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Revista chilena de infectología

versión impresa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. v.18 n.3 Santiago  2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182001000300006 

 

Caracterización molecular de cepas de Streptococcus
pyogenes aisladas de cuadros invasores basada
en el polimorfismo del regulón
vir*

MOLECULAR CHARACTERIZATION Streptococcus pyogenes FROM
INVASIVE INFECTIONS BASED ON VIR-REGULON POLYMORPHISM

M. TERESA ULLOA F.1, VIVIANA SILVA A.2, ELIZABETH PIÑONES A.2,
LORENA PORTE T.1, ALBERTO FICA C.3, M. EUGENIA PINTO C.1

Facultad de Medicina. Universidad de Chile:
1 Programa de Microbiología-Micología, I.C.B.M.
2 Estudiante de Tecnología Médica.
3 Unidad de Infectología, Departamento de Medicina, Hospital Clínico.

* Trabajo que obtuvo el premio XVIII Congreso Chileno de Infectología, Pucón 23-26 de Agosto de 2001.

Streptococcus pyogenes continues to be an epidemiological problem due to emergence of invasive infections such as necrotizing fasciitis (NF) and toxic shock syndrome (TSS). At present, S. pyogenes characterization is limited to species identification while molecular studies are restricted to a few specialized laboratories. The literature describes several methods of molecular typing (MLEE, PFGE and emm sequence) that are laborious and costly. Alternatively, a technique based on the vir-regulon polimorphism (emm, emm l, scpA, virR) provides a more simple approach and allows the differentiation of the M types based on virRFLP. The purpose of this study was the molecular characterization of S. pyogenes from invasive infections based on vir-regulon polymorphism. A total of 30 S. pyogenes isolates were tested (TSS/NF: 8; skin and tissue infections: 13; sterile site infections: 9) by Long PCR-virRFLP. The PCR product size varied from 4,2 to 7,8 Kb (28/30, 93%). Two strains amplified a small fragment of 1.5 - 1.6 Kb. Fourteen patterns were generated by DNA restriction endonuclease digestion with HaeIII and three genetic groups were established. Two genetic groups were similar to those described for the M protein types and related to the clinical outcome: group I/M1/sterile sites infection and group III/M3/TSS-NF. Group II presented M type heterogeneity and included skin and tissue infections. Genetic diversity in S. pyogenes is common. Nevertheless, isolates from invasive diseases tend to group according to M serotype and clinical outcome.

Key words: RFLP, S. pyogenes, vir-regulon.

INTRODUCCIÓN

A partir de la segunda mitad de la década del 80, en Europa, E.U.A. y Canadá, se observó un aumento de casos de infecciones severas por Streptococcus pyogenes. Este fenómeno tuvo como característica principal su manifestación en personas de edad media, saludables y sin antecedentes de factores predisponentes o inmunodeficiencias1,2. Paralelamente, en 1987 se describió el síndrome de shock tóxico asociado a este agente. En Chile desde 1987 un fenómeno similar fue comunicado por Berríos X y Laval E3,4 y analizado por varios autores nacionales5-9. Esto motivó la notificación obligatoria al Ministerio de Salud de las enfermedades invasoras a partir de 1994. Durante 1995 se notificaron 138 casos con tasas que oscilaron entre 0,16 (SS Metropolitano Norte) y 2,00 (SS Metropolitano Central) por 105 habitantes. La letalidad global resultó ser de 28,2%, registrándose los valores más altos en los cuadros de shock tóxico (60%). Entre 1997 y 1998 se observó una aparente disminución del número de infecciones invasoras por S. pyogenes, alcanzando un promedio de 2,6 casos al mes. Sin embargo, durante enero de 1999 se notificaron 22 casos de infección severa, con una tasa de letalidad de 41%10 y alcanzando una totalidad de 86 casos durante el año. Entre enero y abril del año 2000 se comunicaron 10 casos de infecciones invasoras por S. pyogenes11-13.

Streptococcus pyogenes ha sido estudiado, desde el punto de vista epidemiológico, fundamentalmente en base a la tipificación de sus proteínas M y T. Hasta el año 2000 se han identificado más de 100 serotipos predominando en las enfermedades invasoras, cepas M1T1 y M3T314,15.

Otro de los factores ampliamente estudiados son las exotoxinas pirogénicas. Al respecto es importante mencionar que la mayoría de las cepas invasoras producen exotoxina pirogénica A (SpeA), que tiene la particularidad de actuar como superantígeno16,17.

En nuestro país, el estudio de S. pyogenes se limita fundamentalmente a identificación de especie. No obstante, se han realizado esfuerzos por caracterizar las cepas locales. Berríos et al tipificaron 36 cepas de S. pyogenes aisladas de cuadros invasores, encontrando 38% de cepas M1T14. En cepas chilenas se ha observado una estrecha asociación entre la presencia del gen speA y cuadros invasores (60,6%) versus cepas aisladas de cuadros no invasores (18,5%)11,18 al igual que lo descrito en la literatura internacional16,17. Entre las técnicas moleculares utilizadas para tipificar S. pyogenes destacan las siguientes: electroforesis de campo pulsado (PFGE), electroforesis de multilocus enzimáticos (MLEE), ribotipificación y secuenciación del gen emm19-21. La mayor desventaja de estos métodos es que son complejos y poco accesibles en nuestro medio. Una alternativa de fácil acceso es la tipificación de S. pyogenes en base al polimorfismo del regulón vir22-24.

Este regulón está constituido por los genes de la proteína M (emm), C5a peptidasa (scpA), proteínas M-like (mrp/fcrA, enn) y el gen virR (mga). Podbielski describió en 1993 el polimorfismo de regulón vir en base a la heterogenicidad de los genes vir R y spcA, los serotipos de la proteína M y secuencias específicas no codificantes dentro del regulón22,25.

La técnica de tipificación se denomina Long PCR vir RFLP, la cual consiste básicamente en la amplificación del regulón vir, (4 a 7 Kb), seguida de la digestión con enzimas de restricción generando patrones de RFLP que son claros y fácilmente evaluables26,27. Además, trabajos realizados por Hookey en Inglaterra y Gardiner en Australia, han demostrado que los vir-RFLP se asocian a un determinado tipo de proteína M28,29. Por lo tanto, mediante el método de tipificación vir se podría inferir el serotipo M.

Esta estrategia es muy útil, tanto para estudios epidemiológicos como para la vigilancia en áreas geográficas donde la mayoría de las cepas son M no tipificables19.

El objetivo de este estudio fue tipificar cepas de S. pyogenes aisladas de cuadros invasores, basado en el polimorfismo del regulón vir, para establecer relaciones entre las cepas nacionales y compararlas con lo descrito en el extranjero.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se analizaron 30 cepas de S. pyogenes aisladas desde 1997 a 2001. Las cepas provenían de pacientes que presentaron cuadros invasores: infección sistémica documentada (cultivos positivos para S. pyogenes en líquidos estériles) o compromiso cutáneo profundo (tejido celular subcutáneo), atendidos en diversos centros asistenciales del país (RM 77%; otros servicios 23%). La procedencia de las cepas fue: síndrome de shock tóxico/fasceítis necrozante (SST/FN): 8; infecciones de piel y tejidos blandos: 13; infecciones de cavidades estériles: 9. Las cepas fueron mantenidas en caldo brain heart infusion (BHI) glicerol al 20%, a -70°C, en duplicado, hasta el momento de su estudio.

Caracterización molecular de S. pyogenes. Las cepas fueron tipificadas mediante Long PCR vir RFLP, según el método simplificado por Hartas et al27. En resumen: una asada de S. pyogenes cultivado en agar sangre de cordero 5%, suspendida en 100 µl de Na OH 50 mM se incubó a 95°C por 1 minuto, se enfrió a 4° C y luego se le agregó 16 µl de Tris - HCl 1M, pH 8,0. Después de centrifugar por 2 minutos a 13.000 rpm a 4° C, el sobrenadante fue usado como templado para la reacción de amplificación. Para la amplificación de vir se utilizaron los partidores VUF y SBR que acotan una zona comprendida entre 342 pares de bases "río arriba" del gen virR hasta 53 pares de bases dentro del gen scpA26, generando un fragmento que fluctúa entre 4 a 7 Kb, lo que corresponde aproximadamente al 0,3% del genoma30 (Figura 1). La mezcla para RPC fue de: 3 µl de ADN templado, 0,5 µl de cada partidor, 1,5 µl de dNTP10 mM. (PCR Core System II Promega®) y 1 U de Platinum Pfx ADN polimerasa en buffer 10X Pfx Gibco BRL®. Se utilizó un termociclador Gene Amp PCR System 2.400 de Perkin Elmer®; las condiciones de amplificación fueron: 95° C x 1' y 30 ciclos de 15'' a 95° C, 2' a 58° C y 6' a 68° C. Extensión final a 68° C por 6 minutos y luego 4° C. Un volumen de 18 µg del producto de reacción del RPC fue corrido por electroforesis (ELF) en gel de agarosa al 0,8% para verificar la amplificación. Posteriormente 7 µl del amplicón fueron digeridos con 2 U de Hae III Gibco BRL® durante 2 horas a 37° C. Los productos de la digestión fueron separados mediante ELF en agarosa al 1,5% a 15 volts durante 20 horas. Se usó como estándar de peso molecular fago lambda cortado con Hind III Promega®. Los fragmentos teñidos con bromuro de etidio se visualizaron en un transiluminador Vilber Lourmat® y fotografiados con Polaroid 667.

Análisis de los resultados. Los tamaños de los amplicones y los fragmentos de restricción se calcularon utilizando el programa computacional Quantity One 1-D Analysis Software (BioRad Laboratories) versión 4.2.2 año 2000. El análisis de cluster de las cepas se realizó mediante el programa computacional RAPDistance Package versión 1.04 año 1994.

Análisis estadístico. Los resultados de significancia estadística se realizaron utilizando el paquete computacional Statistica (Statsoft, Inc).

Figura 1. Regulón vir de Streptococcus pyogenes.

 

RESULTADOS


Las características de las cepas analizadas, según procedencia, tipo de muestra y diagnóstico clínico se presentan en la Tabla 1.

La técnica de Long PCR simplificada por Hartas et al en 1998, resultó ser en general, una técnica con adecuada reproducibilidad; al respecto se observó un amplicón similar en tamaño al repetir una misma muestra durante 6 días consecutivos por 2 operadores diferentes. La especificidad del fragmento amplificado resultó ser óptima, no observándose bandas extras a las del amplicón esperado (4 - 7 Kb).

En relación al rendimiento de la técnica, amplificaron 30 de 34 cepas obteniéndose así, 88,2% de rendimiento por este método. Como producto de la amplificación se evidenció un fragmento que fluctuó entre 4,2 - 7,8 Kb en 28 de 30 (93,3%). Sin embargo en 2 cepas se obtuvo un amplicón "pequeño" de 1,5 - 1,6 Kb (Tabla 2, Figura 2A).

Producto de la digestión del amplicón vir, 14 de 30 cepas (46,7%) presentaron un patrón de 5 fragmentos y 7 de 30 (23,3%) cepas mostraron 2 fragmentos, 3 de 30 (10,0%) cepas con 3 fragmentos. El resto de las cepas (6 de 30) presentó 4 y 6 fragmentos de restricción. (Tabla 3, Figura 2B).

 

Tabla 1. Características de 30 cepas de Streptococcus pyogenes aisladas de cuadros invasores


Procedencia

Tipo de muestra

Diagnóstico

Fecha


H. Fusat-Rancagua

Piel y TB*

SST***†

1999

E.U.A. H. Clínico U. Católica

LCR

Meningitis

90

Idem

Sangre

Sepsis

87

Idem

"

Sepsis

90

H. Las Higueras-Talcahuano

"

FN-SST†

99

Idem

LCR/sangre

Meningitis-sepsis

99

Idem

Pus aponeurosis

Osteomelitis

99

Idem

L. pleural

Pleuroneumonía

99

Idem

"

Pleuroneumonía

99

H. Roberto Del Río

Sangre

Sepsis

99

Idem

Piel y TB

Herida-sepsis

99

H. Parroquial San Bernardo

"

Artritis séptica

2001

Idem

"

Celulitis

1999

Idem

"

FN**

2001

H. Clínico U. de Chile

Sangre

SST, Bacteremia†

1999

Idem

"

Absceso-sepsis

99

Idem

Piel y TB

Absceso de mano

99

Idem

"

Absceso-sepsis

99

Idem

"

FN-sepsis†

2000

Idem

"

FN-SST-miositis†

1999

H. Naval Viña del Mar

"

Absceso-SST†

99

H. San Borja Arriarán

Sangre

Sepsis

97

Idem

Piel y TB

Celulitis

97

Idem

"

Celulitis

97

Idem

"

Celulitis

97

Idem

"

Gastrostomía

97

H. San José

Sangre

Sepsis

2000

H. San Juan de Dios

"

Sepsis

2001

H. Sótero Del Río

Tejido peritoneal

FN

1999

Idem

Sangre

Sepsis

99

       

† paciente fallece; * TB: tejidos blandos; ** FN: fasceitis necrozante; ***SST: síndrome shock tóxico.


Figura 2. (A) Amplicones vir de Streptococcus pyogenes, aislados de cuadros invasores y (B) sus virRFLP correspondientes.

Mediante análisis de cluster, se observó que las cepas presentaron 14 patrones vir RFLP y se agruparon en tres grandes clusters. Para efectos de este estudio los grupos de asociación génica se denominaron: GI, GII y GIII. (Figura 3). El primer cluster GI, concentró 10 de 30 (33,3%) cepas estudiadas, 9 de 10 (90%) provenían de muestras aisladas de cavidades estériles (sangre, LCR, líquido pleural y cavidad medular). Al incluir en el análisis de cluster (datos no mostrados) las cepas tipificadas en el extranjero, se observó asociación con las cepas incluídas en GI y la descrita por Gardiner como cepa tipo M1. Además, 3 de nuestras cepas que se agruparon en este cluster, habían sido serotipificadas en E.U.A., correspondiendo al serotipo M1. Estas cepas fueron facilitadas gentilmente por X. Berríos de la Pontificia Universidad Católica de Chile.

Un segundo grupo (GIII) lo constituyeron 7 de 30 (23,3%) cepas estudiadas, 5 de 7 (71%) de ellas fueron aisladas de pacientes que presentaron FN y/o SST. Es importante destacar que 4 (57%) de estos pacientes fallecieron a las 72 horas de iniciado el cuadro. El patrón de las cepas de este grupo presentó estrecha relación con lo descrito por Gardiner para las cepas tipo M3.

Un tercer grupo (GII) fue heterogéneo en relación a los serotipos M y concentró 13 de 30 (43,3%) cepas, 10 de 13 (76,9%) fueron aisladas de pacientes con infección de piel y tejidos blandos (celulitis, absceso o herida profunda).

Tabla 2. Tamaño del amplicón Vir en 30 cepas de Streptococcus pyogenes aisladas de cuadros invasores


Tamaño amplicón (Kb)

Cepas invasoras n = 30

 
 

%


7,8 - 6,9

10

33,3

6,8 - 6,6

5

16,7

6,5 - 6,0

6

20,0

4,8 - 4,2

7

23,3

1,6 - 1,5

2

6,7


 

Tabla 3. Fragmentos obtenidos de la digestión de vir con Hae III en 30 cepas de Streptococcus pyogenes aisladas de cuadros invasores


Fragmentos de Restricción

Cepas Invasivas

n = 30

 

(%)


6

3

10,0

5

14

46,7

4

3

10,0

3

3

10,0

2 7 23,3

 

Figura 3. Análisis de cluster de 30 vir RLFP de Streptococcus pyogenes aislados de cuadros invasores (UPGM-TREE).

DISCUSIÓN

Streptococcus pyogenes sigue siendo uno de los agentes etiológicos más importantes en nuestro país, tanto por la alta morbilidad de los cuadros no invasores como por el incremento en el número de casos severos en los últimos años, asociados a una alta letalidad (40%). El método más comúnmente aplicado en la caracterización de cepas de S. pyogenes corresponde a la tipificación serológica de las proteínas M y T. Sin embargo, los antisueros M no están disponibles comercialmente en forma amplia y su preparación es compleja y costosa. Por lo tanto la tipificación M está restringida a unos pocos laboratorios especializados19,27.

Actualmente el gold standard de la tipificación molecular se basa en la secuenciación del gen emm, la cual ha sido desarrollada por el Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC, E.U.A.)11. En general, en países subdesarrollados o en vías de desarrollo esta tecnología no es de fácil acceso.

Al analizar las técnicas descritas para caracterizar molecularmente S. pyogenes19,28, la tipificación mediante Long PCR vir RFLP resulta atractiva, tanto por su facilidad de ejecución, como por su rapidez.

El método de tipificación en base al polimor-fismo del regulón vir simplificado por Hartas et al en 1998, ofrece ventajas comparativas respecto al método clásico descrito por Gardiner et al en 1995, tales como el uso limitado de reactivos, tecnología más accesible y la disminución del tiempo de preparación del ADN. Por lo tanto resulta una técnica sencilla, rápida y de menor costo, con obtención de resultados durante el día27.

Dos limitaciones de la RPC son la fidelidad del producto y el tamaño del fragmento de ADN que puede ser amplificado. Esta situación ha sido resuelta por la introducción al mercado de polimerasas de alta fidelidad, como por ejemplo Pfu y Pfx ADN polimerasas32-34.

En nuestro estudio, la técnica de Long PCR-RFLP resultó reproducible y específica, en cuanto a la obtención del amplicón esperado y nos permitió caracterizar a la mayoría de las cepas estudiadas.

Casi la totalidad de las cepas (94,7%) presentaron amplicones en el rango esperado (4,2 y 7,8 Kb). Sin embargo, en 2 cepas se evidenció un producto de amplificación de menor tamaño (1,5 - 1,6 Kb), lo cual constituye un hallazgo interesante. En la literatura este tipo de amplicón ha sido demostrado previamente, sólo en Streptococcus ß hemolítico grupos G y C35. En consecuencia la interpretación de este hecho requiere mayor investigación.

El número de fragmentos obtenidos al digerir el amplicón vir con Hae III fluctuó entre 2 y 6, concordando con los resultados publicados en el extranjero27,29.

La presencia de una banda de 1,23 Kb en todas las cepas, podría corresponder a una zona conservada del regulón vir de S. pyogenes. Este fragmento ha sido descrito por varios autores26-28. Al respecto, Podbielsky describió en 1992 que los primeros 1.350-1.450 pb del gen virR corresponden a una zona conservada en el regulón vir, presente en todos los serotipos M estudiados por él25. Considerando estos antecedentes, la banda de 1,23 Kb observada en nuestras cepas, podría corresponder a esta zona del genoma de S. pyogenes. Sin embargo, son necesarios otros estudios moleculares para dilucidar su naturaleza.

El análisis de cluster demostró que las cepas de S. pyogenes aisladas de cuadros severos presentan gran diversidad génica. Sin embargo, algunas tienden a agruparse según serotipo y a asociarse a una determinada evolución clínica.

Al respecto destaca la fuerte asociación entre virRFLP, tipo serotipo M3 y FN y/o SST. De los 8 pacientes con estos diagnósticos, 5 se concentraron en este grupo y 4 de ellos fallecieron a las 72 horas de iniciado el cuadro.

Esta asociación requiere mayor investigación respecto a sus proyecciones clínicas. El estudio de un mayor número de cepas, una mayor representatividad geográfica, y la tipificación de nuestras cepas en base a la proteína M, podrían en el futuro permitirnos obtener información más concluyente respecto al pronóstico vital de un paciente con una cepa virRFLP tipo serotipo M3.

Otra aplicación de la técnica utilizada la constituyen los estudios de vigilancia epidemiológica tanto en situaciones de brotes como de endemia. Por lo tanto, surge como una herramienta adicional importante en el estudio de este patógeno, cuyo actual comportamiento varía desde una presentación clínica no complicada como la faringitis, hasta un SST.

RESUMEN

A pesar del aumento de infecciones invasoras por Streptococcus pyogenes: fasceitis necrozante (FN) y síndrome de shock tóxico (SST) en nuestro medio, su caracterización generalmente se limita a identificación de especie y prácticamente no existen estudios moleculares. La literatura describe diversos métodos para tipificar S. pyogenes (MLEE, PFGE y secuen-ciación de emm) que resultan complejos. Una alternativa es la técnica basada en el polimorfismo del regulón vir (emm, emm l, scp A, vir R) que es más sencilla y permite correlacionar los virRLFP con los serotipos M. Objetivo: caracterizar S. pyogenes aislados de cuadros invasores mediante vir-RFLP para establecer relaciones entre cepas locales y extranjeras. Materiales y métodos: se estudiaron 30 cepas de S. pyogenes aisladas de pacientes con cuadros invasores (SST/FN: 8; infecciones de piel y tejidos blandos: 13; infecciones de cavidades estériles: 9) mediante Long PCR-RFLP (amplificación regulón vir con partidores VUF y SBR, seguido de digestión con HaeIII).

Resultados: 28/30 (93%) cepas presentaron regulones entre 4,2 - 7,8 Kb y dos entre 1,5 - 1,6 Kb. Se establecieron 14 patrones vir-RFLP y 3 grupos génicos. Dos grupos génicos presentaron patrones similares a los descritos para los serotipos M y se asociaron a una determinada evolución clínica: grupo I, similar a M1 y asociado a infecciones de cavidades estériles; grupo III, similar a M3 y asociado a SST/FN. El grupo II fue heterogéneo en relación a los serotipos, pero concentró las cepas aisladas de infecciones de piel y tejidos blandos. Conclusiones: Las cepas de S. pyogenes aisladas de cuadros severos presentan gran diversidad génica. Sin embargo, tienden a agruparse según serotipo y a asociarse a una determinada evolución clínica destacándose la asociación entre vir-RFLP, tipo serotipo M3 y SST/FN. Las dos cepas con amplicones "pequeños" constituyen un hallazgo interesante, que requiere mayor investigación.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a los profesionales del Laboratorio de Microbiología de los siguientes hospitales: San Juan de Dios, San Borja Arriarán, Clínico U. de Chile, Higueras-Talcahuano, San José, Clínico U. Católica, Roberto Del Río, Parroquial San Bernardo, Sótero Del Río, Naval Viña del Mar y FUSAT por su valiosa cooperación en este estudio. Del mismo modo, agradecemos al Germán Hermosilla por su ayuda en el análisis computacional de los resultados.


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Correspondencia a:
M. Teresa Ulloa F.
E-mail: mtulloa@machi.med.uchile.cl

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