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Revista chilena de infectología

versión impresa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. v.26  supl.1 Santiago abr. 2009

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182009000300003 

Rev Chil Infect 2009; 26(Supl 1): 13-16

MICROBIOLOGÍA

 

Estudio de susceptibilidad a tigeciclina: Influencia del agar Mueller-Hinton en el método de difusión en agar y validación del método E-test® para Acinetobacter baumannii

In vitro evaluation of tygecicline: Influence of Mueller-Hinton agar in agar diffussion methods and validation of E-test® for Acinetobacter baumannii

 

Patricia García C, Lorena Porte T. y Daniel Curcio J.

Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago Departamento de Laboratorios Clínicos Laboratorio de Microbiología (PGC)
Hospital Militar de Santiago, Chile Laboratorio Clínico (LPT)
Buenos Aires, Argentina Sanatorio Itoiz (DQ)

Dirección para correspondencia


Tigecycline is a glicylcicline with broad antimicrobial spectrum. Susceptibility testing to this drug for Acinetobacter is difficult in hospitals due to the utilization of the disk diffusion method. FDA break points have shown an unacceptable rate of errors (23%) for disk diffusion versus broth microdilution in American studies and overcall of resistance depending on the brand of Mueller Hinton agar used. Modifications to these FDA break points have been proposed, but there is not enough evidence yet. Data from a multicenter study from Chile allowed the evaluation of the characteristics of the agar used for susceptibility testing and the utility of E-test as an alternative MIC method for Acinetobacter. The Mueller Hinton agar brand is an important factor that affects disk diffusion method results. There is very good correlation between broth microdilution and E-test for the susceptibility category as well as for MIC determination. The intermedíate and resistant results obtained with disk diffusion method should be checked by using E-test.

Key words: Tigecycline, antibiograms, bacterial sensitivity tests, minimum inhibitory concentration, disk diffusion antimicrobial tests.


Resumen

Tigeciclina es una glicilciclina de amplio espectro antimicrobiano. La determinación de la susceptibilidad a este fármaco presenta dificultades en el laboratorio asistencial al utilizar la técnica de difusión por disco para Acinetobacter spp. Los puntos de corte -según la (FDA- han mostrado una tasa inaceptable de errores (23%) en comparación con el método de micro-dilución en caldo en estudios americanos, diversas evaluaciones demuestran que existe una sobreestimación de resistencia in vitro dependiendo de las características del agar Mueller Hinton utilizado. Se han propuesto modificaciones a los puntos de corte pero no se han oficializado por insuficientes evidencias. Los datos de un estudio multicéntrico realizado en Chile permitieron evaluar la influencia de las distintas marcas de medios de cultivo en el tamaño de los halos y la utilidad de la epsilometría (E-test®) como método CIM para Acinetobacter sp. La marca de agar Mueller Hinton y otros factores propios del medio dificultan la determinación de la susceptibilidad a tigeciclina utilizando difusión por disco. Existe muy buena correlación entre la micro-dilución en caldo y el E- test®, tanto para la categoría de susceptibilidad como para la CIM. Por esto, se sugiere que los resultados intermedios o resistentes obtenidos por difusión en agar para A. baumannii sean comprobados mediante el uso de E-test®.

Palabras clave: Tigeciclina, antibiogramas, test de sensibilidad bacteriana, concentración inhibitoria mínima, test de difusión por disco.


Tigeciclina (Tygacil®, Wyeth Pharmaceuticals) es un antimicrobiano derivado de la molécula de minociclina, perteneciente a la familia de las glicilciclinas, cuya comercialización fue aprobada en los años 2005 y 2006 por la Food and Drug Administration (FDA) y por la European Medicines Agency (EMEA), respectivamente.

Su actividad antimicrobiana ha sido evaluada extensamente in vitro, siendo activa sobre microorganismos grampositivos aerobios como Staphylococcus sp, Streptococcus sp (incluyendo S. pneumoniae), Enterococcus sp y histeria monocytogenes. La actividad sobre bacterias gramnegativas incluye a Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Entero-bacter sp, Citrobacter sp, Serratia sp y Aeromonas hydrophila, con buena actividad sobre las entero-bacterias productoras de ß-lactamasas de espectro expandido. También es activa sobre Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia y Burkholderia cepacia; en cambio, su actividad sobre Pseudomonas aeruginosa y especies de Proteus y Providencia, es limitada con una concentración inhibitoria mínima90 (CIM90) > 8 µg/ml1-7.

Se han descrito puntos de corte aprobados por la FDA para casi todas las especies bacterianas por el método de micro-dilución en caldo (método de referencia). Éstos consideran en categoría sensible a S. aureus cuando la CIM es <0,5 µg/ml y a Streptococcus grupos A, B, C y G y Enterococcus faecalis cuando la CIM es < 0,25 µg/ml. Para enterobacterias en general, Proteus sp, Providencia sp y Morganella sp se entiende como sensible una CIM < 2 µg/ml, intermedia una CIM de 4 µg/ml y resistente la CIM ≥ 8 µg/ml8. En el caso de A. baumannii, se utilizan los puntos de corte definidos para enterobacterias.

Para el método de difusión en agar utilizando discos de 15 µg de tigeciclina9, la FDA ha recomendado los mismos puntos de corte (susceptible ≥ 19 mm y resistente ≤ 14 mm) para todos los microorganismos, con excepción de Proteus sp, Providencia sp y Morganella sp. La aplicación de estos puntos de corte en A. baumannii ha mostrado una tasa inaceptable de errores menores (23%) en comparación con el método de microdilución en caldo en estudio americanos, pero no en estudios europeos10. Algunos autores, incluso han propuesto la modificación de los puntos de corte11. Sin embargo, ni el CLSI en su documento MI 00 S18 ni el comité europeo de pruebas de susceptibilidad (EUCAST) en su nota técnica 2006, los han definido para tigeciclina, por evidencia insuficiente.

La alta tasa de errores menores utilizando los puntos de corte de la FDA ha provocado problemas en los laboratorios de microbiología clínica de nuestro país. Un resultado de un estudio de susceptibilidad por difusión en agar menor a 19 mm en A. baumannii podría no significar la presencia de una cepa resistente y no todos los laboratorios pueden acceder a la confirmación con el método de referencia. La utilización de E-test® como método para determinar la CIM, que podría estar al alcance de nuestros laboratorios, también ha mostrado resultados controversiales12-14.

Por otra parte, Fernández-Mazarasa y cols15, han reportado aumento de la CIM90 de tigeciclina para A. baumannii de 1 a 4 µg/ml (determinado por E-test®), asociado a las altas concentraciones de manganeso en el agar Mueller-Hinton (AMH). Estos datos fueron corroborados por Thamlikitkul y cols16, quienes describieron que las zonas de inhibición observadas en AMH Oxoid® eran sistemáticamente inferiores a las de AMH Becton Dickinson®, con una diferencia media de 3,5 mm y un rango de 1 a 6 mm. La disminución en los halos entre AMH Oxoid® y AMH Becton Dickinson®, tuvo una correlación significativa (r = 0,95, p < 0,001).

Aprovechando los datos provenientes de un trabajo multicéntrico sobre vigilancia de la susceptibilidad in vitro a tigeciclina realizado en Chile durante los años 2006 y 200717, se evaluó la influencia de las marcas de los medios de cultivo en el tamaño de los halos para los microorganismos estudiados y la utilidad del E-test® como un método alternativo para determinar la CIM y de menor costo que la microdilución en A. baumannii.

Influencia del agar Mueller-Hinton. Se utilizaron agar Mueller-Hinton (AMH) de cinco marcas denominadas "a" (Oxoid®), "b" (Difco®), "c" (BBL®), "d" (Bntama®) y "e" (bioMérieux®). Las marcas "b" y "c" corresponden al mismo fabricante, por lo que se unificaron como "b". La utilización de la marca "d" sólo fue informada en un caso, por lo que no se incluyó en el análisis.

Para evidenciar las diferencias del tamaño de los halos entre distintos microorganismos y las marcas de AMH se utilizó una prueba de ANOVA de un factor, utilizando la marca de AMH como factor para constituir los grupos, considerando significativo un valor p<0,05.

Se encontraron diferencias significativas en los diámetros de los halos obtenidos cuando se utilizaron diferentes medios para A. baumannii, E. coli y S. aureus. No se encontraron diferencias significativas para K. pneumoniae ni K. oxytoca, cocáceas grampo-sitivas (excluyendo S. aureus) y enterobacterias (excluyendo Klebsiella sp).

El promedio de los halos de inhibición, fue menor en A. baumannii cuando se utilizó el AMH marca Oxoid®. En general, los halos de mayor diámetro se obtuvieron con el AMH marca bioMérieux® (Tabla 1 y Figuras 1-3).



Validación del E-test® en Acinetobacter baumannii. Se efectuó en forma paralela E-test® y micro-dilución en caldo (MDC) por Sensititre® Trek Diagnostic, en 40 cepas de A. baumannii. La mediana de la CIM a tigeciclina para ambos métodos fue de 0,5 µg/ml con los mismos intervalos de confianza (IC95% 0,5-1,0). La correlación entre los métodos se observa en el Figura 4, apreciándose que sólo en una cepa existe una diferencia mayor a una dilución entre la CIM determinada por E-test® (0,25 ng/ml) versus MDC (1,0 Hg/ml). A pesar de esta diferencia, todas las cepas estudiadas se encuentran en la categoría susceptible.


Comentarios. En general, la determinación de la susceptibilidad a tigeciclina, resulta difícil por el método de difusión. Ésta puede verse afectada por distintos factores tales como el tipo de microorganismo y su inoculo, la marca de AMH utilizado (concentración de iones), la preparación del medio (pH, altura del agar), las condiciones de conservación del medio y el estatus del disco (degradación).

El análisis de los datos provenientes del estudio multicéntrico indica que existe muy buena correlación entre la MDC y el E-test®, tanto para la categoría de susceptibilidad (concordancia 100%) como para las CIMs. Por esta razón, se sugiere que los resultados intermedios o resistentes obtenidos por difusión en agar para A. baumannü sean comprobados mediante el uso de E-test®. En caso de resistencia por ambos métodos debe estudiarse la cepa por el método de referencia (MDC) (Figura 5).


Esta alternativa parece ser la opción más racional mientras no exista suficiente evidencia para el cambio de los puntos de corte para difusión en agar.

 

Agradecimientos. Los autores desean agradecer a Stephanie Braun J, Loriana Castillo D, Marcela Cifuentes D, Leonardo Chanqueo C, Ménica Espinoza P, Alejandra Fernández V, Chrystal Juliet L, Marusella Lam E, Andrea Sakurada Z, Marcela San Martín S, Cecilia Tapia P, Maggie Vechiola H, y a todos los profesionales de los respectivos laboratorios.

 

Referencias

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Correspondencia a:
Patricia García Cañete pgarcia@med.puc.cl

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