Rev Chil Infect 2010; 27(3): 235-236

REVISTA DE REVISTAS

Dilución en agar y Vitek 2 en resistencia inducible a clindamicina en Staphylococcus spp.

Performance of an agar dilution method and a Vitek 2 card for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus spp.
Lavallé C, Rouleau D, Gaudreau C, Roger M, Tsimiklis V, Locas MC, et al.J Clin Microbiol. Apr 2010 p. 1354-7.

La resistencia inducible a clindamicina es producida por una metilasa ribosomal codificada en los genes erm; esta da como resultado resistencia a macrólidos, lincosa-midas y streptograminas B (fenotipo MLS_B). Este fenotipo puede ser inducible (iMLS_B) o constitutivo (cMLS_B). El fenotipo inducible sólo se expresa en presencia de macrólidos, pero no lincosamidas. Los aislados que portan el fenotipo iMLS_B parecen resistentes a macrólidos pero susceptibles a clindamicina. Se han descritos fallas de tratamiento con el uso de clindamicina con este fenotipo inducible, generando preocupación sobre la selección del fenotipo cMLS_B especialmente en infecciones profundas con alta carga microbiana. El Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) recomienda testear las cepas resistentes a eritromicina y sensibles a clindamicina de Staphylococcus spp, ya sea por D-test o por microdilución en caldo para detectar la resistencia inducible a clindamicina. En algunos laboratorios, la realización de esto retrasa en 24 horas el resultado microbiológico. Alternativas para evitar esto sería informar todas las cepas resistentes a eritromicina como resistentes a lincosamidas pero, debido a diferencia en prevalencia del fenotipo iMLS_B en distintas localizaciones, esto limitaría el uso de clindamicina en pacientes que pudieran eventualmente responder a este antimicrobiano. Otra alternativa sería testear todas las cepas de Staphylococcus spp para resistencia inducible realizando D-test a todas las cepas, lo que recargaría en exceso el trabajo del laboratorio.

Se han descrito otros métodos no CLSI para detectar este tipo de resistencia. Fernández recientemente describió una técnica de dilución en agar Müller Hinton con 3,3 % de sangre de caballo desfibrinada con 0,5 mg de clindamicina y 1 mg de eritromicina/L resultando en una sensibilidad de 100%. El sistema automatizado Vitek 2 (BioMérieux Mercy l'Etoile, France) ofrece, a su vez, paneles que detectan la resistencia inducible a clindamicina.

Objetivo: Evaluar el desempeño de la dilución en agar usando agar Müller Hinton no suplementado con sangre de caballo desfibrinada y las tarjetas Vitek 2 en la detección de la resistencia inducible a clindamicina con el D-test.

Material y Métodos: Se evaluó, entre mayo y julio del 2008, un total de 90 aislados clínicos de Staphylococcus spp, no duplicados, resistentes o con susceptibilidad intermedia a eritromicina, (CIM > 8 mg/L y CIM 1-4 mg/L, respectivamente), y sensibles a clindamicina (CIM < 0,5 mg/L), correspondientes a dos hospitales docentes en el área de Montreal, Canadá. Además se incluyó una colección de 73 cepas que reunían los mismos requisitos de resistencia recolectadas con anterioridad en un tercer hospital. En dos hospitales se utilizó el sistema Vitek 2 y en un tercero dilución en agar. El D-test fue realizado, según recomendaciones CLSI, con una distancia entre discos de 15 mm de separación. Un análisis molecular de los aislados fue realizado buscando la presencia de los genes ermAy C , los dos genes mas comúnmente implicados en resistencia inducible a clindamicina en Staphylococcus spp; para ello se utilizó una RPC múltiple, de acuerdo a métodos previamente descritos. Dilución en agar: como placas de inducción se utilizaron placas con agar Müller Hinton que contenían 0,5 mg de clindamicina/L y 1 mg de eritromicina/L, dispuestas en placas de 100 mm con 5 mm de profundidad. Las decisión de no suplementar el agar con sangre de caballo fue hecha porque todas las placas de agar usadas en el laboratorios son no suplementadas con sangre, de acuerdo a las recomendaciones del CLSI. Como control se utilizaron placas con eritromicina y sin antimicrobianos. Se inocularon 3 a 5 colonias de un cultivo de 18-24 horas de Staphylococcus spp en caldo y ajustados a 0,5 Mac Farland (~10⁸ufc/ml). 500 ul de la suspensión fue puesta en pocilios mediante un inoculador manual, empleando agujas de 1 mm que depositan 0,1 ul (10⁴) de la suspensión. Para evaluar el posible efecto inoculo se utilizó un replicador con agujas de 3 mm que aplican 1 ul (10⁵). Las placas fueron incubadas a 35°C y leídas a las 24-48 horas. El desarrollo de más de una colonia en la placa de inducción fue considerada un test positivo para resistencia inducible a clindamicina. Vitek 2: Se utilizó una tarjeta AST p580, la que posee dos pocilios para detección de resistencia inducible a clindamicina, uno tiene una concentración de 0,5 mg de clindamicina/L y otro una combinación de 0,25 y 0,5 mg/L de clindamicina y eritromicina, respectivamente. De acuerdo a las recomendaciones del fabricante; se inoculó en la tarjeta una suspensión preparada con 3 a 5 colonias de un cultivo de Staphylococcus spp en una solución de NaCl al 0,45% y ajustada a un Mac Farland de 0,5-0,63. En el análisis de susceptibilidad fue utilizado el sistema avanzado de experto (AES). Como control de calidad se utilizaron las cepas ATCC BAA 977 y BAA 976 positivas y negativas para el gen ermA. Para la RPC se utilizaron, además, cepas con genes ermC y otras con ambos ermA y ermC. Análisis estadístico fue realizado por STATA.

Resultados: Se utilizaron 163 cepas con resistencia intermedia o resistentes a eritromicina pero sensibles a clindamicina. El fenotipo iMLS_B fue detectado en 134 (82%) de las cepas, de las cuales todas, excepto una, presentaba los genes ermA y/o ermC. Todas las cepas negativas carecían de dichos genes. La lectura de ambas concentraciones 10⁴-10⁵ aumentó la sensibilidad de la detección de 84- 91% a las 24 horas y la lectura 10⁵ a las 48 horas presentó una sensibilidad de 100%. No hubo diferencias en la lectura que informa el Vitek 2 y lo informado por el AES. La sensibilidad del equipo fue de 93%, no identificando 10 cepas, 5 Staphylococcus coagulasa negativa y 5 Staphylococcus aureus meticilina sensible. La especificidad fue de 100% y el valor predictor negativo de 74% (IC de 58-87%).

Discusión: En el contexto del aumento de la prevalencia de S. aureus resistente a meticilina adquirido en la comunidad, la necesidad de antimicrobianos alternativos para el tratamiento de infecciones de piel y tejidos blandos por este agente, clindamicina aparece como una buena opción, debido a su buena disponibilidad administrada por vía oral y buena distribución en este tipo de tejidos. La resistencia a clindamicina es variable según el área geográfica. El método de dilución confirma la importancia del efecto inoculo con lectura a las 48 horas. Para laboratorios que utilizan el sistema automatizado Vitek 2 que deseen aumentar la sensibilidad podrían testear las cepas resistentes a eritromicina pero sensibles a clindamicina, que muestren resistencia inducible negativo, con otro método alternativo como D-test.

Andrea Sakurada Z.
Laboratorio de Microbiología Hospital Clínico
Universidad de Chile

Comité de infecciones Intrahospitalarias Complejo
Asistencial Dr. Sótero del Río.