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Revista chilena de infectología

versión impresa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. vol.28 no.5 Santiago oct. 2011

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182011000600001 

Rev Chil Infect 2011; 28 (5): 399-403

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Susceptibilidad in vitro a anidulafungina en 100 cepas de especies de Candida aisladas previo a la introducción de esta equinocandina en Chile

In vitro andulafungin susceptibility of 100 of Candida strains obtained previously to the introduction of this echinocandin in Chile

 

Claudio Alburquenque O., Viviana Silva A., Milenko Fuentes G., Cecilia Tapia C. y Víctor Silva V.

Universidad Mayor, Santiago, Chile. Facultad de Medicina (CAO, VSA, MFG, VSV).
Universidad de Chile, Santiago, Chile. Facultad de Medicina (CTC).

Dirección para Correspondencia


Fungi, particularly yeasts, have become important opportunistic pathogens that can be resistant to antifungal agents or develop resistance. To address this problem, new molecules such as echinocandins, have been developed. Susceptibility to anidulafungin was studied in yeasts isolated previous to the introduction of this drug in Chile. One hundred strains of different yeast species isolated from invasive fungal infections during 2007 and 2008 were studied. Susceptibility testing of anidulafungin was performed by broth microdilution according to CLSI. All strains were susceptible to anidulafungin. MIC50 and MIC90 were 0.125 µg/mL and 1 µg/mL, respectively. Compared to other yeasts, C. parapsilosis showed a slight increase in the MICs for anidulafungin (MIC50, 1 µg/mL, MIC90, 2 µg/mL), but remained within the susceptible range. Both, fluconazole resistant (8) and dose dependant susceptible strains (16) were susceptible to anidulafungin. In vitro, this echinocandin appears to be an effective therapeutic alternative.

Key words: Antifungal susceptibility, yeasts, anidulafungin, equinocandin.


Resumen

Los hongos, especialmente las levaduras, se han transformado en importantes patógenos oportunistas y algunos de ellos tienen o desarrollan resistencia a los antifúngicos. Para enfrentar esta problemática se han desarrollado nuevas moléculas, como las equinocandinas. Este trabajo evaluó la susceptibilidad in vitro a anidula-fungina en levaduras obtenidas previo a la incorporación de este antifúngico en Chile. Para ello, se seleccionaron 100 cepas de diversas especies aisladas de enfermedad fúngica invasora durante los años 2007 y 2008 en Chile, a las cuales se les midió la susceptibilidad in vitro por micro-dilución en caldo para anidulafungina según CLSI. Todas las cepas fueron sensibles a anidulafungina con CIM50 y CIM90 de 0,125 µg/mL y 1 µg/mL, respectivamente. Se detectó un ligero aumento de las CIM en C. parapsilosis respecto a las otras levaduras (CIM50 de 1 µg/mL y CIM90 de 2 µg/mL) considerándose estos valores en el rango de sensibilidad. La correlación de la susceptibilidad frente a fluconazol evidenció que cepas resistentes (n: 8) y sensibles dosis dependientes (n: 16) fueron sensibles a anidulafungina. Esta equinocandina aparece, in vitro, como una alternativa terapeutica efectiva frente a las levaduras aisladas en nuestros pacientes.

Palabras clave: Susceptibilidad antifúngica, levaduras, anidulafungina, equinocandina.


 

INTRODUCCIÓN

Desde hace tres décadas los hongos han emergido como importantes agentes de infecciones oportunistas, que afectan especialmente a pacientes inmunocomprometidos1,2. El incremento de las enfermedades fúngicas invasoras (EFI) se ha mantenido constante en el ambiente hospitalario, debido fundamentalmente a un mayor número de pacientes con patologías de riesgo, tales como leucemias, cáncer con neutropenia inducida, pacientes con trasplante de precursores hematopoyéticos sometidos a terapias inmunosupresoras y pacientes con SIDA, entre otros3. Dentro de los agentes productores de micosis en este tipo de pacientes, la especie más frecuentemente aislada es Candida albicans; sin embargo, otras especies como C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis y C. krusei se han descrito como agentes causales de candidiasis en distinta frecuencia, siendo algunas de ellas resistentes a algunos antifúngicos2,4. En este contexto, se ha descrito la presencia de resistencia secundaria en cepas de Candida expuestas a fármacos fungistáticos como los azoles y el aislamiento de especies intrínsecamente resistentes a determinados antifúngicos como C. krusei5-6.

En Chile, estudios de vigilancia han descrito un aumento de aislamiento de especies de Candida no-albicans en infecciones fúngicas en general7-9. Estos datos concuerdan con otros estudios de vigilancia en Norteamérica y Latinoamérica, donde se ha observado que las especies de C. no-albicans, presentan cambios epidemiológicos continuos en su frecuencia con una tendencia al aislamiento de especies más resistentes a los antifúngicos2,10.

Para poder superar esta situación, en los últimos años se han desarrollado agentes antifúngicos de la clase equinocandinas, los cuales actúan por inhibición de la síntesis de 1,3-β-D-glucano en la pared celular fúngica11,12. Los antifúngicos de esta clase, como anidulafungina, caspofungina y micafungina, poseen actividad contra muchas especies del género Candida, incluyendo cepas resistentes a polienos y a azoles, transformándose en una excelente alternativa terapéutica frente a cepas resistentes a otros antimicóticos13-15. Los integrantes de esta familia de antifúngicos tienen una alta actividad in vitro asociada con una baja toxicidad en el tratamiento de infecciones graves por Candida16,17. Entre estos fármacos, anidulafungina ha sido aprobada en Estados Unidos de América por la FDA (Food and Drug Administration) en el año 2006 para el tratamiento de la candidiasis invasora, incluyendo candidemia18.

En el presente trabajo se evaluó por primera vez en Chile la susceptibilidad in vitro a anidulafungina en distintas especies de levaduras aisladas de pacientes con diagnóstico de EFI entre 2007 y 2008, previo a la incorporación de este fármaco en nuestro medio.

MATERIAL Y MÉTODOS

Cepas de levaduras. Se estudiaron 100 aislados, representativos de 100 pacientes entre los años 2007 y 2008 del programa IFI (Infecciones Fúngicas Invasoras)* de la Universidad Mayor/ Universidad de Chile y el Instituto de Salud Pública de Chile (ISP). Buscando una representati-vidad en la diversidad de especies de levaduras aisladas en nuestro medio, se procedió a seleccionar aislados de Candida albicans (n: 33), C. parapsilosis (n: 26), C. glabrata (n: 19), C. tropicalis (n: 9), C. lusitaniae (n: 5), C. krusei (n:4), C. guilliermondii (n: 2), C. rugosa (n: 1) y Saccharomyces cerevisiae (n: 1), elegidos al azar entre las cepas de cada una de las respectivas especies mantenidas en el cepario, independientes de su patrón de sensibilidad previa. Se recolectaron los principales antecedentes demográficos de los pacientes registrados en fichas ad-hoc, como tipo de muestra, edad de los pacientes, considerando niños a pacientes hasta 15 años de edad. Las cepas fueron recuperadas de su crio-conservación en leche descremada al 20% a -20°C. Cada cepa fue repicada en agar Sabouraud glucosado y medio cromogénico (ChromAgar Candida®), siendo incubadas entre 24 y 48 hrs a 37 °C. Esta siembra se repitió tres veces antes de realizar los estudios, para garantizar el crecimiento exponencial en la mayoría de los individuos del cultivo.

Identificación de levaduras. Las especies de levaduras se identificaron según procedimientos estándares empleados en micología médica, analizando las características fisiológicas, morfológicas y bioquímicas de las levaduras, empleando prueba de tubo germinal en plasma fresco humano, microcultivo en agar maíz con tween 80 al 1% y galerías API 32C (Biomerieux), respectivamente7,19,20.

Medición de la concentración inhibitoria mínima. Las 100 cepas incorporadas, presentaban estudio previo de susceptibilidad in vitro frente a anfotericina B, fluconazol, voriconazol y caspofungina mediante método de difusión por discos (Neosensitab, ROSCO®) y/o E-test®21-25. Las cepas fueron sembradas en agar Sabouraud glucosado e incubadas por 18 hrs antes de los ensayos. La susceptibilidad a anidulafungina fue determinada por microdilución en caldo según el documento M27-A2 de la CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute)26, utilizando como control las cepas C. krusei ATCC 6258 y C. parapsilosis ATCC 2201927. En resumen, anidulafungina (ECALTA® Pfizer) se obtuvo en su presentación original en polvo, diluyendo el fármaco en dimetil sulfóxido (DMSO), obteniendo una concentración de 1,6 mg/mL. Luego se realizaron diluciones en RPMI 1640 con L-glutamina y tamponado con MOPS (Sigma Aldrich®), para finalmente cargar la micro-placa con 100 µg/mL de las distintas concentraciones entre 32 Hg/mL a 0,0625 µg/mL. Las levaduras en estudio fueron preparadas en agua destilada estéril a una concentración inicial de 1-5 x 106 ufc/mL posteriormente diluidas 1:50, para finalmente diluirlas en RPMI 1640 con L-glutamina y MOPS (1:20). Luego se agregó 100 µg/mL del inóculo en las microplacas que contenían las distintas concentraciones del fármaco. La concentración final de las levaduras en cada pocillo fue de 0,5-2,5 x 103 ufc/mL. Como control de crecimiento se utilizó el solvente más inóculo en el caldo de cultivo y el control negativo fue agua destilada. Consideramos sensibilidad a anidulafungina si la cepa presentó valores CIM ≤ 2 µg/mL17

RESULTADOS

Los principales datos de los pacientes asociados a las cepas seleccionadas son predominio de la especie C. glabrata en adultos con 18 aislados en comparación con una cepa recuperada de niño. Por otra parte, las cepas de C. parapsilosis correspondieron principalmente a aislados de niños (n: 17) respecto de los adultos (n: 9). La mayoría de las cepas provino de hemocultivos (n: 72), seguida de cultivo de catéteres (n: 10) y líquidos peritoneales (n: 7) entre otros (n: 11).

Todas las cepas analizadas, presentaron CIM a ani-dulafungina con valores ≤ 2 µg/mL. La concentración necesaria para inhibir el crecimiento de la mitad de las cepas estudiadas (CIM50) fue de 0,125 µg/mL y para inhibir el 90% de las cepas (CIM90) correspondió a 1 µg/mL. Al analizar los datos por especie, observamos que las 33 cepas de C. albicans mostraron las menores CIM50 y CIM90. Las demás especies de Candida spp, presentaron valores de CIM50 y de CIM90, en valores considerados sensibles, incluyendo a C. parapsilosis (Tabla 1).

Al comparar la interpretación de la susceptibilidad in vitro de las cepas estudiadas para anidulafungina, con los datos obtenidos previamente frente a fluconazol, se observa que las 16 cepas catalogadas como Sensible Dosis Dependiente (SDD), así como las ocho resistentes al azólico (4 C. krusei y 4 C. glabrata), presentaron CIM iguales o inferiores 0,5 µg/mL para esta equinocandina (Tabla 2).

DISCUSIÓN

Las levaduras del género Candida, son importantes agentes de infecciones oportunistas, principalmente en pacientes inmunodeprimidos o portadores de factores predisponentes, transformándose hoy en actores frecuentes de morbi-mortalidad, asociándose un cambio continuo y particular a cada región geográfica o tipo de hospital con la etiología y patrón de susceptibilidad2,3,7,10, en coincidencia con un aumento gradual de la resistencia, principalmente en cepas de Candida no-albicans 4-6,16.

En estudios previos en nuestro país, se ha identificado a C. albicans como la especie prevalente en todo tipo de candidiasis, incluyendo EFI donde se ha reportado en aproximadamente la mitad de las candidemias7,8 ha prevalecido el serotipo A en adultos distribuyéndose homogéneamente los serotipos A y B en niños19. En este estudio, C. albicans correspondió a 33% de las cepas estudiadas, con el objetivo de poder disponer de un mayor número de cepas de las especies de C. no-albicans, las cuales han mostrado una mayor relación con resistencia antifúngica2,4-7,16.

El estudio de la susceptibilidad in vitro a anidulafungina evidenció 100% de sensibilidad, resultado comparable con un estudio de Pfaller y cols (2008), donde se analizaron 5.346 cepas con 98,8% de sensibilidad. Del total de cepas analizadas, la CIM50 y la CIM90 reflejan in vitro un rango para uso terapéutico seguro, siendo comparable con el estudio previamente mencionado, donde los valores de CIM50 y CIM90 fue de 0,06 y 2 µg/mL, respectivamente17.

El análisis de CIM por especies de levaduras frente a anidulafungina, evidencia que C. albicans presenta los menores valores de CIM50 y CIM90. Aunque C. parapsilosis evidenció los mayores valores de CIM50 y CIM90 entre las distintas especies analizadas, éstos se encuentran en los niveles considerados sensibles para este fármaco. Este fenómeno, particular a ciertas especies de levaduras, se presenta en todas las equinocandinas y se debería a efectos biológicos particulares de esta especie en la técnica de dilución en caldo16,17,28,29.

Otro aspecto interesante de exponer es el patrón de sensibilidad observado en C. krusei (especie intrínsecamente resistente a fluconazol) y C. glabrata (especie que desarrolla resistencia secundaria a fluconazol), cuyas cepas presentaron CIM ≤ 0,5 µg/mL frente a anidulafungina, demostrando ser una buena alternativa terapéutica frente a ambas especies, en concordancia con estudios previos16,18,29. La mejor actividad antifúngica in vitro de anidulafungina observada en estas cepas puede ser explicada por su mecanismo de acción, el cual interviene en la síntesis del componente 1,3-β-D-glucano en la pared celular fúngica11,12; en cambio, fluconazol actúa interrumpiendo la síntesis de ergosterol en la membrana celular, específicamente inhibiendo la acción de la enzima 14 a-desmetilasa5,6. Esta complementariedad de sitios de acción podría respaldar la aplicación in vivo de asociaciones de antimicóticos en ciertas condiciones clínicas, como candidemias, candidiasis aguda de diseminación hematógena y candidiasis hepato-esplénicas, entre otras30.

El presente estudio es el primero en Chile en evaluar la susceptibilidad in vitro de levaduras de interés clínico frente a anidulafungina, demostrando 100% de sensibilidad in vitro a esta equinocandina, lo que confirma su efectiva acción frente a estos agentes, incluso sobre cepas resistentes a fluconazol. Las cepas incluidas fueron aisladas antes de disponer de anidulafungina en nuestro medio, por lo que sugerimos repetir este análisis con cepas aisladas post incorporación de este antifúngico al mercado chileno, para evaluar la evolución en su patrón de sensibilidad.

Agradecimientos. Se agradece a Pfizer® Chile por el aporte del antifúngico anidulafungina para este estudio.

NOTAS

*      Nota del Editor: Nomenclatura reemplazada hoy en día por: enfermedad fúngica invasora.

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Los autores declaran no tener conflictos de interés. Trabajo Financiado con aportes de la Universidad Mayor.

Recibido: 20 de enero de 2011 Aceptado: 20 de mayo de 2011.

Correspondencia a: Víctor Silva V victor.silva@umayor.cl.

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