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Revista chilena de pediatría

versión impresa ISSN 0370-4106

Rev. chil. pediatr. v.79 n.4 Santiago ago. 2008

http://dx.doi.org/10.4067/S0370-41062008000400004 

 

Rev Chil Pediatr 2008; 79(4): 373-380

ARTICULO ORIGINAL/RESEARCH REPORT

 

Efectos de exposición aguda a cadmio en la acción de estrógenos en útero de rata impúber

Effects of acute exposure to cadmiun on response to estrogen in the prepuberal rat uterus

 

ANDREI N. TCHERNITCHIN1, FRANCISCA OLIVARES1,3*, CARLOS ARANDA1, RODRIGO A. BUSTAMANTE1, LEONARDO GAETE1,4*, KARLA FERRADA1,5*, REBECA VILLAGRA1,5*, JEANETTE VERA1,6*, RICARDO J. ITURBE 1,7*, YOON A. KIM1,7*, NATALIA B. HERNÁNDEZ1,7*, TINA BIZJAK2*, SPELA NOVSAK3*

1.   ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile.
2.   Estudiante de Intercambio, Universidad de Graz, Austria.
3.   Estudiante Tesista, Tesis de Titulación de Ingeniero Ambiental.
4.   Licenciado en Biología, Magíster en Bioquímica y Biología Molecular.
5.   Tecnólogo Médico.
6.   Tesista de Magister en Salud Pública en curso.
7.   Estudiante de Pregrado (Medicina, Universidad de Chile).

Dirección para correspondencia


ABSTRACT

Background: Few information is available about uterine effects of Cadmium (Cd) exposure, where toxic agents affecting the female genital tract interact with estrogen (E) receptors, modifiying myometrial activity and the menstrual cycle, causing dysmenorrhea, infertility and spontaneous abortion. No information exists whether prenatal or early postnatal exposure may cause any gynecologic persistent adverse effect. Our finding of a second mechanism of E interaction and differences between E receptors in the various uterine cell types suggests that Cd may affect differently E interaction in each cell-type. Objective: Evalúate a possible selective effect of acute Cd exposure on E action in the uterus during prepuber age. Method: Female prepuber rats exposed to Cd 4 mg/kg and 2 hours later, treated with Estradiol-172 0,3 mg/kg. A myometrial sample was obtained under anesthesia 24 hours after E treatment and histologically processed for the quantification of E responses on different uterine cell-types. Results: Cd exposure potentiates E-induced uterine eosinophilia and endometrial edema and inhibits E-induced cell hypertrophy in circular myometrium and cell proliferation in luminal myometrium. Cd, in the absence of hormone stimulation, causes a slight cell hypertrophy in circular myometrium. Conclusions: Acute exposure to Cd affects differently various responses to E in the different uterine cell-types. Future studies should verify whether this effect explains Cd-induced infertility, postpubertal sex organ development and whether prenatal or early postnatal exposure to Cd induces delayed persistent effects.

(Key words: Cadmium, toxicity, uterus, estrogen, estrogen responses, immature rat).

RESUMEN

Antecedentes: Existe poca información sobre efectos del cadmio (Cd) en el útero. En mujeres altera la actividad miometrial, el ciclo menstrual y causa dismenorrea, abortos espontáneos, infertilidad y mortinatos. No existe información si la exposición prenatal o postnatal temprana causa efectos ginecológicos diferidos persistentes. Los tóxicos que afectan el útero suelen interactuar con receptores de estrógeno (E). Nuestro hallazgo de un segundo mecanismo de acción de E y de diferencias entre receptores de E de los diversos tipos celulares uterinos hacen posible que el Cd interactúe con los E en forma diferente en cada tipo celular. Objetivos: Buscar un posible efecto selectivo de la exposición aguda a Cd con algunas respuestas a E en útero de rata durante la edad prepuberal. Métodos: Ratas hembra impúberes recibieron 4 mg Cd/kg p.c. y 2 h después se trataron con 0,3 mg estradiol-17(3/kg p.c; los úteros fueron obtenidos bajo anestesia a las 24 h del tratamiento con E. Los úteros se procesaron para la cuantificación de respuestas a E en cada tipo celular por separado. Resultados: La exposición a Cd incrementa la eosinofilia uterina y edema endometrial inducidos por E; inhibe las siguientes respuestas a E: hipertrofia celular en miometrio circular, proliferación celular en epitelio luminal y miometrio. En ausencia de hormona, el cadmio causa una leve hipertrofia celular en miometrio circular. Conclusiones: La exposición aguda a Cd afecta de manera diferente las respuestas a E en los diversos tipos celulares uterinos de rata prepuberal. Futuros estudios deberán verificar si este efecto explica la infertilidad causada por exposición a Cd, afecta el desarrollo postpuberal de los órganos sexuales, e investigar si la exposición prenatal o postnatal temprana induce efectos diferidos persistentes, como puede ocurrir en población infantil prenatalmente expuesta a Cd.

(Palabras clave: toxicidad, cadmio, útero, estrógeno, respuestas estrogénicas, rata impúber).


Introducción

El cadmio (Cd) es un metal pesado que presenta toxicidad sobre el ser humano. Sus principales orígenes son antropogénicos. Niveles altos de Cd se asocian a graves efectos sobre la salud, en tanto la exposición a niveles menores se asocia a cáncer pulmonar y prostético1,2, insuficiencia renal y enfermedades cardiovasculares3, alteraciones del metabolismo de la vitamina C y trastornos gastrointestinales agudos. Varios estudios atribuyen al Cd alteraciones genéticas, entre ellas aberraciones cromosómicas e hipoploidía.

En hamsters hembra, el Cd inhibe la ovulación y produce esterilidad4; en ratas causa cambios patológicos en útero5, ovarios6 y placenta7. En la mujer, afecta la actividad miometrial en ausencia de embarazo8, altera el ciclo menstrual, causa dismenorrea, esterilidad, abortos espontáneos, mortinatos9, daño placentario10 y aumenta el nivel de testosterona en suero11.

Se ha sugerido que el Cd activa receptores citosólico-nucleares de estrógeno (E)12 (ver comentario editorial de S. Safe13), y que en ausencia de hormona este metal pesado reproduce los efectos de E tanto en útero como en glándula mamaria14. En células tumorales mamarias MCF7 el Cd activaría receptores de E alfa y beta15. Se ha sugerido que el Cd interactúa con grupos tiol (SH) del sitio activo o de unión del receptor de E a la hormona16. Este hecho es importante porque no todos los receptores de E presentan grupos SH en su sitio activo; a diferencia de los citosólico-nucleares que son afectados por los bloqueadores de grupos SH17, los receptores de E de los eosinófilos no lo son18,19. En consecuencia, es posible esperar una disociación entre las diversas respuestas a E bajo el efecto de exposición aguda a Cd.

Si todos los receptores de E fueran idénticos entre sí y existiera un único mecanismo de acción hormonal, tal como se consideró inicialmente17, sería suficiente investigar sólo una respuesta estrogénica para verificar si el Cd afecta o no la acción de los E.

El hallazgo20,21 y posteriores estudios19,22, en nuestro laboratorio, de receptores de E en la superficie de los leucocitos eosinófilos, nos ha permitido la descripción22-25 del primero de los mecanismos no genómicos de acción de hormonas esteroidales, involucrado en diversas respuestas estrogénicas denominadas no-genómicas. Los receptores clásicos "citosólico-nucleares" descritos por Jensen17, por el contrario, están involucrados en las "respuestas genómicas" a los E (hipertrofia de los diversos tipos celulares uterinos, síntesis de proteínas específicas, respuesta proliferativa para diversos tipos celulares, etc) mediante el mecanismo de activación (desrepresión) genómica. Hoy día también se conocen varias diferencias entre los receptores citosólico-nucleares de E de los diversos tipos celulares de órganos blanco19,26-28. Estos antecedentes sugieren la posibilidad de una disociación toxicológica de respuestas a E, lo cual justifica la necesidad de investigar posibles efectos selectivos de la exposición a Cd en algunas respuestas hormonales en órganos blanco.

El presente trabajo representa la primera etapa del estudio y describe efectos precoces de exposición aguda a cadmio; en etapas posteriores se investigarán los efectos diferidos de la exposición perinatal a dicho tóxico por la posibilidad que causen efectos diferidos persistentes por el mecanismo del imprinting29.

Material y Métodos

Ratas hembra Sprague Dawley prepúberes (21 días de edad) fueron expuestas a Cd (una dosis de 4 mg/kg p.c, vía subcutánea en el dorso del animal) o a vehículo. La dosis elegida se basó en los estudios de Baranski y Sitarek30. Dos horas después de la exposición, las ratas se trataron con estradiol-17(3 (300 ug/kg peso corporal) o vehículo, y a las 24 horas del tratamiento, se extrajeron los úteros bajo anestesia, se los fijó en formalina neutra al 4% para posterior proceso histológico23,31. Luego los animales fueron eutanasiados por sobredosis de anestésico. Se utilizaron 10 animales por condición experimental, total 40 animales.

Se evaluaron respuestas estrogénicas no genómicas (eosinofilia y edema uterinos) y genómicas (hipertrofia miometrial y proliferación celular en epitelio luminal uterino y mio-metrio). La eosinofilia uterina fue evaluada por recuento en 30 cortes transversales de útero por animal23,31; el edema del endometrio profundo fue evaluado por morfometría en 36 áreas en 12 cortes transversales de útero31; la hipertrofia miometrial fue evaluada por morfometría en 36 áreas en 12 cortes transversales de útero31,32, y la respuesta proliferativa fue evaluada por recuento de figuras mitóticas en 24 cortes de útero en cada capa histológica uterina por separado y expresada como número de mitosis por corte de útero32. Los resultados fueron expresados como % de la respuesta obtenida con E en ratas controles, valor que fue definido como 100% de respuesta, y definiendo el valor obtenido en los controles como 0% de respuesta, pudiendo existir valores negativos cuando las mediciones reflejaron valores inferiores a los del control33.

Análisis Estadístico: Para realizar comparaciones múltiples entre las condiciones experimentales, los datos fueron sometidos al test de la mínima diferencia significativa (LSD). La varianza común para este test fue obtenida por análisis de varianza de entrada simple (ANOVA), y no se declaran diferencias significativas a menos que el test de ANOVA fuera significativo (p < 0,05)34.

Resultados

La figura 1 muestra que la eosinofilia uterina (A) y el edema endometrial (B) inducidos por E en animales expuestos a Cd son de mayor intensidad que las respuestas a E en animales no expuestos a Cd (p < 0,0001 y p < 0,001 para ambas respuestas). La figura 2 muestra que la exposición a Cd inhibe parcialmente la hipertrofia celular inducida por E en miometrio circular (p < 0,05, en comparación con la respuesta a E animales no expuestos a Cd), y en ausencia de hormona, la exposición a Cd causa una leve hipertrofia celular en este tejido (p < 0,01, en comparación con controles no tratados con hormona y no expuestos a Cd). La figura 3 muestra que el Cd inhibe en forma pronunciada la respuesta proliferativa a E en epitelio luminal uterino (A) y en miometrio circular (B) (p < 0,001 y p < 0,0001 respectivamente, en comparación con la respuesta proliferativa a E en animales no expuestos a Cd).




La figura 4 muestra microfotografías representativas de endometrio profundo y miometrio circular (A, B y C) y epitelio endometrial luminal (D, E y F), en animales controles sin exposición a Cd ni tratamiento con E (A y D), sin exposición a cadmio y tratados con E (B y E) y en expuestos a Cd y tratados con E (C y F). No se muestra la condición expuestos a Cd y sin tratamiento hormonal, por su similitud a la de animales controles. La eosinofilia uterina y el edema endometrial profundo son de mayor magnitud en animales expuestos a Cd y tratados con E (C), que en los no expuestos tratados con E (B); no se observan eosinófilos uterinos ni edema endometrial profundo en animales controles (A). Se observa un mayor número de figuras mitóticas en animales no expuestos tratados con E (E) que en aquellos expuestos a Cd y tratados con E (F).


Discusión

Hasta nuestro conocimiento, el presente estudio entrega la primera evidencia experimental que la exposición aguda a Cd potencia algunas respuestas a E mientras que inhibe otras. El pretratamiento con Cd 2 h antes del tratamiento hormonal potencia la eosinofilia y el edema uterinos (respuestas no-genómicas), pero inhibe la proliferación celular en epitelio luminal uterino y miometrio, y la hipertrofia celular en miometrio circular. Esta disociación de respuestas a la hormona, sugiere diferencias en la interacción con cada uno de los dos mecanismos descritos en el útero para la acción de E19,22,25. Considerando el papel de los eosinófilos uterinos en el desarrollo del edema endometrial inducido por E22,24, la potenciación de esta última respuesta por Cd puede ser explicada por un aumento en el número de eosinófilos uterinos. En concordancia con los presentes resultados, se ha demostrado previamente que toda condición experimental que incremente la eosinofilia uterina22, aún en ausencia de E22, incrementa en forma paralela el edema endometrial. Mas aún, se ha reportado una correlación entre eosinofilia e imbibición acuosa uterinos inducidos por E35.

Nuestro estudio no permite discernir si la leve hipertrofia celular en miometrio circular en ratas expuestas a Cd sin tratamiento con E es inducida por activación de receptores de E, o por otro mecanismo.

Las disimilitudes entre los efectos de la exposición aguda a cadmio, con aquellos de una exposición a plomo33, sugieren diferencias en los mecanismos involucrados. El plomo inhibe la eosinofilia uterina inducida por E33; en cambio el Cd potencia dicha respuesta hormonal. El plomo antagoniza totalmente la hipertrofia celular inducida por E en miometrio circular33, en cambio el Cd sólo la inhibe levemente. Esto puede sugerir que algunos de los mecanismos involucrados en las toxicidad de ambos metales en útero no sean los mismos.

La importante inhibición por Cd de la respuesta proliferativa a E en miometrio y epitelio luminal uterino puede contribuir a explicar la infertilidad causada por Cd tanto en animales de laboratorio4 como en la mujer9. Una interacción con la acción de E después de la menar-quia puede interferir con el desarrollo de los órganos sexuales y causar secuelas. Esta posibilidad deberá investigarse en estudios epidemiológicos en pacientes pediátricos y en adultos. La diferencia entre la magnitud de la inhibición de la respuesta proliferativa en miometrio y la leve inhibición de la hipertrofia celular en este tejido por Cd, sugieren, pero no demuestran, diferencias entre los receptores involucrados en ambas respuestas o en los mecanismos moleculares involucrados (cofactores, co-inductores alostéricos, fosforilación del receptor, etc). Estas posibles diferencias también deberán ser investigadas.

Numerosos agentes químicos que interactúan en forma aguda con la acción de los E32,36,37, también causan efectos diferidos irreversibles después de una exposición perinatal29,38. El mecanismo involucrado es el imprinting o programación celular, que ocurre en períodos críticos del desarrollo fetal tardío, perinatal o infantil temprano, y es responsable del desarrollo de diversas patologías que se manifiestan más tarde en la vida29,38, incluidas patologías ginecológicas y alteraciones de la sexualidad39. Trabajos en curso en nuestro Laboratorio están destinados a explorar esta posibilidad, que alerta ante la necesidad de evitar la exposición a Cd durante estos períodos tan sensibles del desarrollo de órganos y tejidos, y que puede ser responsable de diversas patologías gineco-obstétricas de la mujer postpuberal, adolescente o adulta, o que afecten su sexualidad.

Se concluye que la exposición aguda a Cd afecta de manera diferente las respuestas a E en los diversos tipos celulares uterinos de rata prepuberal, y que futuros estudios deberán verificar si este efecto contribuye a explicar para la especie humana la infertilidad causada por exposición a Cd, e investigar si la exposición prenatal o postnatal temprana induce efectos diferidos persistentes, como puede ocurrir en población infantil prenatalmente expuesta a Cd.

 

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Trabajo recibido el 12 de noviembre de 2007, devuelto para corregir el 03 de enero de 2008, segunda versión 17 de marzo de 2008, aceptado para publicación 23 de abril de 2008.

Financiamiento: Proyecto de la Sociedad Chilena de Pediatría y Proyecto Multidisciplinario en Temas de Interés Nacional MULT 06/27-2 de la Vicerrectoría de Investigación de la Universidad de Chile.

Correspondencia a:

Andrei N. Tchernitchin V.
E-mail: atcherni@gmail.com, atcherni@med.uchile.cl

 

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