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Revista chilena de infectología

versión impresa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. vol.36 no.6 Santiago dic. 2019

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182019000600790 

Comunicación Breve

Evaluación de MALDI-TOF MS para la identificación de levaduras patógenas oportunistas de muestras clínicas

Evaluation of MALDI-TOF MS for the identification of opportunistic pathogenic yeasts of clinical samples

Alexandro Bonifaz1 

Fernando Montelongo-Martínez1 

Javier Araiza1 

Gloria María González2 

Rogelio Treviño-Rangel2 

Alejandro Flores-Garduño3 

Alejandro Camacho-Cruz4 

Andrés Tirado-Sánchez1 

1Laboratorio de Micología. Servicio de Dermatología. Hospital General de México. “Dr. Eduardo Liceaga”

2Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma Nuevo León (UANL), Monterrey, México

3Laboratorio de Bacteriología. Servicio de Laboratorios Centrales. Hospital General de México, “Dr. Eduardo Liceaga”

4Cepario de la Facultad de Química. Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), Ciudad de México

Resumen

La espectrometría de masas MALDI-TOF MS es una técnica rápida y sencilla para identificar microorganismos por análisis proteico. Se estudiaron 304 aislados de levaduras procedentes de micosis superficiales y profundas, con el objetivo de comparar tres métodos: convencional (bioquímico y morfológico), MALDI-TOF MS, y reacción en cadena de la polimerasa (RPC, método de referencia). Se estudiaron 24 especies con predominio de Candida spp y Cryptococcus spp. La identificación por método convencional fue de 258/304 cepas, mientras que por MALDI-TOF MS fue de: 277/304 cepas (84,8 versus 91,2%, p = no significativo). El coeficiente Kappa entre el MALDI-TOF MS y la RPC reportó una excelente concordancia (0,99). La sensibilidad y la especificidad de MALDI-TOF MS para la identificación de levaduras patógenas oportunistas de muestras clínicas fueron de 94,6% y 99%; respectivamente. MALDI-TOF MS demostró ser una herramienta de alta precisión para la identificación de levaduras patógenas.

Palabras clave: MALDI-TOF MS; Espectrometría de masas; levaduras oportunistas; extracción corta; huella dactilar de masas

ABSTRACT

MALDI-TOF MS mass spectrometry is a rapid and straightforward technique to identify microorganisms by protein analysis. The study was performed in 304 yeast isolates from superficial and deep mycoses, in order to compare three methods: conventional (biochemical and morphological), MALDI-TOF MS, and polymerase chain reaction (PCR, reference). We included 24 species with predominance of Candida spp and Cryptococcus spp. The identification by conventional methods was 258/304 strains, while by MALDI-TOF MS was: 277/304 strains (84.8% versus 91.2%, P = not significant). The Kappa coefficient comparing MALDI-TOF-MS with PCR reported excellent concordance (0.99). The sensitivity and specificity of MALDI-TOF MS for the diagnosis of opportunistic pathogenic yeasts of clinical samples were 94.6% and 99% respectively. MALDI-TOF MS is a simple, fast and reliable tool for pathogenic yeasts.

Keywords: MALDI-TOF MS; Mass Spectrometry; Opportunistic yeast; Short extraction; Protein Mass Fingerprinting

Introducción

Las micosis causadas por levaduras patógenas oportunistas, son frecuentes en pacientes con diversos estados de inmunosupresión y en inmunocompetentes; su identificación es indispensable para la selección del tratamiento adecuado. La mayoría de ellas están incluidas en dos géneros: Candida y Cryptococcus, y en menor proporción: Trichosporon, Geotrichum entre otras1,2. La identificación se hace mediante técnicas convencionales (bioquímicas, morfológicas) y moleculares (RPC), y cada una de ellas varía en sensibilidad, costo y disponibilidad3. MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry), es un método proteómico de ionización suave que fragmenta proteínas ribosomales, para obtener un espectro de masas específico para cada taxón fúngico, conocido como “huella dactilar de masas” (Protein Mass Fingerprinting)48. El objetivo de este estudio fue la identificación de levaduras aisladas de micosis mediante MALDI-TOF MS y compararla con las técnicas convencionales, teniendo como referencia a la RPC (estándar de oro).

Método

Se aislaron y estudiaron 304 aislados de levaduras de pacientes del Hospital General de México “Dr. Eduardo Liceaga” de muestras procedentes de infecciones superficiales y profundas. Los primo-cultivos se realizaron en agar dextrosa Sabouraud con cloranfenicol, CHROMagar-Candida® y agar alpiste negro. Se realizaron tres tipos de identificación: 1) Método convencional (MC): pruebas micológicas y asimilación de carbohidratos (VITEK® 2YST ID-card)9,10; 2) Identificación proteómica por MALDI-TOF MS: las levaduras fueron sembradas en agar papa dextrosa e incubados a 28°C y con no más de 48 h. Las muestras fueron analizadas con el equipo comercial MALDI-TOF Vitek-MS®, utilizando la metodología de extracción corta en placa con 0.5 pL de ácido fórmico al 25%, para romper la pared celular y 1,0 pL de la solución 3,1% v/v de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico para cristalizar las proteínas extraídas4,68,10, se tomaron en cuenta las identificaciones con alto valor de concordancia (> 98%); 3). Identificación por biología molecular: se extrajo el ADN genómico de las levaduras mediante el método de fenol-cloroformo11. El material genético resultante se utilizó como templado para la posterior amplificación del espaciador Transcripcional Interno (ITS), la cual es una región no codificante del ARNr, utilizando los iniciadores ITS5 e ITS412. Una vez verificada la presencia de los amplicones, éstos se purificaron mediante kit comercial (Wizard, Promega) y se secuenciaron por el método de Sanger en el analizador genético ABI 3130 (Applied Biosystems) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las secuencias obtenidas se compararon con los depósitos del GenBank utilizando la plataforma bioinformática BLASTn Data-base (National Center for Biotechnology Information). Dado el elevado poder discriminatorio que brinda esta herramienta molecular, se consideró como el método de referencia para la identificación definitiva de las levaduras incluidas en el presente estudio3,13.

Resultados

En la Tabla 1, se presentan los sitios de aislamiento de las levaduras incorporadas al estudio. Los datos referentes a la identificación mediante las tres técnicas del estudio se presentan en la Tabla 2. No observamos diferencias en el diagnóstico de Candida albicans, especies no-albicans y otros hongos levaduriformes (Tabla 3).

Tabla 1 Muestras biológicas y sitios de aislamiento de las levaduras del estudio 

Levadura Cantidad cepa / muestra biológica
Candida albicans 26 / LBA
12 / Orina
9 / Boca
6 / Piel
4 / Uñas
Candida dubliniensis 1 / LBA
Candida glabrata 21 / Orina
14 / Boca
8 / LBA
1 / Líquido de diálisis
Candida guilliermondii 1 / uñas
1 / piel
Candida haemuloni 1 / LBA
Candida intermedia 1 / Orina
Candida krusei 8 / Orina
3 / Mucosa nasal
2 / Boca
1 / LBA
1 / Piel
1 / Esputo
Candida lambica 2 / Sangre
Candida lipolytica 2 / Piel
1 / Boca
1 / Sangre
Candida lusitaniae 2 / Esputo
1 / LBA
Candida metapsilosis 5 / LBA
Candida orthopsilosis 6 / Uña de mano
2 / Piel
Candida parapsilosis 18 / Uñas.
10 / LBA
3 / Oído
5 / Orina
4 / Boca
1 / Piel
2 / Ojo
Candida tropicalis 27 / LBA
10 / Orina
3 / uñas
Cryptococcus albidus 1 / LCR
Cryptococcus Gatti 2 / LCR
Cryptococcus neoformans 35 / LCR
Geotrichum candidum 1 / Piel
Rhodotorula mucilaginosa 1 / Sangre
1 / Esputo
Saprochaete capitata 1 / Boca
Trichosporon asahii 3 / LBA
2 / Esputo
2 / Sangre
2 / Pelo (piedra)
Trichosporon dermatis 4 / Piel
2 / Uñas
Trichosporon inkin 7 / Pelo
Prototheca wickerhamii 1 / Líquido de ascitis

LBA = Lavado broncoalveolar. LCR = Líquido cefalorraquídeo.

Tabla 2 Identificación de levaduras oportunistas por los dos métodos y comparativo con biología molecular (RPC) 

Levaduras Especies RPC (Referencia) Métodos Método convencional MALDITOF MS
Candida albicans 57 52 56
Candida dubliniensis 1 1 1
Candida glabrata 44 42 44
Candida guilliermondii 2 1 1
Candida haemuloni 1 1 1
Candida intermedia 1 0 1
Candida krusei 16 15 16
Candida lambica 2 2 2
Candida lipolytica 4 1 3
Candida lusitaniae 3 2 3
Candida metapsilosis 5 0 0
Candida orthopsilosis 8 0 0
Candida parapsilosis 43 40 43
Candida tropicalis 40 36 38
Cryptococcus albidus 1 1 1
Cryptococcus gattii 2 2 2
Cryptococcus neoformans 35 35 35
Geotrichum candidum 1 1 1
Rhodotorula mucilaginosa 2 2 2
Saprochaete capitata 1 1 1
Trichosporon asahii 9 7 9
Trichosporon dermatis 6 0 0
Trichosporon inkin 7 6 7
Prototheca wickerhamii (Alga aclorofílica patógena) 1 1 1
Número total: 304 292 249/292 268/292
% Identificación (100) (85,3) (91,8)

Tabla 3 Reportes de identificación mediante RPC, cultivo y MALDI-TOF-MS 

Especies RPC Referencia (Estándar de oro) Identificación convencional MALDI-TOF-MS Valor de p
Candida albicans 57 52 56 NS
Especies de Candida no-albicans 170 141 153 NS
Otros hongos levaduriformes 65 56 59 NS

NS = No significativo.

El coeficiente Kappa entre la técnica de identificación convencional y el sistema MALDI-TOF-MS fue de 0,506, que según la evaluación de este índice mediante la escala Landis y Koch, indica una buena concordancia.14 Si tomamos este coeficiente Kappa comparando MALDI-TOF-MS con el método de referencia (RPC), MALDI-TOF-MS mantiene una excelente concordancia (0,99).

En cuanto a la sensibilidad y la especificidad de MALDI-TOF-MS para levaduras, se obtuvo sensibilidad de 94,6% (IC95%: 86,2-96,4%), y especificidad de 99% (IC95%: 92,9-99,3%). La sensibilidad y especificidad de MALDI-TOF-MS para Candida albicans alcanzó un 98,2% (IC95%: 92,7-96,2%) y 99% (IC95%: 92,5-99,8%): respectivamente. Por otro lado, la sensibilidad y la especificidad para especies no Candida albicans fue de 89,7% (IC95%: 82,9-95,3%), y 99% (IC95%: 95,6-99,2%); respectivamente. La sensibilidad y la especificidad para otros hongos levaduriformes fue de 97,3% (IC95%: 88,9-98,3%) y 99% (IC95%: 93,6-99,4%); respectivamente.

Discusión

La identificación de las levaduras en la mayoría de los laboratorios en los países en vías de desarrollo todavía se realizan por métodos convencionales. En una investigación reciente de Falci y Pascualotto, sobre la capacidad diagnóstica micológica en Latinoamérica, y el Caribe indican que sólo 19% de los laboratorios identifican por técnica proteómica, contra 71% por métodos bioquímicos estandarizados15. Su inconveniente es el costo y tiempo que consumen2,3,9. La identificación molecular (RPC) es la más precisa y se considera de referencia3,9. MALDI-TOF MS es una técnica útil y rápida para la identificación de diversos microorganismos4. Algunos autores han discutido sobre sus ventajas e inconvenientes al compararla con otras metodologías, considerándola más sensible que los métodos bioquímicos automatizados4,7. Otros estudios indican que los resultados con la técnica MALDI-TOF MS son equivalentes a los obtenidos por técnicas de biología molecular hasta en un 95%9.

En cuanto a los resultados de identificación, estos son similares a los reportados por Relloso y cols16. Haciendo un análisis por grupo de levaduras, se puede interpretar que: del género Candida, se incluyeron 14 especies, la mayoría se identificaron de forma correcta, con excepción de las especies del complejo Candida-parapsilosis, es decir, C. orthopsilosis y C. metapsilosis, mientras que si identificó a C. parapsilosis (ss)49,17. Debido a la alerta mundial de infecciones por Candida auris, con este sistema ya se ha reportado su identificación distinguiéndola de Candida haemulonii y de Saccharomyces cerevisiae18.

Con respecto a las tres especies de Cryptococcus (C. neoformans, C. gattii y C. albidus), fueron identificadas por ambos métodos. En las especies del género Trichosporon, no se pudo identificar a T. dermatis. El resto de levaduras, G. candidum, S. capitata, R. mucilaginosa y Prototheca wickerhamii, (alga aclorofílica patógena indistinguible de las levaduras), fueron identificadas correctamente. Los resultados fueron similares a los reportados en varios estudios comparativos49,10,19,20.

En nuestra investigación, MALDI-TOF MS tuvo una buena correlación con las técnicas convencionales de diagnóstico, con una sensibilidad y especificidad del 94,6 y 99%; respectivamente. Lo anterior está en concordancia con otros estudios7,8,10,15,17,18; aunque en nuestro estudio se realizó con una mayor diversidad de especies.

Nuestra interpretación de que algunas levaduras no fueron identificadas, es que éstas son especies que cambian al envejecer sus estructuras de reproducción anamorfa, es decir, son cepas que tienen la capacidad de formar abundantes seudohifas, hifas y/o artroconidios (este último para Trichosporon)17, y por lo tanto, presentar más de un estadio de maduración. Este efecto puede alterar la reproducibilidad del espectro y evitar una MALDI-TOF MS es un sistema que tiene la ventaja de la rapidez, y conforme se actualicen sus series de bases se incrementará su sensibilidad/ especificidad y que la mayoría de los equipos comerciales sean compatibles. En la actualidad hay nuevas variantes de esta tecnología que estarán incorporadas en un futuro cercano como son el immuno-MALDI-TOF y el MALDI-TOF IMS (imaging mass spectrometry), el primero con una fusión con las técnicas inmunológicas y el segundo otorgando dimensión de masas10,17,19, que sin duda serán más precisas.

Financiamiento: Para la realización de este trabajo no se contó con ningún soporte económico. Informamos que este trabajo fue sometido y aceptado por el comité científico y de ética de nuestro hospital, quedando registrado con el número: DI/15/109/03/30.

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Recibido: 09 de Diciembre de 2018; Aprobado: 15 de Octubre de 2019

Correspondencia a: Alexandro Bonifaz, Hospital General de México. a_bonifaz@yahoo.com.mx

Conflictos de interés: Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés.

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