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Revista chilena de infectología

versión impresa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. v.19  supl.1 Santiago  2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182002019100009 

Perspectivas de la secuenciación de genomas bacterianos
: nuevas estrategias en el desarrollo de
terapias antimicrobianas

OMAR ORELLANA O.1

1 Programa de Biología Celular y Molecular. Instituto de Ciencias Biomédicas. Facultad de Medicina, Universidad de Chile.

PERSPECTIVES IN SEQUENTATION OF BACTERIAL GENOMES:
NEW STRATEGIES IN THE DEVELOPMENT OF ANTIMICROBIAL THERAPIES

INTRODUCCIÓN

Basado en estudios morfológicos y evolutivos, actualmente los seres vivos se clasifican en tres dominios filogenéticos: bacterias, arqueas y eucariontes. Mediante el análisis de las secuencias de los ARN ribosomales (16S y 5S), se ha propuesto que, a partir de un ancestro común, durante el curso de la evolución se originaron en primer lugar las bacterias y un tipo celular que fue el ancestro para arqueas y eucariontes. Posteriormente este último se diferenció en los correspondientes tipos celulares.

En cuanto a su organización subcelular y molecular, las bacterias y las arqueas son los organismos más simples de la naturaleza. Generalmente son unicelulares y no cuentan con organelos definidos. El material genético se encuentra organizado en un denominado nucleoide que corresponde al cromosoma compactado. En estos organismos no existe un núcleo definido por una membrana que constituye una separación física entre éste y el citoplasma. Este hecho tiene consecuencias determinantes en los mecanismos de expresión génica que diferencian notoriamente a estas células de los eucariontes.

Información genética

En la conservación de las especies y en la función celular juega un papel central el material genético. Este conjunto de información que determina las características de las células está archivado, en todos los organismos, en el ADN. Si bien es cierto esta molécula se la puede considerar un archivo de información, éste es un archivo dinámico puesto que la replicación del ADN es la base de la herencia y variabilidad genética y la expresión de la información es la base de la función celular. En las bacterias, el material genético está constituido mayoritariamente por una molécula de ADN circular (entre 0,5 y 10 millones de pares de bases) y además por un conjunto variable en número de moléculas relativamente pequeñas de ADN circular (5 a 100 mil pares de bases) denominadas plásmidos. En muchas ocasiones el material genético puede contener inserciones de elementos extracromosomales como virus en estado latente o elementos móviles (transposones). Este conjunto de moléculas de ADN constituye el genoma bacteriano.

Una de las características más intrigantes que se ha revelado mediante los estudios recientes de los genomas bacterianos es su enorme plasticidad. Es frecuente la transferencia horizontal de genes entre bacterias de la misma o diferentes especies. En este tráfico de ADN entre bacterias juegan un papel determinante los plásmidos y los virus (bacteriófagos), que mediante procesos de conjugación o transducción respectivamente, pueden transferir fácilmente material genético entre bacterias. Este hecho es particularmente relevante en medicina, puesto que por este medio se transfiere gran parte de la resistencia a antimicrobianos.

El ADN es una macromolécula constituida por dos cadenas lineales de polinucleótidos. En cada cadena, los nucleótidos están enlazados entre sí por enlaces fosfodiéster entre el azúcar y los fosfatos, constituyendo el esqueleto de la macromolécula. Cada nucleótido está formado, además, por una base nitrogenada que puede ser guanina, adenina (bases púricas), citosina o timina (bases pirimídicas). Estas bases pueden formar enlaces de puente de hidrógeno complementarios, generándose los pares de bases adenina-timina o guanina-citosina. Las dos cadenas del ADN se enlazan entre sí a través de estos puentes de hidrógeno complementarios en toda la extensión de las macromoléculas. Por lo tanto ambas cadenas son complementarias entre sí. Las dos cadenas de ADN forman la doble hélice cuya estructura fue resuelta mediante cristalografía de rayos X en el año 1953 por Watson y Crick. La secuencia de los nucleótidos es característica de cada organismo y constituye la base molecular de su identidad. En el proceso de duplicación celular, a través de la replicación semiconservativa se obtienen dos moléculas de ADN idénticas a partir de la parental. Estas moléculas se segregan quedando cada célula con una de éstas. Este proceso es la base de la herencia de la información genética.

En el ADN se encuentra codificada la información necesaria para la función celular (información genética). Esto quiere decir que, tanto los ácidos ribonucleicos como las proteínas que hacen posible que se realicen los procesos biológicos, están codificados en el ADN. En todos los organismos las proteínas están codificadas por un conjunto de tripletes de nucleótidos (codones) que contiene la información para aminoácidos (código genético). En general existe más de un triplete para cada aminoácido, pero cada triplete codifica para un sólo aminoácido. Existen además, codones que indican el inicio y término de la información para una proteína.

En las bacterias todos los codones para una proteína se localizan en forma secuencial, adyacentes uno a otro en el ADN, sin interrupciones (en eucariontes, la mayoría de los genes están interrumpidos por los denominados intrones). Los genes para varias proteínas pueden estar localizados en forma consecutiva en el ADN y su expresión puede estar controlada por una señal común de inicio y de término de la transcripción, que permite la expresión coordinada de los genes en cuestión (operón). Generalmente los genes que forman parte de un operón están relacionados funcionalmente, es decir forman parte del conjunto de proteínas que llevan a cabo un proceso bioquímico determinado. Por lo tanto el genoma corresponde al conjunto de segmentos de ADN que codifican la información para proteínas y ácidos nucleicos (genes estructurales) y segmentos de ADN que codifican los elementos necesarios para el control de la expresión de la información genética (promotores de la transcripción, genes reguladores entre otros). La determinación de la secuencia de nucleótidos de un gen particular, y del genoma en su totalidad, aporta la información necesaria para predecir la secuencia de los aminoácidos de las proteínas codificadas y de los elementos que participan en el control de la expresión de todos y cada uno de los genes. Esta información es necesaria para comprender el mecanismo molecular de los procesos celulares y de los posibles factores intra o extracelulares que pueden alterar ese proceso. En particular, en el caso de las bacterias patógenas, puede ser una herramienta muy útil para comprender los mecanismos de patoge-nicidad y para el diseño de terapias antimicrobianas.

Expresión de la información genética

En la célula se debe expresar la información genética necesaria para que se lleven a cabo los procesos moleculares, y en su conjunto los procesos fisiológicos, que hacen posible que una célula se multiplique y pueda desarrollar su función. En las bacterias, uno de los objetivos fundamentales de la expresión genética es la adaptación de la célula al medio ambiente en que se encuentra, para hacer posible la sobrevivencia y multiplicación. En la expresión de un gen se pueden distinguir dos etapas clave: la transcripción y la traducción del mensaje genético. La primera corresponde a la síntesis por parte de una ARN polimerasa de un ARN mensajero (mRNA) que es complementario a una de las hebras de ADN que codifica para el gen. La expresión de la mayoría de los genes bacterianos se regula en esta etapa mediante mecanismos moleculares variados. En la segunda etapa, el mRNA se une a los ribosomas y con la participación de los aminoacil-tRNA y una serie de proteínas, se traduce el mensaje genético de un código basado en una secuencia de nucleótidos (mRNA) a uno basado en una secuencia de aminoácidos (proteína). En bacterias este proceso también es regulado. Un hecho particular de los organismos procariotes (bacterias y arqueas) es que tanto la transcripción como la traducción del mensaje genético se realizan en el mismo compartimento celular y ocurren consecutivamente. Este hecho genera las condiciones para que estos procesos se puedan coordinar mediante mecanismos particulares diferentes a los de los organismos eucariontes.

Tanto los procesos de replicación del ADN, como la transcripción y la traducción del mensaje genético pueden ser inhibidos por antimicrobianos. La identificación de moléculas que inhiban estos procesos específicamente en bacterias es crucial para diseñar terapias anti-microbianas.

Mapas genéticos (secuenciación de genomas)

Mediante los estudios de la genética clásica se logró dilucidar una serie de procesos celulares bacterianos fundamentales como la regulación de la expresión, los mecanismos de transferencia y recombinación génicas. Desde los inicios de la era de la manipulación genética (ingeniería genética) en la década de los 70 y la secuenciación del ADN en los 80, se ha comprobado, profundizado y se han ampliado los conocimientos sobre éstos y otros procesos celulares. Durante los últimos diez años, la secuenciación de ADN se ha automatizado, permitiendo la obtención de información de secuencias a gran escala en tiempos relativamente cortos (un genoma bacteriano completo puede llegar a ser secuenciado en pocas semanas). Esta tecnología abre grandes posibilidades para abordar los procesos celulares en el nivel genético, desde una perspectiva global. Por ejemplo es posible predecir y comprobar, entre otros, el conjunto de genes que puede estar involucrado en la interacción de un agente patógeno con el hospedero e identificar los genes responsables de la virulencia. Desde que en 1995 se publicó la secuencia completa del genoma de Haemophilus influenzae, hasta la fecha, se han secuenciado más de cuarenta genomas bacterianos. Entre éstos se cuentan los de microorganismos como Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y Treponema pallidum, agentes causales de graves patologías en humanos. Con esta información ha sido posible determinar los genes responsables de procesos que son comunes a todas las bacterias y, más importante aún, aquellos genes que son exclusivos de una determinada especie bacteriana. Probablemente estos últimos hacen posible su particular estilo de supervivencia y adaptación al medio en que proliferan. Se han identificado, por ejemplo, los genes que distinguen a Mycobacterium bovis de Mycobacterium tuberculosis haciendo posible establecer aquellos que pueden ser responsables de la especificidad de hospedero de ambas especies bacterianas.

A partir de la secuencia de genomas completos, se han desarrollado métodos de análisis de la expresión global a nivel del ARN mensajero (genómica funcional) o las proteínas (proteómica). Con estas herramientas ha sido posible identificar en M. tuberculosis algunos genes que se expresan diferencialmente en las bacterias que proliferan intracelularmente en macrófagos, comparada con las que lo hacen en un medio de cultivo artificial. Esta información es de especial relevancia en la identificación de proteínas que pueden ser blanco para terapias antimicrobianas con fármacos o vacunas.

Perspectivas de la secuencia de genomas en el desarrollo de agentes antimicrobianos

Desarrollo de vacunas. De los avances en la información sobre la secuencia de genomas bacterianos es posible el desarrollo de estrategias para la generación de nuevas vacunas. Una de éstas consiste en la identificación de todo el conjunto de genes que potencialmente codifican para proteínas de membrana externa. Esta predicción se basa en la información sobre las características estructurales que son generales a todas estas proteínas. Se determina cuáles de éstas efectivamente se expresan y se localizan en la periferia celular. Mediante técnicas de ingeniería genética, estos genes se expresan in vitro, se obtiene la proteína en grandes cantidades y se procede a realizar ensayos de inmunogenicidad. Con aquellas proteínas que resulten potenciales candidatas, se procede a la generación de posibles vacunas que se analizan por los procedimientos clásicos.

Agentes antimicrobianos. Con la información del genoma completo se puede identificar posibles proteínas que son específicas de un microorganismo patógeno particular y que se expresan sólo en el sitio de infección (en forma intracelular o en el tejido infectado). Estas proteínas son potenciales blanco para la inactivación de su función por la acción de agentes terapéuticos, como antibacterianos. De esta manera se generan vías para el diseño de terapias racionales basadas en el conocimiento de los mecanismos moleculares esenciales para ese microorganismo. Otra variante de esta estrategia es el diseño racional in silico (predicción en el computador) de moléculas con propiedades antibióticas basado en la identificación y predicción (o determinación) de la estructura de posibles proteínas blanco desde el conjunto de proteínas codificadas en el genoma del microorganismo de interés. La combinación de la genómica funcional y la proteómica junto con el desarrollo de poderosas herramientas para la determinación de estructuras de proteínas, son pilares fundamentales para la implementación de estas estrategias.

En conclusión, la secuenciación genómica modifica los paradigmas para el estudio de las bases moleculares de los procesos biológicos. Este enfoque de la biología abre nuevas vías para el desarrollo de herramientas para la terapia antimicrobiana.

Agradecimientos. Agradezco a J. Salazar y R. Zúñiga, alumnos de postgrado y a P. Arancibia, alumna de la carrera de Medicina de la Universidad de Chile, por la discusión del texto de este artículo. Financiado por Fondecyt y Universidad de Chile.

LECTURAS RECOMENDADAS

1.- Woese C. Bacterial evolution. Microb Rev 1987; 51: 221-71.         [ Links ]

2.- Jain R, Rivera M C. Lake M C. Horizontal gene transfer among genomes: the complexity hypotesis. Proc Nat Acad Sci 1999; 96: 3801-6.         [ Links ]

3.- Doolittle R. Microbial genomes opened up. Nature 1997; 392: 339-42.         [ Links ]

4.- Behrl et al. Comparative genomics of BCG vaccines by whole genome DNA microarray. Science 1999; 28: 1520-3.         [ Links ]

5.- Williams K. Genomes and proteomes. Electrophoresis 1999; 20: 678-88.         [ Links ]

6.- Rappuoli R. Reverse vaccinology. Curr Opinion Microbiol 2000; 3: 445-50.         [ Links ]

7.- Black T, Hare R. Will genomics revolutionize antimicrobial drug discovery? Curr Opinion Microbiol 2000; 3: 522-7.         [ Links ]

Correspondencia a:
Omar Orellana Orellana
E-mail: oorellan@machi.med.uchile.cl

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