JESUS MUÑOZ, C R MUÑOZ , T E DEL LLANO, L P RAMOS DE, C G FLORES , F E ALVARADO y G M A MORENO

* Centro de Biología Experimental. Universidad Autónoma de Zacatecas. Apartado postal 12. Guadalupe Zac. CP. 98600.

IMMUNE COMPLEXES IN TRICHINELLOSIS PROTECTION

The animals were immunized with immune complexes formed in vitro in agar gels. The immunoprecipitates obtained from the reaction between soluble antigens from Trichinella spiralis and serum from infected animals, were eluted and used for immunization of animals. Mice were bleed weekly, they after seven weeks were challanged with infective larvae from T. spiralis. Antibody production against T. spiralis was detected by Western blot and the protection induced by immunization was evaluated by histology, counting the number and the integrity of muscular larvae. After five week's immunization anti-trichinella antibodies were detected by dot-ELISA and Western blot. Antigenic bands with different molecular weights were recognized by sera from most animals; being the prominent band at 45 kDa. Mice with antibodies against 45 kDa protein and challanged with T. spiralis had less number of muscular larvae than the non-immunized controls. In addition, immunized animals exhibited a strong reaction against Trichinella and muscular larvae were almost destroyed.
Key words: Trichinella spiralis, Immunity, Immunoprotection, Trichinellosis.

INTRODUCCION

Los estudios sobre protección contra la trichinellosis son pocos y solo a nivel experimental, principalmente en modelo murino. Se sabe que los animales que han sufrido de una infección primaria con Trichinella spiralis frente a una reinfección presentan una fuerte respuesta inmune a nivel intestinal eliminando los adultos y preadultos.^1-3

Las células capaces de transferir inmunidad en una infección primaria son los linfocitos T, los cuales aparecen tempranamente en los ganglios linfáticos mesentéricos, pero desaparecen una vez que los parásitos intestinales son expulsados. Así mismo aunque los linfocitos T son los que principalmente se encuentran involucrados en la protección, fracciones enriquecidas con linfocitos B son capaces de transferir inmunidad, reflejándose ésta en una disminución en la fecundidad de la hembra.^4-6

Estudios posteriores se han encaminado a la purificación de antígenos de secreción-excreción y de superficie de los diferentes estadíos del ciclo de vida del parásito, los antígenos que principalmente se han empleado son los de Larva infectante (LI), ya que son relativamente fácil de obtener de músculos infectados con T. spiralis, y por otro lado es el estadío más inmunogénico.⁷

Se ha observado que los antígenos de secreción-excreción de 48 y 50/55 kDa purificados, obtenidos de LI son los predominantes en los ensayos de protección, pero el efecto aparentemente se produce sobre los adultos disminuyendo la fecundidad de las hembras. Aparentemente la respuesta inmune se ejerce sobre los adultos; sin embargo estos antígenos se expresan únicamente en larvas en desarrollo.⁸ Así mismo otros autores han purificado antígenos de superficie y han mostrado conferir protección en ratones. Pero esta protección solo es parcial tanto usando antígenos de secreción-excreción y de superficie purificados.^{9, 10}

Este trabajo tiene como objetivo evaluar si los complejos inmunes despiertan un efecto protector anti-triquina en un modelo experimental murino.

MATERIAL Y METODOS

Obtención de complejos inmunes del gel de microinmunodifusión (MID)¹¹ formados por interacción de antígeno-anticuerpo de triquina, se probaron 20 sueros positivos los cuales tenían el rango de 1 a 4 bandas se seleccionaron los 4 tipos de bandas prototipos y se reprodujeron, fueron eluídas con buffer de barbital pH 8.3 agregando EDTA como inhibidor de proteasas centrifugando a 12.000 revoluciones por minuto (RPM) a 4°C por 30 minutos, al producto se le realizó Electroforesis de geles de poliacrilamida (PAGE) en condiciones reductoras de acuerdo a la metodología descrita por Laemmli¹² y determinación de proteínas por el método de Bradford G-250 a 610 nanómetros (nm).¹³

Animales experimentales. El trabajo se llevó a cabo en modelo experimental murino se utilizaron 60 ratones de 3 meses de edad Balb/c los cuales fueron inmunizados con las bandas eluídas del complejo inmune triquina-antitriquina, (40 ratones) 10 con cada uno de los 4 prototipos de bandas, 10 con el complejo de bandas y 10 controles únicamente con el gel eluido.

Esquema de inmunización. Se aplicaron 10 mg de proteína cada 7 días por 4 ocasiones en diferentes sitios anatómicos, en el caso del grupo de animales control se aplicó similar volumen que a los animales de estudio, se sangraron vía ocular pre-inmunización y a la tercera y cuarta semana post-inmunización.

Desafio. A la cuarta semana los 60 ratones fueron inoculados con 100 LI por vía oral, sangrados y sacrificados a la cuarta semana post-inoculación.

Obtención del Antígeno Soluble de Trichinella (AST) de carne infectada con LI de T. spiralis de acuerdo al método descrito por Del Río y col¹⁴ al AST se le realizó PAGE por la técnica de Laemmli¹² y la detección de anticuerpos se determinó WB por autorradiografía. El AST separado por PAGE fue transferido a papel de nitrocelulosa (NC) de acuerdo al método descrito por Towbin¹⁵ y el radiomarcaje se realizó por la técnica de cloramina T¹⁶

Dot-Blot. Se cortó el papel de NC y se aplicó el antígeno de T. spiralis con jeringa de Hamilton 25 microlitros a una concentración protéica de 0.0682 mg/ml, se incubó por 18 horas a temperatura ambiente, se bloqueó con leche descremada (Carnation) durante 45 minutos a 37°C, el suero problema, fue diluido progresivamente hasta 1:1020 y se incubó por 45 minutos a 37°C, se lavaron por 3 ocasiones con solución de lavado (8,5 gr de NaCl, 5 ml de Tween 20 y se aforó a 1 litro de agua destilada), con agitación por 10 minutos, seguida de incubación durante 45 minutos, con anti-gammaglobulina de ratón IgG marcada con peroxidasa (Diluida 1:500) luego se lavaron por 10 minutos con solución de lavado por 3 veces, se revelaron con 3,3 diamino benzidina, se lavaron con agua y se procedió a la interpretación de la coloración.¹⁷

El tejido muscular (diafragma, maseteros, lengua y pierna) obtenido de los animales de experimentación y control, se analizó a través de microscopía óptica normal con objetivo de 10, 20 y 40X de aumento: Se observaron 10 campos y se sacó el promedio. Se realizó estudio estadístico por el método ANOVA.

RESULTADOS

PAGE de las bandas eluídas. Se encontró que los pesos moleculares oscilaron de 28 a 112 kDa pero en las 4 un triplete de 44, 40 y 34 kDa así como la presencia de una banda de 80 y 86 kDa, la concentración protéica fue de 1,2 a 1,6 mg/ml.

El suero de los animales inmunizados (con complejos inmunes eluídos del soporte de gel de agarosa triquina-antitriquina (Figura 1) y control) produjeron anticuerpos a partir de la cuarta semana post-inoculación y por Dot-Elisa se encontró que 5 grupos de estudio exhibieron títulos de 1:1020, en tanto que el control fue negativo.

Por WB autorradiografía, en los 5 grupos experimentales se encontró un promedio de 3 bandas con el predominio de una de 45 kDa (Figura 2), el control no presentó bandas.

En los animales inmunizados y control retados con T. spiralis, en el suero de la cuarta semana post-inoculación, por WB se encontró un promedio de 7 bandas.

A la observación del microscopio óptico. Se encontró que en los animales inmunizados el número de LI osciló entre 1-8 con promedio de 4 por campo y en 20 animales solo se observó el espacio pero no se encontró la LI (Figura 3), en el grupo control se encontró un promedio de 20 LI por campo (Figura 4).

Se realizó estudio estadístico por el método de ANOVA y se obtuvo una P < 0,0001, lo cual es altamente significativo.

Figura 1. MID. Se muestran los 4 sistemas antígeno-anticuerpo (A,B,C,D) entre el AST (1) y los Acs. Anti-trichinella (2).

Figura 2. WB, auto-radiografía de animales inmunizados con el complejo inmune Ag-Ac de T. spiralis en el cual se observa un triplete con el predominio de una banda de 45 kDa.

Figura 3. Observación al microscopio óptico. A) Tejido de diafragma de animal inmunizado con el complejo inmune triquina-antitriquina y retado con LI de T. spiralis. Se observan espacios vacíos en los cuales no se pudo llevar a cabo el implante de LI de T. spiralis. B) Observación al miscroscopio 40x de uno de los espacios vacíos en el cual se detecta proliferación de población celular pero no LI de T. spiralis.

Figura 4. Tejido de diafragma del grupo control en el cual se observan un promedio de 20 LI de T. spiralis por campo. Microscopio 10x.

DISCUSION

Nuestros resultados demuestran que los complejos inmunes eluidos contienen un triplete de 34, 40 y 44 kDa que probablemente corresponden a los antígenos inmunodominantes de T. spiralis y 2 bandas una de 80 y otra de 86 kDa. En los estudios de Dot-Elisa se encontró en el grupo de estudio títulos de 1:1020 y el control fue negativo, en WB se observa la banda de 45 kDa en forma predominante lo cual nos habla del papel de ésta, al retarlos en los inmunizados un menor número de LI y en el control mayor el número de LI.

Los estudios encaminados a la protección en contra de T. spiralis son pocos y solo en modelos experimentales, se sabe que los animales que han sufrido de una infección primaria de T. spiralis se desencadena una respuesta inmune protectora en contra de una reinfección con LI.

Despommier al utilizar antígenos de los gránulos secretorios como inmunógenos, obtuvo altos niveles de protección¹⁸

Ortega y col., empleando antígenos de superficie de la LI purificados mediante columna de afinidad y empleando un anticuerpo monoclonal en un modelo experimental murino, observaron que a la inmunización de los ratones BALB/c con los antígenos previo a la infección con LI de T. spiralis indujeron una reducción significativa en la carga de LI, así como el número de adultos en el intestino.¹⁹

Se ha demostrado que para T. spiralis moléculas de la superficie y algunos componentes de secreción-excreción de la LI son inmunodominantes reconocidos en todos los huéspedes hasta ahora analizados.

Aparentemente los efectos de la respuesta inmunológica se ejercen sobre los adultos; sin embargo, estos antígenos (48 y 50/55 kDa) se expresan únicamente en las larvas en desarrollo, esto sugiere que los mecanismos inmunes actúan sobre las larvas intestinales, de tal manera que éstas se convierten en adultos defectuosos.^20-22

En nuestro estudio, si hubo un efecto protector y la molécula inmunodominante fue la de 45 kDa, por lo cual es importante implementar técnicas de biología molecular para discernir los mecanismos de inmunidad del hospedero para la obtención de un inmunógeno potente que pueda emplearse en cerdos y de esta manera ayudar a controlar la trichinellosis humana.

CONCLUSIONES

1.- El complejo inmune fue capaz de desencadenar una respuesta inmune mediada por anticuerpos.

2.- La respuesta que desencadena el complejo inmune es semejante a la inducida por el parásito.

3.- El complejo inmune formado probablemente por antígenos de secreción/excreción y de pared confieren un efecto protector total en 40% de nuestra población de estudio y en el 60% restante disminución importante del número de LI en un promedio de 4 en contraste de las 20 LI del grupo control a la observación al microscopio.

4.- Por el método de ANOVA se obtuvo una P < 0,0001, lo cual es altamente significativo.

RESUMEN

El presente trabajo se llevó a cabo en modelo experimental murino se utilizaron 60 ratones Balb/c de 3 meses de edad, los cuales fueron inmunizados con bandas de precipitación obtenidas de complejos inmunes formados por la interacción de antígeno-anticuerpo de triquina, las cuales fueron eluidas con Buffer de barbital pH 8.6, el esquema de inmunización fue aplicar 10mg de proteína cada 7 días por 4 ocasiones vía subcutánea, a la cuarta semana fueron retados con aproximadamente 100 larvas infectantes (LI) de T. spiralis por vía oral y se sacrificaron a la cuarta semana post-infección, se obtuvo suero pre-inmunización, de la cuarta semana post-inmunización y de la cuarta semana post-inoculación con LI de T. spiralis, para determinar la presencia de anticuerpos se realizó Dot-Elisa y Western Blot (WB). El tejido muscular obtenido del sacrificio de los animales experimentales y control se analizó por microscopio óptico.

Por Dot-Elisa a la cuarta semana de post-inmunización de los 60 ratones, 50 resultaron positivos hasta títulos de 1:1020, y el grupo control de 10 ratones fue negativo. Por WB a la cuarta semana post-inmunización todos los animales inmunizados presentaron una banda de 45 kDa y el grupo control fue negativo, en los sueros post-inoculación de la semana de sacrificio todos los animales presentaron bandas en un promedio de 7 y predominio en la de 45 kDa, la carne de los inmunizados tuvo menor número de LI que el grupo control.

En conclusión la inmunización con complejos inmunes de T. spiralis despertó una respuesta inmune humoral y probablemente un efecto protector al impedir el implante de las Larvas Infectantes (LI) de T. spiralis.

REFERENCIAS

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