS y compararla con las técnicas convencionales, teniendo como referencia a la RPC (estándar de oro).

Método

Se aislaron y estudiaron 304 aislados de levaduras de pacientes del Hospital General de México “Dr. Eduardo Liceaga” de muestras procedentes de infecciones superficiales y profundas. Los primo-cultivos se realizaron en agar dextrosa Sabouraud con cloranfenicol, CHROMagar-Candida® y agar alpiste negro. Se realizaron tres tipos de identificación: 1) Método convencional (MC): pruebas micológicas y asimilación de carbohidratos (VITEK® 2YST ID-card)^9,10; 2) Identificación proteómica por MALDI-TOF MS: las levaduras fueron sembradas en agar papa dextrosa e incubados a 28°C y con no más de 48 h. Las muestras fueron analizadas con el equipo comercial MALDI-TOF Vitek-MS®, utilizando la metodología de extracción corta en placa con 0.5 pL de ácido fórmico al 25%, para romper la pared celular y 1,0 pL de la solución 3,1% v/v de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico para cristalizar las proteínas extraídas^4,6–8,10, se tomaron en cuenta las identificaciones con alto valor de concordancia (> 98%); 3). Identificación por biología molecular: se extrajo el ADN genómico de las levaduras mediante el método de fenol-cloroformo¹¹. El material genético resultante se utilizó como templado para la posterior amplificación del espaciador Transcripcional Interno (ITS), la cual es una región no codificante del ARNr, utilizando los iniciadores ITS5 e ITS4¹². Una vez verificada la presencia de los amplicones, éstos se purificaron mediante kit comercial (Wizard, Promega) y se secuenciaron por el método de Sanger en el analizador genético ABI 3130 (Applied Biosystems) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las secuencias obtenidas se compararon con los depósitos del GenBank utilizando la plataforma bioinformática BLASTn Data-base (National Center for Biotechnology Information). Dado el elevado poder discriminatorio que brinda esta herramienta molecular, se consideró como el método de referencia para la identificación definitiva de las levaduras incluidas en el presente estudio^3,13.

Resultados

En la Tabla 1, se presentan los sitios de aislamiento de las levaduras incorporadas al estudio. Los datos referentes a la identificación mediante las tres técnicas del estudio se presentan en la Tabla 2. No observamos diferencias en el diagnóstico de Candida albicans, especies no-albicans y otros hongos levaduriformes (Tabla 3).

El coeficiente Kappa entre la técnica de identificación convencional y el sistema MALDI-TOF-MS fue de 0,506, que según la evaluación de este índice mediante la escala Landis y Koch, indica una buena concordancia.¹⁴ Si tomamos este coeficiente Kappa comparando MALDI-TOF-MS con el método de referencia (RPC), MALDI-TOF-MS mantiene una excelente concordancia (0,99).

En cuanto a la sensibilidad y la especificidad de MALDI-TOF-MS para levaduras, se obtuvo sensibilidad de 94,6% (IC95%: 86,2-96,4%), y especificidad de 99% (IC95%: 92,9-99,3%). La sensibilidad y especificidad de MALDI-TOF-MS para Candida albicans alcanzó un 98,2% (IC95%: 92,7-96,2%) y 99% (IC95%: 92,5-99,8%): respectivamente. Por otro lado, la sensibilidad y la especificidad para especies no Candida albicans fue de 89,7% (IC95%: 82,9-95,3%), y 99% (IC95%: 95,6-99,2%); respectivamente. La sensibilidad y la especificidad para otros hongos levaduriformes fue de 97,3% (IC95%: 88,9-98,3%) y 99% (IC95%: 93,6-99,4%); respectivamente.

Discusión

La identificación de las levaduras en la mayoría de los laboratorios en los países en vías de desarrollo todavía se realizan por métodos convencionales. En una investigación reciente de Falci y Pascualotto, sobre la capacidad diagnóstica micológica en Latinoamérica, y el Caribe indican que sólo 19% de los laboratorios identifican por técnica proteómica, contra 71% por métodos bioquímicos estandarizados¹⁵. Su inconveniente es el costo y tiempo que consumen^2,3,9. La identificación molecular (RPC) es la más precisa y se considera de referencia^3,9. MALDI-TOF MS es una técnica útil y rápida para la identificación de diversos microorganismos⁴. Algunos autores han discutido sobre sus ventajas e inconvenientes al compararla con otras metodologías, considerándola más sensible que los métodos bioquímicos automatizados^4,7. Otros estudios indican que los resultados con la técnica MALDI-TOF MS son equivalentes a los obtenidos por técnicas de biología molecular hasta en un 95%⁹.

En cuanto a los resultados de identificación, estos son similares a los reportados por Relloso y cols¹⁶. Haciendo un análisis por grupo de levaduras, se puede interpretar que: del género Candida, se incluyeron 14 especies, la mayoría se identificaron de forma correcta, con excepción de las especies del complejo Candida-parapsilosis, es decir, C. orthopsilosis y C. metapsilosis, mientras que si identificó a C. parapsilosis (ss)^4–9,17. Debido a la alerta mundial de infecciones por Candida auris, con este sistema ya se ha reportado su identificación distinguiéndola de Candida haemulonii y de Saccharomyces cerevisiae¹⁸.

Con respecto a las tres especies de Cryptococcus (C. neoformans, C. gattii y C. albidus), fueron identificadas por ambos métodos. En las especies del género Trichosporon, no se pudo identificar a T. dermatis. El resto de levaduras, G. candidum, S. capitata, R. mucilaginosa y Prototheca wickerhamii, (alga aclorofílica patógena indistinguible de las levaduras), fueron identificadas correctamente. Los resultados fueron similares a los reportados en varios estudios comparativos^{4–9,10,19,20}.

En nuestra investigación, MALDI-TOF MS tuvo una buena correlación con las técnicas convencionales de diagnóstico, con una sensibilidad y especificidad del 94,6 y 99%; respectivamente. Lo anterior está en concordancia con otros estudios^{7,8,10,15,17,18}; aunque en nuestro estudio se realizó con una mayor diversidad de especies.

Nuestra interpretación de que algunas levaduras no fueron identificadas, es que éstas son especies que cambian al envejecer sus estructuras de reproducción anamorfa, es decir, son cepas que tienen la capacidad de formar abundantes seudohifas, hifas y/o artroconidios (este último para Trichosporon)¹⁷, y por lo tanto, presentar más de un estadio de maduración. Este efecto puede alterar la reproducibilidad del espectro y evitar una MALDI-TOF MS es un sistema que tiene la ventaja de la rapidez, y conforme se actualicen sus series de bases se incrementará su sensibilidad/ especificidad y que la mayoría de los equipos comerciales sean compatibles. En la actualidad hay nuevas variantes de esta tecnología que estarán incorporadas en un futuro cercano como son el immuno-MALDI-TOF y el MALDI-TOF IMS (imaging mass spectrometry), el primero con una fusión con las técnicas inmunológicas y el segundo otorgando dimensión de masas^10,17,19, que sin duda serán más precisas.