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Revista chilena de infectología

versión impresa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. v.26 n.1 Santiago feb. 2009

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182009000100006 

 

Rev Chil Infect 2009; 26 (1): 39-48

MICROBIOLGÍA CLÍNICA

 

Tipificación molecular y fenotípica de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (SAMR) en un hospital universitario

Molecular and phenotypical typification of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strains in a university hospital

 

Maribel J. Castellano-González, Armindo J. Perozo-Mena, Rosana L. Vivas-Vega, Messaria M. Ginestre-Pérez y Gresleida C. Rincón-Villalobos

Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela
Facultad de Medicina Escuela de Bioanálisis Departamento de Microbiología Cátedra de Bacteriología Genera (MJGG, MMG-P)
Cátedra de Práctica Profesional de Bacteriología (AJP-M)
Laboratorio de Bacteriología General y Clínica (RLV-V)
Cátedra de Bacteriología Clínica (GCR-V)
Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo Centro de Referencia Bacteriológico (AJP-M).

Dirección para correspondencia


Objective: To typify by molecular and phenotypical methods, MRSA strains, isolated from patients and nurses to establish their possible clonal origin. Materials and Methods: 50 MRSA strains isolated in a teaching hospital in Maracaibo (Venezuela) were analyzed. The typification of MRSA strains was performed by means of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and antibiotyping. Results: In patients, 12 clusters (I-XII) and 19 antibiotypes were found; whereas in the health-care personnel, 6 clusters (I-VI) and two antbiotypes were detected. There was no statistically significative association between antibiotypes and band patterns obtained by PFGE (p>0.05). Conclusions: By means of detection of resistance markers and PFGE, it is feasible to discrimínate the nature of the clinical strains of MRSA. The obtained results show the possible nosocomial transmission of MRSA strains and their clonal spread in hospital departments, particularly at the ICU.

Key words: Methicillin-resistant S. aureus, pulsed-field gel electrophoresis antibiotypes.


Resumen

Objetivo: Tipificar por métodos moleculares y fenotípicos, las cepas SAMR aisladas de pacientes y personal de enfermería para establecer su posible origen clonal. Materiales y Métodos: Se analizaron 50 cepas SAMR aisladas en un Hospital Universitario de Maracaibo (Venezuela). La tipificación se efectuó mediante electroforesis en gel de campo pulsado (EGCP) y antibiotipia. Resultados: Entre pacientes, se obtuvieron 19 antibiotipos y 12 grupos (I-XII); mientras que, en el personal de salud, por EGCP se detectaron seis grupos (I-VI) y dos antibiotipos. No se encontró asociación estadísticamente significativa entre los antibiotipos y patrones de bandas obtenidos por EGCP (p > 0,05). Conclusiones: Por medio de la detección de marcadores de resistencia y mediante la EGCP, es factible diferenciar la naturaleza de las cepas SAMR de origen clínico. Los resultados obtenidos demuestran la posible transmisión intrahospitalaria de cepas SAMR; así como, su diseminación clonal en los servicios del hospital, particularmente en la UCI, durante el período estudiado.

Palabras clave: Staphylococcus aureus resistente a meticilina, electroforesis en gel de campo pulsado, antibio tipia.


INTRODUCCIÓN

La aparición de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (SAMR), fue descrita inicialmente en 1960, poco tiempo después de la introducción de este antimicrobiano en la práctica clínica. Esta resistencia es conferida por una proteína ligadora de penicilina (sigla en inglés: PBP) adicional conocida como PBP2a o PBP2', la cual no está presente en las cepas susceptibles a meticilina1 y es codificada por el gen mecA, el cual forma parte de un complejo móvil (mee) que reside dentro de una isla genómica, un elemento genético denominado cassette cromosómico estafilocóccico (sigla en inglés: SCC) en S. aureus2.

Las cepas de SAMR de origen nosocomial pueden transmitirse a la comunidad a través de los pacientes y sus contactos o del personal de salud; a pesar que también existe la probabilidad que estas cepas surjan "de novo", gracias a la adquisición del SCCmec por el genoma de una cepa de S. aureus previamente susceptible a meticilina3,4.

Por otra parte, ante la aparición simultánea en tiempo y lugar de infecciones causadas por una especie determinada, resulta imprescindible determinar si se trata de la misma cepa en todos los casos, ya que este dato es fundamental para confirmar que se está ante una epidemia o, por el contrario, se trata de cepas diferentes con una coincidencia temporo-espacial casual5. En consecuencia, desde el punto de vista epidemiológico, es necesario identificar las fuentes y monitorear la diseminación de las cepas de SAMR durante la investigación de un brote, como parte de un programa de vigilancia y control vigente5.

La tipificación, ya sea por métodos fenotípicos o genotípicos, permite determinar si un grupo de cepas de una especie en particular es clonal; es decir, provienen de un precursor común6. Este proceso desempeña un importante rol en la comprensión de la epidemiología de SAMR y la evaluación de la efectividad de las medidas de control de las infecciones y prescripción de antimicrobianos7.

Diferentes métodos han sido utilizados para la tipificación de SAMR,8 entre otros: biotipiaje, antibiogramas9 y resistogramas (resistencia a químicos y colorantes), serotipiaje, fagotipia, ribotipia, perfil de plásmidos, proteínas estructurales o enzimo-electrofenotipia, análisis de restricción de ADN cromosómico mediante electroforesis clásica, electroforesis de enzimas multilocus (sigla en inglés: MLEE), electroforesis en gel de campo pulsado (EGCP ó PFGE, según sus siglas en inglés)10,11, reacción de polimerasa en cadena (RPC)3, hibridación con diferentes sondas (southern blot)12,13 o genotipiaje basado en genes de exotoxinas (set) o en el SCCmec2.

Desafortunadamente, no todos los métodos clasifican en forma similar; además, pocos estudios han evaluado una amplia gama de aislados comparando simultáneamente múltiples técnicas5; no obstante, los resultados de diversas investigaciones sugieren que los marcadores fenotípicos, como biotipos o patrones de susceptibilidad antimicrobiana, poseen limitaciones en su capacidad de tipificación y estabilidad, siendo más propensos a sufrir modificaciones en el tiempo, en comparación a los métodos de genotipificación, como la MLEE y EGCP. Además, muchos de estos sistemas poseen poco poder de discriminación6,13,14.

La EGCP, técnica desarrollada por Schwarz y Cantor15, ha sido uno de los métodos más utilizados en la epidemiología molecular en los últimos tiempos, siendo considerada actualmente, como el "estándar de oro" para el tipiaje molecular de los organismos16. Esta técnica posee un gran poder de discriminación y permite discernir fragmentos de ADN cuya longitud varía de 10 Kb hasta 7Mb, aproximadamente. Tradicional-mente, los patrones de bandas obtenidos son utilizados para identificar grupos de aislados por similaridad entre patrones. Sin embargo, una debilidad de la EGCP es que los cambios en el patrón de restricción pueden ocurrir en forma aleatoria, ya que se basan en la alteración de un número limitado de sitios en el ADN reconocidos por la enzima de restricción7,17,18. Además, ésta es considerada técnicamente compleja, consume mucho tiempo para emitir resultados y los reactivos y/ o equipos a utilizar son sumamente costosos. Es una herramienta útil, no sólo para la tipificación de cepas; sino también, para el seguimiento del desarrollo genético natural de generaciones de S. aureus19.

La principal ruta de diseminación nosocomial de cepas SAMR entre áreas con diferente localización geográfica, es la propagación de unos pocos clones epidémicos internacionales; aunque el factor determinante del éxito de un clon en su diseminación no ha sido aún dilucidado con claridad; al parecer la presión selectiva de los antimicrobianos podría contribuir a este fenómeno3.

Estudios filogenéticos por técnicas moleculares han demostrado que la mayoría de los aislados intrahospitalarios de SAMR pertenecen a pocos linajes o clones que se han diseminado mundialmente y predominan en una región geográfica, a la que, en general, deben su denominación. Al presente, los clones epidémicos reconocidos de mayor diseminación internacional son: Ibérico, Nueva York/Japón, Húngaro, Pediátrico, EMRSA-16 y el clon Brasileño20-23.

La determinación de los clones SAMR en América Latina es reciente, encontrándose dos clones predominantes: el clon brasileño y el clon chileno/cordobés24-29. No se encontraron reportes en relación a los clones de SAMR predominantes en Venezuela.

Debido a la patogenicidad potencial de las cepas SAMR y a que éstas son aisladas con una frecuencia general de 25,4% en pacientes (42,1% en hospitalizados y 13,9% en pacientes ambulatorios) y de 16,7% entre el personal de salud que labora en el hospital (datos no publicados), se consideró pertinente realizar la presente investigación, con el objetivo general de tipificar fenotípicamente (antibiograma) y genotípicamente (EGCP) las cepas de SAMR provenientes de pacientes y personal de salud y determinar el posible origen clonal de las mismas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas bacterianas. En un período de seis meses, se analizaron 286 cepas de S. aureus provenientes de pacientes atendidos en los diferentes servicios de un hospital universitario (n: 233) y de personal de enfermería que labora en los diferentes servicios del referido centro de salud (n: 53). La identificación de los aislados fue confirmada utilizando la metodología convencional.

Susceptibilidad antimicrobiana. Fue determinada mediante el método de difusión del disco en agar, siguiendo los lineamientos del Instituto para la Estandarización de Laboratorios Clínicos (CLSI, según sus siglas en inglés)30. Se probaron los siguientes antimicrobianos: penicilina G (PG 10 U), oxacilina (OX 1 ug), amikacina (AK 20 µg), gentamicina (GM 10 ug), eritromicina (E 15 µg), clindamicina (CC 2 µg), cloranfenicol (CAF 30 µg), tetraciclina (TE 30 µg), cotrimoxazol (TSX 1,25/23,75 µg), rifampicina (RFP 5 µg), vancomicina (VA 30 µg), teicoplanina (TEC 30 µg), ciprofloxacina (CIP 5 µg), levofloxacina (LE 5 µg), gatifloxacina (GAT 5 µg), linezolid (LZD 30 µg), quinupristina/dalfopristina (QDA 15 ug), mupirocina (MUP 5 ug) y fosfomicina (FOS 50 µg). Las placas inoculadas se incubaron a 35-37 °C durante 24 horas en atmósfera aeróbica. Para la lectura e interpretación de los resultados de la susceptibilidad a MUP, se adoptaron los criterios de la Sociedad Británica para Antimicrobianos y Quimioterapia (BSAC)31 y para FOS, se utilizaron los criterios de interpretación descritos por Gobernado32.

Para la antibiotipia, cepas resistentes e intermedias fueron tratadas de manera indistinta. Aislados con resistencia, al menos, a un agente antimicrobiano fueron considerados de un antibiotipo distinto a aquellos completamente susceptibles13.

Determinación de resistencia a oxacilina. Fenotípicamente, la susceptibilidad antimicrobiana se determinó mediante el método de Kirby & Bauer, prueba de descarte de resistencia a oxacilina en agar oxacilina (µg/ml), determinación de la CIM a oxacilina mediante el método de E-test® y determinación de la PBP2a utilizando la aglutinación de partículas de látex (PBP2a Test OXOTD®).

Preparación del ADN inmovilizado. Las cepas de S. aureus fueron crecidas en agar soya tripticasa su-plementado con 5% de sangre de cordero, luego fueron recolectadas y lavadas con una solución 0,5% NaCl y 0,01M de EDTA pH 8,0; posteriormente se mezclaron las células con agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% disuelta en la solución de lavado, utilizando el molde para la fabricación de bloques, se colocó una concentración aproximada de 3x109 UFC/ml en cada bloque, se prepararon minibloques de 3 mm x 3 mm x 0,7 mm (largo, ancho y grosor). Una vez elaborados los minibloques, se colocaron en solución de lavado conteniendo l0µg/ml de lisozima, esto se incubó durante 2 horas a 37 °C, posterior a la incubación se eliminó esta solución y se colocaron en una solución desproteinizante que contenía 0,01M Tris; 0,1MEDTA; 1% sarcosyl; 1% nonident P40 y 4M urea pH 9,5; los minibloques se incubaron en esta solución por 4 horas a 45 °C. Luego se eliminó esta solución y se lavaron con agua destilada y posteriormente, con una solución 0,01M Tns-HCL y 0,1M EDTA pH 8, donde se conservaron a 4°C hasta el momento de la digestión.

Digestión del ADN inmovilizado con enzimas de restricción. Cada minibloque fue lavado tres veces en solución 0,01M Tns-HCL y 0,05 M EDTA pH 8; a 4°C por 10 minutos, posteriormente se incubaron con 200µl de tampón de digestión de la enzima proporcionado por el fabricante (Promega®) a 4°C por 10 minutos. Posteriormente cada minibloque fue transferido a l00µl de tampón de digestión fresco y se colocaron 20 U de la enzima de restricción Smal (Promega®) a cada mini-bloque, se incubó durante 2 horas a 37°C, luego se detuvo la reacción reemplazando el tampón por 1 mi de 0,01MTns-HCL: 0,1M EDTA pH 8,0.

Electroforesis de campo pulsado de los fragmentos de macrorestricción del ADN de S. aureus La electroforesis se realizó en una cámara minichef del equipo Guefast 06® (NEURONIC, S. A), el gel tenía las siguientes dimensiones 7 cm x 5 cm x 0,5 cm (largo, ancho, grosor); se utilizaron 400 mi de tampón Tris-Borato EDTA 0,5X (Sigma®) a 20 °C. Los fragmentos de ADN fueron separados a 10 V/cm durante 5 horas en un gel de agarosa al 1,5% sumergido en el tampón de electroforesis. Los fragmentos de restricción fueron resueltos programando las siguientes rampas con diferentes números de pulsos y tiempos de pulso: 130 pulsos de 21 segundos; 130 pulsos de 17 segundos; 130 pulsos de 13 segundos; 120 pulsos de 9 segundos; 200 pulsos de 5 segundos; 200 pulsos de 3 segundos y 200 pulsos de 1 segundo. El gel se coloreó durante 30 minutos en una solución 0,5 ug de bromuro de etidio (Promega®), luego se visualizó en un transiluminador UV y se fotografió con una cámara digital (SONY DSC707). El tamaño de los fragmentos de restricción en kilopares de bases (Kb), se calculó al comparar la posición de las bandas con la co-migración de un marcador de peso molecular como el fago lambda concatamerizado de 45 Kb (Promega®), para bandas de peso molecular pequeño y el genoma completo de Sacharomyces cerevisiae (Biorad®), para bandas de peso molecular grande.

Los perfiles obtenidos por EGCP fueron comparados por inspección visual, acorde a los criterios descritos por Tenover14, según los cuales, se debe considerar como indistinguibles, aquellas cepas que no presenten diferencias en ninguna de las bandas; cercanamente relacionadas, las que presenten 2 ó 3 fragmentos diferentes; posiblemente relacionadas a las cepas con diferencias en 4 a 6 fragmentos de ADN (bandas); mientras que aquellas con 7 ó más fragmentos diferentes, son consideradas como no relacionadas. Además, se utilizó el análisis computarizado, utilizando el software GUEFASCAN®.

Análisis estadístico. Se realizó utilizando el paquete SPSS™, versión 11.0 (SPSS, Inc, Chicago, III USA) para Windows™ (Microsoft Corp, Redmond, Washington, USA). En la antibiotipia se utilizó el análisis cluster jerárquico para clasificar las cepas SAMR estudiadas en grupos, de acuerdo a sus semejanzas y diferencias. La asociación de los antibiotipos y patrones de bandas obtenidos por EGCP, se determinó mediante la prueba de Chi-cuadrado, con una significancia del 5% (a: 0,05).

Control de calidad. Para el control de calidad de las pruebas de tipificación molecular y susceptibilidad antimicrobiana, se utilizaron las cepas S. aureus ATCC 29213 (susceptible a OX) y S. aureus ATCC 43300 (resistente a OX).

RESULTADOS

La prevalencia observada para SAMR fue de 17,5% (50 cepas). De estas, 41 (82,0%) se aislaron a partir de muestras provenientes de pacientes y 9 (18,0%) del personal de enfermería. Al analizar la distribución por servicios de las cepas de SAMR aisladas de pacientes, se encontró que 31 aislados (75,6%) correspondían a pacientes hospitalizados y 10 (24,4%) a pacientes no hospitalizados. El orden de frecuencia de los aislados según servicio de atención al paciente fue el siguiente: Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) 12 (38,7%), Cirugía 9 (29,0%), Medicina Interna 4 (12,9%), Dependencias Externas 4 (12,9%) y; Neonatología 2 (6,4%); mientras que la totalidad de cepas SAMR provenientes del personal de enfermería, fueron aisladas en la UCI (Datos no mostrados).

Entre los aislados provenientes de pacientes, todas las cepas SAMR probadas fueron resistentes a dos o más antimicrobianos. Se obtuvieron 19 patrones diferentes de susceptibilidad antimicrobiana, destacando en orden de frecuencia, el perfil 13 que muestra resistencia a 10 antimicrobianos, este fenotipo de resistencia fue expresado por 14 cepas de SAMR (34,1%), seguido del perfil 10 con resistencia a nueve antimicrobianos presente en cuatro cepas (9,8%), el perfil 1 con resistencia a dos antimicrobianos (2 cepas, 4,9%), el perfil 4 con resistencia a cuatro antimicrobianos, presente en dos cepas (4,9%), el perfil 11 con resistencia a nueve antimicrobianos presente en dos cepas (4,9%), los perfiles 14, 15 y 16, con resistencia a 11 antimicrobianos expresados por dos cepas cada uno (4,9%) y 1 cepa (2,4%) para cada uno de los restantes patrones de resistencia obtenidos (Tabla 1).


En las cepas SAMR aisladas del personal de enfermería se encontraron solamente dos patrones de resistencia, el 1 que presenta resistencia a tres antimicrobianos, expresado por cinco cepas (55,6%) y, el 2 con resistencia a 10 antimicrobianos, observado en cuatro cepas (44,4%) (Tabla 2).


El análisis de los productos de restricción obtenidos al digerir el genoma de las cepas de SAMR con Smal, permitió identificar doce patrones diferentes de bandas, revelando la presencia de, al menos cinco grupos, designados con números romanos (I-V). Cada uno de los restantes patrones se presentó en forma aislada y fueron también designados con números romanos (VI-XII). El grado de semejanza entre las cepas se representó gráficamente como un dendrograma de homología (Figura 1).


Figura 1. Dendograma derivado del análisis de la EGCP en cepas de SAMR aisladas de pacientes. 2007. Maracaibo, Venezuela (n: 31).

Los fenotipos de resistencia (antibiotipos) encontrados en las cepas de pacientes y su relación con los grupos obtenidos mediante EGCP se presentan en la Tabla 3. Así, el grupo I estaba formado por tres cepas del antibiotipo 13 y una del 16. El grupo II estaba compuesto por dos cepas del antibiotipo 13, una del 10 y una del 15. El grupo III estuvo integrado por cuatro cepas con el fenotipo de resistencia 13, dos con el 12, una con el 10 y una con el 14. El IV, presentó una cepa del antibiotipo 2 y una del 11; mientras que el V mostró una cepa de cada uno de los siguientes antibiotipos: 10, 13, 15, 16, 18 y 19. De los grupos restantes, cuatro cepas expresaron el antibiotipo 13, dos el 4 y una el 6. Entre las cepas provenientes de personal de enfermería, con Smal, se identificaron seis patrones diferentes de bandas, identificados con los números romanos I al VI, respectivamente. El grado de semejanza entre las cepas de SAMR aisladas del personal de enfermería, se representó gráficamente como un dendrograma de homología (Figura 2). En el mismo puede evidenciarse la presencia de al menos un grupo, designado con el número I, el cual estaba formado por cuatro cepas, aisladas de una misma persona; mientras que el resto de los aislados se presentaron en forma única y fueron designados también con números romanos (II al VI, respectivamente).



Figura 2. Dendograma derivado del análisis de la EGCP en cepas de SAMR aisladas en personal de enfermería. 2007. Maracaibo, Venezuela (n: 9).

Los fenotipos de resistencia (antibiotipos) encontrados en las cepas de SAMR aisladas de personal de enfermería y su relación con los grupos obtenidos mediante EGCP se presentan en la Tabla 4. Así, el grupo I estaba formado por cuatro cepas del antibiotipo 2; mientras que cada una de las restantes cepas únicas, mostraron el fenotipo de resistencia 1.


Al relacionar los grupos obtenidos de las cepas de SAMR aisladas de pacientes y personal de enfermería, pudo evidenciarse, que el grupo I que portaba un miembro del personal de salud, correpondió al grupo III aislado de pacientes, expresado por ocho cepas, cuatro de las cuales provenían de la UCI y expresaron el mismo patrón de resistencia.

DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos muestran claramente la diseminación policlonal de los aislados de SAMR en los diferentes servicios de atención al paciente en el hospital; con excepción de la UCI, donde, por ambos métodos de tipificación, se encontró transmisión intra-hospitalaria del microorganismo y se demostró la diseminación clonal de las cepas estudiadas.

La antibiotipia es uno de los métodos más sencillos y económicos que pueden ser utilizados en el laboratorio clínico (particularmente, en los pequeños) para la diferenciación de cepas bacterianas33; pero sólo cuando los diámetros de las zonas de inhibición son utilizados como marcadores y, no las interpretaciones categóricas5, ya que diferentes investigaciones han demostrado que los antibiogramas basados en categorías de interpretación suelen ser problemáticos8,33,34. Cambios en los tamaños de los halos de inhibición para un solo agente no son significativos; por lo tanto, antes de considerar como diferentes a dos cepas deben observarse modificaciones en los halos de dos o más antibióticos5. Esta inestabilidad en los patrones de resistencia antimicrobiana en S. aureus, probablemente está, al menos en parte, relacionada con cambios en el contenido de plásmidos5.

Los patrones de multiresistencia exhibidos por la mayoría de las cepas de SAMR intrahospitalarias han asistido por muchos años a los microbiólogos clínicos en la discriminación entre cepas de S. aureus mecA positivas y negativas; sin embargo, las variaciones en los perfiles de susceptibilidad y el incremento general en la frecuencia de aislamiento de cepas de SAMR no multi-resistentes ha dificultado la interpretación fenotípica34.

La determinación de 19 patrones diferentes de resistencia antimicrobiana (antibiotipos) entre las cepas aisladas de pacientes y dos en las del personal de enfermería, permitió analizar, el posible grado de asociación entre las cepas, que es aparentemente bajo. A excepción del patrón 13, el bajo número de cepas coincidentes en un mismo patrón de resistencia, indica que carecen de un origen común (al menos recientemente), ya que no responden igual frente a los antimicrobianos.

De los resultados mostrados en las Tablas 1 y 2, es evidente que 38 cepas (34 para 89,5% del total de cepas probadas de pacientes y 4 (80,0%) del personal de salud), presentaron multirresistencia importante frente a cinco o más antimicrobianos. Esto constituye una complicación desde el punto de vista del manejo terapéutico adecuado para tratar a los pacientes afectados de infecciones por estas cepas, así como controlar su diseminación y evitar brotes de infecciones nosocomiales35.

El patrón 1 presentado por cinco cepas del personal de enfermería es similar al patrón 2 observado entre las cepas aisladas de pacientes, además, el patrón de susceptibilidad antimicrobiana 13 de los pacientes, es similar al 2, presentado por cuatro de las cepas recuperadas del personal y, prácticamente, incluye los patrones previos, observados entre pacientes, reforzando las afirmaciones de diferentes autores, según los cuales, el personal de salud está en riesgo de ser colonizado con cepas potencialmente más resistentes a los antimicrobianos y diseminar el organismo a pacientes mediante contacto directo35.

Un hallazgo importante de este trabajo es que los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana entre cepas provenientes de personal de enfermería y pacientes, son diferentes en ocho de 17 antimicrobianos (sin incluir a PG y OX), permitiendo considerarlos como dos variedades diferentes. Sin embargo, podría afirmarse que el personal de salud constituye un reservorio importante de los SAMR que colonizan a pacientes del mismo servicio ya que al identificar el personal de salud como vector de transmisión, sus cepas reflejan los perfiles de resistencia prevalentes en el hospital5,35.

En este caso, los resultados obtenidos muestran en general, mayores porcentajes de resistencia en las cepas provenientes de pacientes en comparación con los aislados del personal de enfermería, lo cual podría deberse a que durante la permanencia de los pacientes en el hospital existe mayor probabilidad de ser colonizado o infectado por cepas bacterianas más resistentes a los antimicrobianos. La presión selectiva natural juega un importante papel predominante en el medio hospitalario, donde el uso de los antimicrobianos es frecuente, favoreciendo la aparición y diseminación de cepas más resistentes.

Se podría sugerir que algunos de los patrones de multiresistencia presentes en las cepas de S. aureus, se encuentran conferidos por plásmidos. De este modo, si los genes que confieren resistencia a múltiples antimicrobianos se encuentran ligados en el mismo plásmido, la administración de un solo antibacteriano conduciría, de manera indirecta, a la selección de cepas resistentes al resto de los antimicrobianos 31. La coincidencia entre 14 cepas provenientes de pacientes en el patrón 13 correspondiente a resistencia frente a 10 antimicrobianos, cuyos orígenes de aislamiento son: 10 del servicio de la UCI, dos de Cirugía y dos del servicio de Medicina Interna, permite establecer que aparentemente están relacionadas.

Del total de cepas SAMR estudiadas en pacientes (n: 41) sólo se realizó EGCP a 31. La diferencia observada en el número de cepas, se debe a que diez de éstas provenían de pacientes no hospitalizados o referidos de otros centros hospitalarios, por lo que no fue posible efectuar el seguimiento epidemiológico de las mismas. Por su parte, la totalidad de cepas de SAMR aisladas del personal fueron analizadas por EGCP (n:9).

Entre los pacientes, el dendrograma indica la presencia de más de 10 pequeños grupos, resultados similares a los descritos en Japón37, lo que sugiere que las infecciones por SAMR fueron provocadas por cepas de diferentes genotipos, a diferencia de las cepas provenientes del personal de enfermería, que sólo permitieron la obtención de un pequeño grupo, sugiriendo que la colonización del personal de la UCI era de origen clonal.

Por otra parte, la detección de cepas con patrón de resistencia o perfil molecular idéntico, es indicativo de diseminación clonal; lo más importante en este caso es la implementación de medidas de barrera y lavado de manos, así como el aislamiento de los pacientes índices38. Por otro lado, cuando en un grupo de cepas resistentes se encuentra una gran variedad genética, eso nos indica que está ocurriendo una selección independiente de la resistencia por presión selectiva; en este caso, se debe cambiar la política de uso de antimicrobianos para intentar seleccionar menos ese tipo de resistencia.

Las cepas SAMR tienden a ser similares en muchas características fenotípicas y al parecer pertenecen a una subpoblación evolutivamente restringida dentro de la especie39-42. Como resultado, la discriminación entre estas cepas por métodos fenotípicos, como el antibiograma, es frecuentemente complicada33,39,42-44.

En forma similar a los reportes de Kawano en Japón45,46, a pesar que, estadísticamente, no pudo demostrarse relación entre los resultados de los dos métodos (p > 0,05), en general hubo buena concordancia entre los resultados de la tipificación molecular (EGCP) y los fenotípicos (antibiotipia): cepas dentro de un mismo grupo tienden a expresar el mismo fenotipo de resistencia antimicrobiana. No obstante, cepas de un mismo grupo pueden presentar fenotipos diferentes y viceversa, un mismo antibiotipo puede estar presente en dos o más grupos. Según Yoshida47, el análisis de grupos basado en patrones de susceptibilidad antimicrobiana (antibiotipia) brinda resultados similares a la EGCP en 79% de los casos. De la misma manera, según los reportes de Struelens13, las variaciones en los patrones de resistencia antimicrobiana con respecto a las cepas prototipo, al parecer no son relevantes desde el punto de vista epidemiológico, cuando éstas son disociadas de las variaciones observadas en los perfiles genéticos. Estos hallazgos sugieren que la inestabilidad fenotípica in vivo o in vitro puede afectar la reproducibilidad más que el poder discriminante de los métodos de tipificación13,48.

Las discrepancias observadas entre ambos métodos de tipiaje sugieren que la variación fenotípica dentro de los tipos obtenidos por métodos moleculares podría representar artefactos in vitro. El hecho de si estas variaciones fenotípicas realmente son el reflejo de cambios en el ADN plasmídico o constituyen artefactos, debe ser clarificado antes de recomendar la combinación de ambos métodos para incrementar el poder de discriminación de las técnicas42.

De particular interés fue la observación de que la relación genética de las cepas, determinada por el análisis de los patrones de macro-restricción, parece correlacionar con la distancia respectiva en lugar y tiempo de los aislados. Esta observación podría sugerir que la determinación de la similitud entre los patrones de bandas es proporcional a la conservación de la distribución de los sitios de restricción en el cromosoma bacteriano13,37. Esta concordancia, aunada a la coincidencia de las cepas en tiempo y espacio, sugiere la ocurrencia de un pequeño brote por SAMR en las instalaciones de la UCI del hospital durante el período estudiado.

La variedad de patrones obtenidos por EGCP demuestra un patrón multifocal de expansión de SAMR en este hospital, a excepción de la UCI. Estos resultados son similares a los publicados por Sasaki R y cols49 y podrían obedecer al hecho que una vez que el paciente recluido en la UCI mejora su condición es trasladado a otros servicios clínicos, dependiendo de la disponibilidad de camas, permitiendo así, la diseminación de cepas de SAMR entre los diferentes servicios.

En conclusión puede decirse que, por ambos métodos, sólo fue posible determinar transmisión intrahos-pitalaria de cepas de SAMR en la UCI del hospital. La resistencia a los antimicrobianos en los patrones estudiados fue heterogénea. No se encontró asociación estadísticamente significativa entre la resistencia a los antimicrobianos y los patrones de la EGCP. Los resultados obtenidos en este trabajo son de gran importancia epidemiológica y demuestran la diseminación clonal de SAMR en las instalaciones del hospital, particularmente en la UCI, durante el período estudiado.

Agradecimiento. Al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad del Zulia por el financiamiento de esta investigación. Al Profesor Ramón Pérez por su asesoría en el análisis estadístico de los resultados.

 

REFERENCIAS

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Recibido: 6 de marzo 2008 Aceptado:28 de noviembre 2008

Fuente de financiamiento.Este proyecto fue financiado por el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad del Zulia (Proyecto No VAC-CONDES 1108-06)

Correspondencia a:

Maribel Josefina Castellano-González
maribeljo@cantv.net.ve

 

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