Rev Chil Infect 2007; 24 (5): 351-359

Artículo Original

Susceptibilidad genética a hantavirus Andes: Asociación entre la expresión clínica de la infección y alelos del sistema HLA en pacientes chilenos

Genetic susceptibility to Andes Hantavirus: Association between severity of disease and HLA alíeles in Chilean patients

Pablo Ferrer C., Pablo A Vial C., Marcela Ferrés G., Paula Godoy M., Analla Culza V., Claudia Marco C., Constanza Castillo H., María Elena Umaña C., Francisco Rothhammer E. y Elena Llop R.

Universidad de Chile, Facultad de Medicina, Instituto de Ciencias Biomédicas, Programa de Genética Humana. Santiago, Chile. (PFC, FRE, ELLR).

Universidad del Desarrollo, Facultad de Medicina, Instituto de Ciencias, Clínica Alemana. Santiago, Chile.(PVC, ACV, CMC).

Pontificia Universidad Católica de Chile, Facultad de Medicina. Centro de Investigaciones Médicas, Laboratorio de Infectología y Virología Molecular. Santiago, Chile.(MFG, PGM).

Universidad de La Frontera. Facultad de Medicina, Temuco, Chile. (CCH).

Secretaría Regional Ministerial. Octava Región, Oficina Los Ángeles, Chile. (MEUC).

Universidad de Tarapacá I.A.I. Chile. (FRE).

Dirección para correspondencia

Resumen

En Chile, la infección por hantavirus Andes (ANDV) tiene una expresión clínica variable, reconociéndose diversos grados de severidad. El presente estudio se realizó con el objeto de analizar la posible asociación entre la constitución genética de pacientes chilenos para el sistema HLA y la expresión clínica de la infección por ANDV. Se analizaron los alelos HLA A, B, DRB1 y DQB1, en dos grupos de pacientes con infección por ANDV: 41 pacientes con evolución clínica leve (sin insuficiencia respiratoria severa y sin requerimientos de ventilación mecánica) y 46 pacientes con evolución clínica grave (con insuficiencia respiratoria grave y/o shock). La determinación molecular del sistema HLA se realizó mediante SSP-PCR. El alelo HLA DRB1 * 15, se encontró en una frecuencia significativamente más alta en los pacientes leves (p = 0,007). Por lo tanto, el alelo DRB 1*15 se asociaría al curso clínico leve de la enfermedad. El alelo HLA-B*08, se encontró en una frecuencia mayor en los pacientes graves, la diferencia alcanzó una significación estadística marginal (p = 0,06). Así, el alelo HLA-B*08, podría estar asociado al curso clínico grave de síndrome cardiopulmonar ocasionado por hantavirus Andes.

Palabras claves: hantavirus Andes, HLA, síndrome cardiopulmonar por hantavirus.

Andes hantavirus (ANDV) infection in Chile has a variable clinical expression, and infected individuals may present with different grades of disease severity. This study aimed to determine if clinical expression of ANDV infection in Chilean patients is associated with the HLA system. HLA alíeles A, B, DRB1 and DQB1, were studied in two groups of patients with confirmed ANDV infection: 41 patients with a mild disease course (without respiratory failure and cardiovascular shock) and 46 patients with a severe disease course (with respiratory failure and shock). Molecular typing of HLA system was performed by SSP-PCR. The HLA-DRB 1*15 alíele, was significantly more common in the group of patients with mild disease (p = 0,007) and thus for possibly associated with a protective effect against ANDV infection. Conversely, HLA-B*08 was more common in patients with severe disease (p = 0,06). Although the association was marginally significant, alíele HLA-B*08 may be linked to an increased susceptibility to the severe clinical course of HCPS by ANDV.

Key words: Andes hantavirus, genetic susceptibility, HLA, hantavirus cardiopulmonary syndrome (HCPS).

Introducción

La infección por hantavirus es una zoonosis reconocida recientemente como entidad clínica¹². En Chile, se ha identificado al hantavirus Andes (ANDV) como el agente causal³⁴ y se ha determinado que su principal reservorio natural es el roedor silvestre Oligoryzomys longicaudatus⁵⁶. La infección por ANDV se asocia a una constelación de síntomas y signos clínicos denominada síndrome cardiopulmonar por hantavirus (SCPH), inicialmente descrito en el sur de los Estados Unidos, asociado al hantavirus Sin Nombre¹³⁷"⁹. Esta enfermedad se ha constituido en un problema relevante de salud pública ya que afecta, principalmente, a adultos sanos, en edad productiva (edad promedio de 32 años) y se asocia a una alta tasa de letalidad (30-35%) sin contarse aún con tratamientos específicos contra la infección¹⁰.

Desde 1995 hasta el 25 de agosto de 2006, se ha confirmado un total de 486 casos (incluidos casos registrados en forma retrospectiva) de acuerdo con el sistema de notificación del MTNSAL de Chile^17-11. El análisis epidemiológico del comportamiento de la infección por ANDV en Chile, indica que la infección es más frecuente (70%) en hombres jóvenes, con promedio de edad de 32 años, pudiendo también afectar a niños bajo 15 años de edad (15% de los casos); su distribución estacional es predominantemente de primavera y verano, y una proporción importante de los casos (30%), se presenta en grupos familiares (más de un caso en el hogar). Globalmente, las infecciones notificadas al MTNSAL tienen una letalidad de 37%; sin embargo, diversos estudios han determinado que la infección tiene una expresión clínica variable, distinguiéndose diversos grados de gravedad¹³⁸"¹⁰. Esta variabilidad clínica podría ser explicada por diferentes factores, entre los cuales se pueden destacar: diversidad en las características patogénicas del agente infeccioso, el tamaño del inoculo inhalado o la constitución genética del huésped¹².

Desde el punto de vista patogénico, existen evidencias que indican que las principales manifestaciones clínicas del SCPH, podrían estar asociadas a la respuesta inmunológica del huésped, más que a un daño anatómico o funcional inducido por el virus¹³¹⁴. Al respecto, estudios in vitro e in vivo han demostrado que hantavirus no es un virus lítico, ya que no se observa efecto citopático en las células infectadas¹⁵"¹⁷, ni un daño estructural en las células de tejidos infectados. En diversos estudios se han ido reuniendo evidencias que apuntan al rol patogénico de la respuesta inmune, tal como los elevados niveles plasmáticos de IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, y FNTα detectados en pacientes y en monos infectados¹⁸¹⁹, la presencia, durante la fase aguda de la infección, de una alta proporción de células circulantes caracterizadas como linfocitos T (CD8+)¹⁴, denominadas inmunoblastos y el alto número de células productoras de citoquinas pro-inflamatorias detectadas en tejidos de pulmón de individuos fallecidos²⁰.

En varios trabajos se ha establecido que esta respuesta inmune celular está restringida por algunos alelos del sistema HLA¹⁴²¹"²⁴. Por otra parte, en un modelo murino en el que se administra la proteína N recombinante (Nr) del virus Puumala (PUUV, variedad de hantavirus de Europa), se encontró que el nivel de la respuesta humoral y celular estaba influenciada por el genotipo de los roedores, indicando que el haplotipo del huésped juega un papel importante en la respuesta inmune contra la pro teína N de PUUV²⁵.

Existen, por lo tanto, fundamentos para iniciar un estudio de asociación entre genes del sistema inmune del huésped y enfermedad por hantavirus. La variabilidad genética en este sistema podría ser una posible explicación para la expresión clínica variable observada en esta enfermedad. El enfoque inicial se dirige hacia el complejo mayor de histocompatibilidad humano, denominado sistema HLA.

El complejo HLA es el sistema genético más poli-mórfico en los seres humanos, con numerosos alelos y, por lo tanto, numerosas combinaciones genéticas. Las moléculas codificadas por el sistema HLA son responsables de la presentación de antígenos. Los linfocitos reconocen los antígenos cuando ellos están ligados a las moléculas HLA²⁶²⁷. Desde el punto de vista genético, el sistema HLA está ubicado en el brazo corto del cromosoma 6, ocupando una región de aproximadamente 4.000 Kb. Consta de varios loci, los cuales, de acuerdo con su estructura y función, se dividen en tres regiones denominadas Clase I, Clase II y Clase III²⁸.

La región I, incluye varios loci de los cuales, los loci HLA A, HLA B y HLA C, son los estudiados con mayor frecuencia. Cada uno de estos loci codifica para la síntesis de los antígenos correspondientes.

La región II consta de varios loci, de los cuales los loci HLA DR, HLA DP y HLA DQ, han sido los más comúnmente estudiados. Estos loci codifican para los antígenos respectivos.

La región III incluye a genes que no pertenecen al sistema HLA, entre los cuales podemos mencionar los genes que participan en la síntesis de los factores del complemento como son C2, C4A y C4B, así como también el gen FNTa, entre otros.

El sistema HLA es polimórfico. Cada uno de los loci HLA tiene numerosos alelos, los cuales se heredan en forma mendeliana co-dominante. Cada alelo codifica para la síntesis del antígeno respectivo. Los antígenos se denominan con la letra del locus y un número; por ejemplo Al, A2, A28, B7, B27, DR1, DR3. Hace excepción el locus C, los antígenos de este locus se denominan con la letra del locus, la letra w y un número, ejemplo Cwl, Cw2, etc., para diferenciarlos de los factores del complemento. Los alelos correspondientes se denominan con la letra del locus, un asterisco y un número. Se utiliza un número de dos a ocho dígitos para denominar a los alelos²⁹.

Aunque existen numerosos trabajos de asociación entre el sistema HLA y enfermedades infecciosas³⁰, son muy escasas las publicaciones en las cuales se ha estudiado la asociación entre estos genes y el curso clínico de la infección por hantavirus y no se ha publicado ninguno en relación con ANDV³¹"³⁵. El presente trabajo tiene por objetivo evaluar si la constitución genética de los individuos tiene relación con la evolución clínica de la infección por hantavirus. El diseño elegido para realizar esta evaluación involucra la determinación de los alelos de los loci A, B, DRB1 y DQB1 del sistema mayor de histocompatibilidad humano, denominado sistema HLA³⁶.

Material y Métodos

Pacientes. La población de pacientes en este estudio incluye:

• Individuos con infección aguda por hantavirus confirmada identificados en estudios epidemiológicos, clínicos o intervencionales realizados por el Programa "Hantavirus: ecología y enfermedad en Chile".
• Individuos notificados al Ministerio de Salud con infección confirmada por hantavirus que, posteriormente, fueron contactados por el equipo investigador.
• Estudios de seroprevalencia en comunidades de alto riesgo, en las que se identificaron pacientes seropositivos.

A cada sujeto se le explicó el estudio y se obtuvo consentimiento informado por escrito.

De cada persona participante en el estudio, se obtuvo información epidemiológica y clínica a través de una encuesta y, además, una muestra de sangre de 12 ml. A todos ellos se les confirmó la infección por hantavirus, a través de la presencia de anticuerpos contra el virus Andes (IgG o IgM), utilizando un ensayo de ELISA³⁷³⁸.

Para efectos de determinar si existía una asociación entre constitución genética y evolución clínica de la enfermedad, los pacientes con infección confirmada por hantavirus Andes, fueron clasificados en dos grupos de acuerdo con las siguientes definiciones operativas: enfermedad leve, aquellos pacientes que presentaron una infección caracterizada por síntomas prodrómicos, seguida de compromiso respiratorio leve que no requirió ventilación mecánica y sin desarrollo de compromiso cardiovascular o requerimiento de soporte con fármacos vasoactivos, y enfermedad grave, pacientes que evolucionaron con insuficiencia respiratoria, que requirió ventilación mecánica y/o presentó shock. Estas dos categorías corresponden a una adaptación de la clasificación de gravedad descrita por Vial y cois³⁹, de acuerdo con la que los pacientes, según su gravedad, se clasifican en tres grupos: graves, moderados y leves. Debido a que en el presente estudio se intenta encontrar diferencias genéticas relacionadas con la evolución clínica de la enfermedad, los pacientes de los grupos graves y moderados se incluyeron en la categoría grave de este estudio, puesto que este conjunto de pacientes tiene riesgo vital, a diferencia de los pacientes leves que no lo tienen³⁹.

Determinación del sistema HLA por SSP-PCR (Sequence Specific Primer-Polymerase Chain Reaction). De cada paciente se obtuvo una muestra de 12 mi de sangre, de la cual se separaron las células nucleadas para la obtención de ADN para la tipificación del sistema HLA. La extracción de ADN se realizó mediante el procedimiento de Lahiri y Nurnberger⁴⁰.

Los pacientes fueron genotipificados para los loci HLA A, B, DRBl y DQBl. La determinación de los alelos HLA, se realizó sin conocimiento de la gravedad de la enfermedad de cada paciente. Para cada locus se estudiaron los alelos que se identifican, habitualmen-te, a nivel de baja y mediana resolución según el caso. Los alelos HLA-A y HLA-B se determinaron mediante SSP-PCR de mediana resolución, en tanto los alelos HLA DRB1 y HLA DQB1, se analizaron mediante SSP-PCR de baja resolución. Para esto se utilizaron los sistemas comerciales Low and medium resolution SSP kits, de Invitrogen, E.U.A. y Biotest AG, Alemania. Se siguieron estrictamente las instrucciones dadas por los fabricantes. El método SSP-PCR consiste en una determinación molecular de los alelos HLA, basada en la técnica de RPC, en la que se utilizan mezclas de partidores para identificar los diferentes alelos. Para conocer más detalles sobre la tecnología SSP-PCR se recomienda visitar el sitio http://www.tissue-typing. com. Los productos de RPC fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, teñidos con bromuro de etidio.

Análisis estadístico. Se realizó un análisis descriptivo a través de las frecuencias simples de todas las variables, incluyendo las características demográficas de sexo, edad y la "condición de gravedad de la enfermedad". Las comparaciones por grupo (grave y leve) se verificaron a través de la prueba de t-test en el caso de variables continuas y χ² para las variables categóricas. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas para p < 0,05. Se utilizó SPSS versión 12.0.

Se obtuvo el genotipo de cada individuo para los loci HLA A, B, DRB 1, DQB 1. Con esta información se procedió obtener las frecuencias alélicas para estos cuatro loci en los dos grupos de pacientes (evolución leve y grave), utilizando el método de máxima verosimilitud basado en el algoritmo EM (Expectation-Maximization Algorithm) a través del programa informático ARLEQUÍN V2.0⁴¹.

Se realizó un análisis comparativo de frecuencias génicas, entre ambos grupos de pacientes (evolución leve y grave). La significación estadística de las diferencias de frecuencias de alelos entre pacientes graves y leves fue evaluada a través del método de simulación de Monte Cario, utilizando tablas de contingencias RxC, basadas en el algoritmo de Roff y Bentzen que utiliza 10.000 replicaciones de permutaciones de alelos, entre ambos grupos⁴². Brevemente, este método consiste en generar, en forma aleatoria, todas las distribuciones posibles de alelos y en esta generación ver con qué frecuencia ocurrió la distribución exacta que se observa en los datos. Esta es una estadística no paramétrica que, por lo tanto, no supone ninguna distribución (teórica) conocida. Por este mismo método, se realizó un análisis comparativo de la constitución genética para la totalidad de los alelos HLA estudiados, entre ambas muestras (pacientes graves y leves), obteniéndose un %² total y su respectiva probabilidad de Monte Cario.

Para aquellos alelos que exhibieron diferencias significativas de frecuencias, entre ambos grupos de pacientes, se realizó el cálculo de Odds ratio (OR) y sus respectivos intervalos de confianza del 95%, utilizando el método de Cornfield⁴³, a través del software Epi Infov 6.2⁴⁴.

Resultados

El estudio se realizó con 87 individuos, de los cuales 66% fueron de sexo masculino (57 personas). Se creó una variable llamada "gravedad" que clasifica a todos los pacientes en "leve" o "grave" según la expresión clínica de la evolución del SCPH. La distribución de los pacientes según gravedad, muestra que 41 personas, equivalentes a 47%), fueron clasificados como leves y 53% fueron graves.

El análisis de la condición de gravedad según sexo muestra que en las mujeres se observó 56,7% en la categoría graves, en tanto en los hombres, se observó 50,9%o graves. Esta diferencia no alcanza significancia estadística (χ²).

El promedio de edad de los pacientes fue de 40,5 años para el grupo total, con una desviación estándar de 15,3 (rango entre 2 y 80 años). La media de edad no difiere significativamente entre los pacientes con SCPH leve y grave (t-test).

La mortalidad alcanzó a 12,8% de los pacientes (11 personas), la media de edad de los pacientes fallecidos en promedio fue 6 años mayor que los no fallecidos, (46 años y 40 respectivamente). Sin embargo, esta diferencia no es estadísticamente significativa.

Genotipificación molecular del sistema HLA de clase I y II. En la Figura 1 se muestra la distribución de frecuencias génicas de los alelos HLA del locus A. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas de frecuencias de alelos HLA-A entre los dos grupos de pacientes.

En la Figura 2, se observa la distribución de frecuencias génicas de los alelos HLA del locus B. Se observa una mayor variabilidad genética, encontrándose casi el doble de alelos en comparación al locus A. Los alelos HLA-B*08, HLA-B*14, HLA-B*15, HLA-B*38 y HLA-B*51 fueron más frecuentes en el grupo de pacientes graves. Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. Cabe destacar el alelo HLA-B*08, el cual presenta una frecuencia de 0,0761 en el grupo de pacientes graves y una frecuencia de 0,0122 en los pacientes leves. Si bien esta diferencia no es significativa, tiene una significación estadística marginal (p = 0,06). Por el contrario, los alelos HLA-B*07, HLA-B* 18, HLA-B*35, HLA-B*40 fueron más frecuentes en los pacientes leves, pero estas diferencias de frecuencias génicas tampoco alcanzaron significación estadística.

En la Figura 3, se exhibe la distribución de frecuencias génicas de los alelos HLA del locus DRB1. Para este locus, el alelo HLA-DRB 1*15 se encontró en 11 individuos (12,6%), de los cuales sólo dos hicieron el curso grave de la infección. Por lo tanto, presentó una frecuencia de 0,341 en el grupo de pacientes leves y una frecuencia de 0,0217 en el grupo de pacientes graves. Esta diferencia resultó ser estadísticamente significativa (p = 0,0071) con un valor de Odds ratio de 0,16 [95% CI = 0,02-0,89].

Los alelos HLA-DRB 1*01, HLA-DRB1*03, HLA-DRB 1*13, exhibieron una mayor frecuencia en el grupo de pacientes graves en relación con el grupo de pacientes leves; sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. Se observa, además, una alta frecuencia para el alelo HLA-DRB 1*04 en los dos grupos estudiados.

En la Labia 1, se muestra el genotipo HLA de clase I y II, de los pacientes que resultaron HLA-DRB 1*15 positivos. Los dos pacientes graves que portaban este alelo sobrevivieron a la enfermedad. Por otro lado, ninguno de los pacientes fallecidos o que sufrieron shock, portaba el alelo HLA-DRB 1*15 (datos no mostrados).

En la Figura 4, se muestra la distribución de frecuencias génicas de los alelos HLA del locus DQB1. Para este locus, no se encontraron diferencias de frecuencias génicas estadísticamente significativas, entre ambos grupos. El alelo HLA-DQB1*03 presentó una frecuencia alta en los dos grupos de pacientes, alcanzando valores de 0,47 y 0,50 en los pacientes leves y graves, respectivamente. Cabe destacar también el alelo HLA-DQB1*06 que fue más frecuente en los pacientes leves y estaba presente en todos los pacientes portadores del alelo HLA-DRB1*15.

El χ² de la comparación entre pacientes leves y graves para el conjunto de alelos HLA estudiados, tuvo un valor no significativo (p = 0,2008), lo cual indica que las dos muestras (pacientes leves y graves), no presentan diferencias estadísticamente significativas con respecto a su constitución genética total. Sin embargo, la comparación entre alelos, individualmente, reveló diferencias para los alelos HLA-DRB1* 15 y HLA B*08, de acuerdo con lo señalado anteriormente.

Discusión

Los pacientes que participaron en este estudio, presentaron características epidemiológicas y demográficas similares a los casos de SCPH que ocurren en el país y que son informadas regularmente por el MTNSAL¹¹¹. La edad promedio de nuestros pacientes fue levemente mayor que la de los casos en la experiencia nacional, que es de 31,8 años. Esta diferencia se debe a que nuestro estudio no incluyó los casos bajo 12 años de edad¹¹.

Al igual que en las cifras proporcionadas por MTNSAL, en este estudio la mayoría de los casos de hantavirus ocurrió en hombres en edad productiva, entre 20 y 60 años de edad. Este hallazgo está relacionado con las actividades laborales realizadas por los hombres, que se asocian a un mayor riesgo de contagio¹³⁷³⁸.

La distribución de frecuencias génicas observada en el grupo de pacientes estudiados, concuerda bastante bien con la distribución de frecuencias génicas esperadas para una población chilena rural. Cabe hacer notar que existen muy pocos estudios acerca de la distribución de alelos HLA en la población chilena; sin embargo, en estudios realizados en la población de Santiago⁴⁵⁴⁶, así como también en poblaciones rurales⁴⁷⁴⁸, se ha encontrado que los alelos más frecuentes corresponden a HLA A*02, A*24, A*31, A*68, B*35, B*39,B40, DRBl*04y DRB 1*14, entre otros.

En el presente estudio, se encontró una asociación estadísticamente significativa entre el alelo HLA de clase II, HLA-DRB1*15 y la forma leve de la infección por ANDV. Este alelo presentó una frecuencia génica más alta en el grupo de pacientes leves que en el grupo de pacientes graves. Se obtuvo un OR < 1, lo cual sugiere que este alelo podría estar asociado con protección de desarrollar SCPH. En este contexto, llama la atención que al analizar el genotipo HLA de los pacientes que fallecieron o que desarrollaron shock cardiogénico, ninguno de ellos portaba este alelo; solamente dos pacientes que llevaban este alelo hicieron el curso grave, pero ambos sobrevivieron.

Existe la posibilidad de obtener asociaciones espurias debido a estratificación poblacional. En esta experiencia, sin embargo, este factor de sesgo puede descartarse, debido a que no existen diferencias significativas para el sistema HLA (considerado en su conjunto), entre pacientes graves y leves.

Cabe hacer notar, que se ha encontrado asociación entre el alelo HLA DRB 1*15 y la evolución clínica de diferentes enfermedades. Es así que, el alelo HLA-DRB1*15 en la infección por VIH-1, se ha asociado con una disminución de la transmisión madre-hijo del virus, en diferentes grupos étnicos⁴⁹.

En hepatitis B, el antígeno mayor DR2 (que comprende a HLA-DRB1*15 y HLA-DRB1*16), se ha encontrado, en menor frecuencia, en pacientes con infección crónica⁵⁰⁵¹.

En pacientes alemanes con infección por virus de hepatitis C, se ha encontrado que el alelo HLA-DRB 1*15, específicamente el subtipo molecular DRB 1 * 15011, presenta una frecuencia mayor en aquellos pacientes que hicieron un cuadro autolimitado de la infección⁵², sin evolucionar a la cronicidad.

En un estudio de asociación entre el sistema HLA clase II y Helicobacter pylori, se encontró que el haplotipo HLA-DRB1 * 15-DQA1 *01 -DQB 1*06, específicamente el haplotipo DRB1*1501-DQA1*01021-DQB 1*0602 (considerando los respectivos subtipos moleculares), parece proteger contra la infección por H. pylori en la población japonesa. En tanto, en la población europea, la variabilidad genética de las moléculas de clase II, tiene solamente un impacto menor en el curso clínico y el riesgo de infección con esta bacteria⁵³.

Por otro lado, en este estudio, el alelo HLA de clase I, HLA-B*08 se encontró, con mayor frecuencia, en los pacientes que hicieron el curso clínico grave de la infección. La diferencia observada, si bien no es estadísticamente significativa, bordea la significación estadística (p = 0,06), por lo cual, este alelo podría estar asociado con susceptibilidad para desarrollar SCPH.

Este resultado muestra concordancia con un estudio previo de asociación entre el sistema HLA y el curso clínico de la infección por PUUV realizado en Finlandia con 74 adultos, en el cual se encontró que los alelos HLA-B*08 y HLA-DRB 1*03 (probablemente formando el haplotipo B*08-DRB1*03) estaban asociados con el curso clínico grave de la nefropatía epidémica (NE), un tipo de fiebre hemorrágica con síndrome renal, causada por PUUV³². Posteriormente, este equipo de investigadores realizó un estudio con 39 niños con NE, entre 5 y 15 años de edad y encontraron que 51% de ellos eran portadores del haplotipo B*08-DRB1*03, en tanto en la población general de Finlandia, la frecuencia de este haplotipo, corresponde a 19%. Sin embargo, no se encontraron diferencias en relación con el cuadro clínico entre los niños B*08-DRB1*03 positivos y negativos³⁴.

Llama la atención que dos estudios realizados en dos poblaciones diferentes y geográficamente muy distantes entre sí, coincidan en que el alelo HLA-B*08 esté asociado con el curso grave de la infección por hantavirus, ya sea, ANDV o PUUV. Este hecho pareciera indicar que el alelo HLA B*08 podría estar asociado a desarrollar una forma grave de infección por hantavirus¹³³¹"³⁴.

Además, cabe hacer notar que el alelo HLA-B*08, se ha asociado con varias enfermedades autoinmunes tales como lupus sistémico, enfermedad celíaca, tiroi-ditis, enfermedad de Addison, diabetes mellitus tipo I y hepatitis crónica activa⁵⁴.

Finalmente, para el locus DQB1 se encontró una frecuencia alta del alelo HLA-DQB1*03 en los dos grupos de pacientes; además, se observó una alta homocigosidad; un tercio de los pacientes fueron homocigotos para este locus. Al respecto, Thio y cois⁵⁵, encontraron que la heterocigocidad para el locus DQB 1 estaba asociada con el curso favorable de la infección por el virus de hepatitis B. Según se deduce de este trabajo, la homocigosidad para este locus podría ser considerada una desventaja inmunológica para la infección por ANDV.

El mecanismo subyacente a la asociación entre un alelo HLA y la infección por hantavirus no es claro. La razón por la cual un determinado alelo HLA puede ser beneficioso en la infección por hantavirus, podría relacionarse con una más eficiente presentación de los antígenos de ANDV por parte de la molécula HLA, como podría ser el caso de la molécula HLA-DRB 1*15 en este estudio³⁶. Este tipo de explicación, también se ha postulado para otras enfermedades infecciosas. Así, en la infección por VIH-1 el alelo HLA-DRB1*15 también tiene un rol protector⁴⁹. Para otras moléculas de clase II, como es el caso de HLA-DRB1*13 en la infección por el virus de hepatitis B, también se ha sugerido un mecanismo protector, es decir, presentación eficiente por una unión péptido viral-HLA óptima⁵⁶.

El alelo HLA DRB1*15 podría codificar para una proteína que resulte ser estructuralmente mejor presentadora de antígenos virales a los receptores de las células L (LCR) y así lograr una mejor estabilidad del complejo HLA clase II-antígeno-LCR, lo cual permitiría una mejor activación de las células LCD4+³⁶⁵⁷. La activación de linfocitos LCD4+, permite la diferenciación de las células B a células plasmáticas, las cuales sintetizan y secretan las inmunoglobulinas, que permitirían neutralizar al virus en etapas tempranas de la infección. Otra alternativa es que el alelo HLA-DRB 1 * 15 esté ligado a otro gen relacionado con el curso clínico de la infección por ANDV y que no haya sido descrito aún.

Por otra parte, la posible asociación del alelo HLA-B*08 con el curso clínico grave de la infección por ANDV, podría deberse a que este alelo codificaría para una proteína que funcionara como eficiente presentadora de antígenos virales a las células L citotóxicas CD8+¹³, las que secretarían altas concentraciones de citoquinas pro-inflamatorias, tales como FNTα e IFNγ, que serían las causantes del daño tisular, así como la permeabilidad capilar en el pulmón¹⁴¹⁶ que, posteriormente, da origen a edema, produciéndose, finalmente, falla cardio-respiratoria y muerte en un alto porcentaje de los casos⁸"¹⁰.

En conclusión, nuestros resultados indican que el curso clínico de la infección por ANDV podría estar asociado con el genotipo HLA de los pacientes. Así, el alelo HLA-DRB1*15, se encontró asociado con el curso benigno de la infección por ANDV, en tanto el alelo HLA-B*08, podría estar asociado con el curso grave de SCPH. Las asociaciones descritas deben ser confirmadas aumentando el número de pacientes; no obstante, estos resultados representan un paso inicial en la identificación de genes que pudieran estar relacionados con la evolución clínica de SCPH. Los mecanismos involucrados en la asociación entre alelos HLA y el curso clínico de la enfermedad producida por ANDV aún no son claros, de manera que se requiere seguir realizando investigaciones en este campo.

Agradecimientos. Queremos agradecer a los enfermeros, Lia Yánez, Jovita Mardones, Marco Acuña y Laudelina García, del Proyecto Hantavirus: Ecología y Enfermedad en Chile, por su labor en el reclutamiento de pacientes, toma y envío de muestras. A Mariis Tager, Pediatra del Hospital de Valdivia y Rita Mansilla, Epidemióloga del Servicio de Salud de Valdivia.

Referencias

1.- Sotomayor V. Hantavirus. El Vigía. Boletín de Vigilancia en Salud Pública de Chile 2005; 8: 38-40.

2.- Frank S, Jeffrey J. The probability of severe disease in zoonotic and commensal infections. Proc R Soc Lond B 2001; 268: 53-60.

3.- Toro J, Vega J, Khan A, Mills J, Padula P, Terry W, et al. An outbreak of hantavirus pulmonary syndrome, Chile, 1997. Emerg Infect Dis 1998; 4: 687-94.

4.- Tischler N, Fernández J, Müller I, Martínez R, Galeno H, Villagra E, et al. Complete sequence of genome of the human isolate of Andes virus CHI-7913: comparative sequence and protein structure analysis. Biol Res 2003; 36: 201-10.

5.- Spotorno A, Palma E, Valladares J. Biología de roedores reservorios de hantavirus en Chile. Rev Chil Infect 2003; 17: 197-210.

6.- Murúa R, Navarrete M, Cádiz R, Figueroa R, Padilla P, Zaror L, et al. Síndrome pulmonar por hantavirus: Situación de los roedores reservorios y la población humana en la Décima Región, Chile. Rev Méd Chile 2003; 131: 169-76.

7.- Encuesta Nacional de Salud Chile 2003. Enfermedades Transmisibles: Prevalencia de virus de hepatitis, hantavirus y virus papiloma humano (Informe corregido). Disponible en http://epi.minsal.cl/html/ invest/ENS/ENS.

8.- Castillo C, Naranjo L, Ossa G. Síndrome cardiopulmonar por hantavirus en 21 adultos en la IX Región de Chile. Rev Chil Infect 2000; 17: 241-7.

9.- Riquelme R, Riquelme M, Torres A, Rioseco M, Vergara J, Scholz L. et al. Hantavirus pulmonary syndrome in southern Chile. Emerg Infect Dis 2003; 9: 1438-43.

10.- Ferres M, Vial P. Hantavirus infection in children. Curr Opin Pediatr 2004; 16: 70-5.

11.- Boletín Epidemiológico de Hantavirus. Situación al 25 agosto de 2006, MINSAL:http://epi.minsal.cl/epi/html/bolets/reportes/Hantavirus/Hantavirus. pdf.

12.- Villar J, Maca-Meyer N, Pérez-Méndez L, Flores C. Bench-to-bedside review: Understanding genetic predisposition to sepsis. Crit Care 2004; 8: 180-9.

13.- Terajima M, Vapalahti O, Van Epps H, Vaheri A, Ennis F. Immune responses to Puumala virus infection and the pathogenesis of nephropathia epidémica. Microbes Infect 2004; 6: 238-45.

14.- Kilpatrick E, Terajima M, Koster F, Catalina M, Cruz J, Ennis F. Role of specific CD8+ T cells in the severity of a fulminant zoonotic viral hemorrhagic fever, Hantavirus Pulmonary Syndrome. J Immunol 2004; 172: 3297-304.

15.- Temonen M, Vapalahti O, Holthofer H, Brummer-Korvenkontio M, Vaheri A, Lankinen H. Susceptibility of human cells to Puumala virus infection. J Gen Virol 1993;74 (Pt 3): 515-8.

16.- Hjelle B. Chapter 39. Rodent-Borne Viruses. En: Specter S, Hodinka R and Young S. Clinical Virology Manual 3^rd edition, edited by: Specter S, Hodinka R and Young S. ASM Press, Washington DC, USA 2000;568-78.

17.- Hooper J, Larsen T, Custer M, Schmaljohn C. A lethal disease model for hantavirus pulmonary syndrome. Virology 2001; 289:6-14.

18.- Linderholm M, Ahlm C, Settergren B, Waage A, Tarnvik A. Elevated plasma levels of tumor necrosis factor (TNF)-a soluble. TNF receptor, interleukin (IL)-6, and IL-10 in patients with hemorrhagic fever with renal syndrome. J Infect Dis 1996; 173: 38-43.

19.- Klingstróm J, Plyusnin A, Vaheri A, Lundkvist A. Wild-type Puumala hantavirus infection induces cytokines, C-reactive protein, and nitric oxide in cynomolgus macaques. J Virol 2002; 76: 444-9.

20.- Mori M, Rothman A, Kurane I, Montoya J, Nolte K, Norman J, et al. High levels of cytokine-producing cells in the lung tissues of patients with fatal hantavirus pulmonary syndrome. J Infect Dis 1999; 179: 295-302.

21.- Ennis F, Cruz J, Spiropoulou CF, Waite D, Peters C J, Nichol S T, et al. Hantavirus Pulmonary Syndrome: CD8+ and CD4+ cytotoxic T lymphocytes to epitopes on Sin Nombre virus nucleocapsid protein isolated during acute illness. Virology 1997; 238:380-90.

22.- Van Epps H, Schmaljohn C, Ennis F. Human memory cytotoxic T-lymphocyte (CTL) response to Hantaan virus infection: Identificaction of virus-specific and cross-reactive CD8+ CTL epitopes on 35. nucleocapsid protein. J Virol 1999; 73: 5301-8.

23.- Lee KY, Chun E, Kim NY, Seong BL. Characterization of HLA-2.1-restricted epitopes, conserved in both Hantaan and Sin Nombre viruses, in Hantaan virus-infected patients. J Gen Virol 2002; 83: 1131-6.

24.- Van Epps H, Tejarima M, Mustonen J, Arstila T, Corey E, Vaheri A, et al. Long-lived memory T lymphocyte responses after hantavirus infection. J Exp Med 2002; 196: 579-88.

25.- De Carvalho Nicacio C, Sallberg M, Hultgren C, Lundkvist A. T-helper and humoral response to Puumala hantavirus nucleocapsid protein: identification of T-helper epitopes in a mouse model. J Gen Virol 2001; 82: 129-38.

26.- Furusho J K Y. Papel de los genes del complejo principal de histocompatibilidad en los procesos infecciosos. Rev Invest Clin 2000; 52(4): 461-6.

27.- Fernándes A, Maciel L, Foss M, Donadi E A. Como entender a associacao entre o sistema 40. HLA e as doencas auto-imunes endocrinas. Arq Bras Endocrinol Metab 2003; 47: 601-11.

28.- Trowsdale J, Ragoussis J, Campbell R. Map of the human MHC. Immunol Today 1991; 12: 443-6.

29.- Marsh S, Parham P, Barber L. The HLA Facts Book. Ed. Academic Press, 2000. London UK.

30.- Cooke G, Hill A. Genetic of susceptibility to human infectious disease. Nat Rev Genet 2001; 2: 967-77.

31.- Mustonen J, Partanen J, Kanerva M, Pietila K, Vapalahti O, Pasternack A, et al. Genetic susceptibility to severe course of nephropathia epidémica caused by Puumala hantavirus. Kidney International 1996; 49: 217-21.

32.- Mustonen J, Partanen J, Kanerva M, Pietila K, Vapalahti O, Pasternack A, et al. Association of HLA B27 with benign clinical course of nephropathia epidémica caused by Puumala hantavirus. Scand J Immunol 1998; 47: 277-9.

33.- Makela S, Mustonen J, Ala-Houhala I, Hurme M, Partanen J, Vapalahti O, et al. Human leukocyte antigen-B8-DR3 is a more important risk factor for severe Puumala hantavirus infection than the tumor necrosis factor-a (-308) G/A polymorphism. J Infect Dis 2002; 186: 843-6.

34.- Mustonen J, Huttunen Np, Partanen J, Baer M, Paakkala A, Vapalahti O, et al. Human leukocyte antigens B8-DRB1*03 in pediatric patients with nephropathia epidémica caused by Puumala hantavirus. Pediatr Infect Dis J 2004; 23: 959-61.

35.- Koster F,Vigil J, Olson D, Terajima M, Ennis F, Moehenkamp C, et al. Class I, II and III alíeles associated with severe Hantavirus Cardiopulmonary Syndrome in the Southwest US. Am J Trop Med 2001; 65: 152 (Abstr).

36.- Klein J, Sato A. The HLA system. N Engl J Med 2000; 343: 702-9.

37.- Castillo C, Sanhueza L, Tager M, Muñoz S, Ossa G, Vial P. Seroprevalence of antibodies against hantavirus in 10 communities of the IX Region of Chile where hantavirus infection were diagnosed. Rev Méd Chile 2002; 130: 251-8.

38.- Tager M, Vial P, Castillo C, Godoy P, Hjelle B, Ferres M. Hantavirus prevalence in the IX Region of Chile. Emerg Infect Dis 2003; 9: 827-32.

39.- Vial P A, Valdivieso F, Ferrés M. Enfermedad por hantavirus en Chile: Epidemiología, cuadro clínico y diagnóstico. En: Manejo del Paciente Crítico con Síndrome Cardiopulmonar por Hantavirus. Ed. Salesianos S.A., 2004; pp 23-44.

40.- Lahiri D K, Nurnberger J I. A rapid non-enzymatic method for the preparation of HMW DNA from blood for RFLP studies. Nucl Acids Res 1991; 19: 54-44.

41.- Schneider S, Kueffer J M, Roessli D, Excoffier L. Arlequín (ver 1.1): A software for population genetics data analysis. Genetics and Biometry Laboratory, Geneva, 1997.

42.- Roff D, Bentzen P. The statistical analysis of mitochondrial DNA polymorphism: y and the problem of small samples. Mol Biol Evol 1989; 6: 539-45.

43.- Cornfield J. A statistical problem arising from retrospective studies. In: Proceedings of the Third Berkley Symposium, 1956;135-148. Volume IV (Negman, J. ed.). University of California Press, Berkley.

44.- Dean A, Dean J, Burton A Dicker R. Epi Info: A general-purpose microcomputer program for public health information system. Am J Prev Med 1991; 7: 178-82. Disponible en http://www.cica.es/epinfo/ programa.htm.

45.- Rodriguez L, Scagliotti P, Quiroga, T. Antígenos HLA-A, B, C y DR en una población urbana de Santiago, Chile. Rev Méd Chile 1993; 121: 523-9.

46.- Llop E, Hirsch S, de la Maza M, Dunout D, Iturriaga H, Silva C, et al. Sistema mayor de histocompatibilidad como factor de riesgo de la enfermedad hepática alcohólica. Rev Méd Chile 1995; 123: 687-93.

47.- Llop E, Harb Z, Moreno R, Rothhammer F. Genetic marker variation in coastal populations of Chile. Homo 2002; 53: 170-7.

48.- Droguett M A, Oyarzun M J, Alruiz P, Jerez V, Mezzano S, Ardiles L. Human leukocyte antigens in indigenous (Mapuche) people in a regional renal transplantation program in Chile. Transplant Proc 2005;37: 3367-71.

49.- Winchester R, Chen Y, Rose S, Selby J, Borkowsky W. Major histocompatibility complex class II DR alíeles DRB1*1501 and those encoding HLA-DR13 are preferentially associated with a diminution in maternally transmitted human immunodeficiency virus 1 infection in different ethnic groups: Determination by an automated sequence-based typing method. Proc Nati Acad Sci 1995; 92: 12374-8.

50.- Almarri A, Batchelor J R. HLA and hepatitis B infection. Lancet 1994; 344: 1194-5.

51.- Hill A V. The immunogenetics of human infectious disease. Annu Rev Immunol 1998; 16: 593-617.

52.- Lechmann M, Schneider E M, Giers G, Kaiser R, Dumoulin F L, Sauerbruch T, et al. Increased frequency of the HLA-DR15 (Bl*15011) alíele in Germany patients with self-limited hepatitis C virus infection. Eur J Clin Invest 1999; 29: 280-3.

53.- Kunstmann E, Hardt C, Treitz H, Suerbaum S, Faller G, Peitz U, et al. In the European population HLA-class II genes are not associated with Helicobacter pylori infection. Eur J Gastroenterol Hepatol 2002; 14: 49-53.

54.- Shiina T, Inoko H, Kulski J K. An update of the HLA genomic region, locus information and disease associations. Tissue Antigens 2004; 64: 631-49.

54.- Thio C, Thomas D, Karacki P, Gao X, Marti D, Kaslow R, et al. Comprehensive analysis of class I and class II HLA antigens and chronic hepatitis B virus infection. J Virol 2003; 77: 12083-7.

56.- Cao T, Desombere I, Vanlandschoot P, Salberg M, Leroux-Roels G. Characterization of HLA-DR13-restricted CD4+ T cell epitopes of hepatitis B core antigen with self-limited, acute hepatitis B. J Gen Virol 2002; 83: 3023-33.

57.- Brostoff J, Male D, Roitt I. Capítulo 27: Autoinmunidad y enfermedades autoinmunitarias. Capítulo 22: Hipersensibilidad de tipo I. Capítulo 11: Regulación de las respuestas inmunitarias. Inmunología, cuarta edición. Madrid: Harcout Brace; 1997, p.27.1-27.13; p.22.1-22.17; y p.11.1-11.14.

Fuente de Financiamiento: Grant US PHS, NIH, NIAID, #AI45452 (Hantavirus: Ecología y Enfermedad en Chile). Proyecto Fondecyt N°1040155.

Recibido: 6 diciembre 2006, Aceptado: 24 julio 2007

Correspondencia a: Elena Llop Romero ellop@med.uchile.cl