MODELADO MOLECULAR Y RELACIONES ESTRUCTURA-
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE QUINOLINAS ANALOGAS AL
ACIDO NALIDIXICO

M.I. CORDERO DE TROCONIS ^1*, M. PEDRIQUE DE AULACIO ² Y
TRINA COLMAN DE S ^1*.

¹Laboratorio de Modelaje Molecular,Facultad de Farmacia de la Universidad Central de
Venezuela, Apartado Postal 40109, Caracas, 1040-A, Venezuela.
²Laboratorio de Microbiología,Facultad de Farmacia de la Universidad Central de
Venezuela, Apartado Postal 40109, Caracas, 1040-A, Venezuela.
(Recibido: Marzo 30, 1999 - Aceptado: Julio 30, 1999)

RESUMEN

En el presente trabajo se estudiaron utilizando técnicas de modelado molecular varias quinolinas análogas al ácido nalidíxico, compuestos de conocida actividad antibacteriana, las cuales fueron sintetizadas y ensayadas in vitro como antibacterianos, con el fin de encontrar patrones estructurales comunes que pudiesen ser relacionados con su actividad biológica. Se utilizó como compuesto de referencia el ácido nalidíxico cuya estructura fue tomada de la Base de Datos de Cambridge y para localizar la posición del grupo éster se utilizó la conformación bioactiva reportada para la norfloxacina. Se realizó un análisis conformacional utilizando Mecánica Molecular y Dinámica Molecular y se utilizaron las conformaciones de mínima energía para la realización de cálculos de Mecánica Cuántica. Como primer reporte se evaluaron las propiedades calculadas y se relacionaron con la actividad in vitro contra Escherichia coli, y se realizó un análisis de regresión. De este estudio pudimos concluir que la diferencia entre los niveles de energía de los orbitales de frontera, el momento dipolar y factores estéricos pueden ser relacionados con la actividad antibacteriana in vitro de estos compuestos.

PALABRAS CLAVES: Modelado molecular, antibacterianos, quinolinas.

ABSTRACT

In this paper we studied using molecular modeling techniques several quinoline analogs of nalidixic acid, compound with known antibacterial activity, synthesized and in vitro tested, in order to look for common structural patterns that could be related to their biological activity. We used nalidixic acid as reference compound, its structure was taken from Cambridge Structural Database, and to locate the ester group we used the reported bioactive conformation of norfloxacin. We made a conformational analysis using Molecular Mechanics and Molecular Dynamics, and then we used the lower enegy conformations to run Quantum Mechanical calculations. As a first report the evaluated properties were related with the in vitro activity against Escherichia coli for each compound, and a regression analysis was made, concluding that the energetic difference betwen the frontier orbitals, the dipolar moment and steric factors could be related to to the quinoline analogs in vitro antibacterial activity.

KEY WORDS : Molecular modeling, antibacterials, quinolines.

INTRODUCCION

El ácido nalidíxico fue introducido en 1963 como un compuestoantibacteriano, activo contra infecciones del tracto urinario producidaspor bacterias grm negativas^1,2),posteriormente se han sintetizado una serie de análogos con el finde aumentar su espectro antibacteriano, entre ellos los análogostipo quinolona^3-7). Sin embargodebido a que las bacterias han desarrollado resistencia a gran númerode compuestos se hace necesario que permanentemente se continúela búsqueda de nuevos compuestos antibacterianos que puedan presentarun más amplio espectro, o una menor toxicidad, especialmente parauso pediátrico. En el presente trabajo se estudiaron las relacionesestructura química actividad de varios análogos quinolínicosdel ácido nalidíxico (Figura 1). Elácido nalidíxico fue utilizado como compuesto de referenciapara los cálculos computacionales. Se realizó un estudiode modelado molecular utilizando Mecánica Molecular, DinámicaMolecular y Mecánica Cuántica, se sintetizaron los compuestosy se realizó una evaluación antibacteriana preliminar conel fin de relacionar las propiedades calculadas en el estudio de modeladomolecular con la actividad antibacteriana in vitro.

FIG. 1. Estructuras del ácido nalidíxico 1,y compuestos estudiados.

PARTE EXPERIMENTAL

MODELADO MOLECULAR

Todos los cálculos ofueron realizados en u naestaciónde trabajo CAChe utilizando licencia de Software de la compañíaOxford Molecular Group. CAChe Scientific⁸⁾.La Mecánica Molecular utilizada por el sistema CAChe utiliza elcampo de fuerza MM2 de Allingher^9,10)mejorado por CAChe Scientific. Las coordenadas del ácido nalidíxicofueron obtenidas de la Base de Datos de Cambridge^11,12)en un equipo Silicon Graphics, utilizando licencia de software de la compañíaMolecular Simulations (MSI)¹³⁾, los datosluego fueron traducidos al sistema CAChe para ser utilizados como referencia.Los modelos tridimensionales del resto de los compuestos fueron construidoshaciendo uso del editor del sistema CAChe y comparados con la estructuradel ácido nalidíxico. Estas estructuras sirvieron como puntosde partida para el análisis conformacional de cada uno de los compuestosutilizados para definir los posibles requerimientos para su actividad biológica.Inicialmente los compuestos fueron minimizados utilizando MecánicaMolecular (MM)^9,10). Conel fin de obtener conformaciones cercanas al mínimo global se realizóuna búsqueda secuencial utilizando todos los enlaces rotables. Losresultados fueron analizados y las conformaciones que diferían enmenos de 5 kcal/mol de la conformación de mínima fueron minimizadasnuevamente utilizando MM. Luego se realizaron cálculos de DinámicaMolecular (DM) a 900 y 300°K ^14,15).La conformación de menor energía identificada por este procesofue utilizada para realizar cálculos de Mécanica Cuántica,para ello se utilizó el programa MOPAC vs 94,0 ¹⁶⁾utilizando la opción COSMO¹⁷⁾ parasimular el solvente (agua). Las propiedades calculadas fueron tabuladasutilizando el Tabulador del sistema CAChe, con el fin de convertir losdatos en coordenadas en las tres dimensiones y obtener los gráficoscorrespondientes a la densidad electrónica, orbitales de fronteray potenciales moleculares electrostáticos. Gráficos en las Figuras 2 y 4. Adicionalmente, utilizando el programaCAChe Project Leader¹⁸⁾ se calcularon losíndices topológicos de forma 1 (Kappa 1, cuantifica el númerode ciclos en una estructura química), 2 (Kappa 2, cuantifica elgrado de linearidad o parecido a una estrella de una estructura química)y 3 (Kappa 3, cuantifica el grado de ramificación desde el centrode una estructura química)¹⁹⁾. El restode las propiedades incluidas para el análisis de relaciónestructura química actividad biológica fueron extraidos delos archivos generados por los cálculos teóricos realizados. Resultados en la Tabla I.

TABLA I. Columnas B a I, valores calculados para las propiedades de las diferentes quinolinas. Columna J actividad in vitro contra Escherichia coli; Columna K valores calculados de actividad de acuerdo con la ecuación de regresión utilizando los valores de las propiedades en las columnas C,E,F,G e I ( las que presentaron mayores valores de r² en los cálculos de regresión simple)

SINTESIS

Los análogos quinolínicos fueron sintetizados utilizandoel método previamente reportado por Adams y colaboradores²⁰⁾,utilizando el reactivo de Vilsmaier con los correspondientes anilinobutenoatos.

Una vez sintetizadas las quinolinas fueron purificadas utilizando cromatografíade capa fina o cromatografía de columna. Las quinolinas sólidasfueron recristalizadas utilizando mezcla de hexano:acetato de etilo. Loscompuestos obtenidos fueron caracterizados por sus espectros de Infrarrojo,Resonancia Magnética Nuclear y Espectrometría de Masas.

Los espectros de IR fueron tomados en los espectrómetros PerkinElmer modelo 377 y Shimadzu modelo IR-400, utilizando los compuestos puros.Las absorciones se reportan en cm^-1 y se indican los gruposfuncionales responsables de dichas absorciones.

Los espectros de resonancia magnética protónica (¹H-RMN)fueron tomados en un espectrómetro Jeol 270 MHz, utilizando tetraclorurode carbono o cloroformo deuterado como solvente y tetrametilsilano (TMS)como referencia interna. El desplazamiento químico (d)de los hidrógenos asignados se reporta en ppm con relaciónal TMS.

Los espectros de masas (EIMS) fueron tomados en un espectrómetroHewlett-Packard, modelo 5995 a 70 eV. Se reportan los picos con relaciónm/z de los fragmentos principales.

Los puntos de fusión fueron tomados en un aparato tipo Thomas,se reportan en grados centrígrados.

3-carboetoxi-2-metil-quinolina [2]: P.F. 72-73ºC. ¹H-RMN:8,8 (s, 1H, H₄, de la quinolina), 7,4-8,1 (m, 4H, aromáticos,H₅, H₆, H₇, H₈), 4,3 (c, 3H,CH₂-CH₃), 3,0 (s, 3H, CH₃-Ar),1,4(t, 3H, CH₃-CH₂). IR; 3100 (CH, aromático,2950(CH, olefínico), 1713(C=O, éster), 1610 (C=C, quinolina),1480 (metilo aromático), 1360 (metilo aromático), 1280 (C-D-C,éter alquil aromático), 1130 (C-O, éster aromático),866 (quinolina). EM (m/z): 215 (M⁺, 92,2%), 214 (M⁺-H, 3,3%), 200 (M⁺ -CH₃, 4,3%), 186 (M⁺-CHO, 12%), 185 (M⁺ -CH₂O, 12%), 170 (M⁺-OC₂H₅, 100%), 142 (M⁺ -C₂H₄O-CO-H,69,2%), 115 (M⁺ -C₂H₄O-CO-H, 64,6%), 159(M⁺ -OC₂H₅-CO-HCN, 31%).

3-carboetoxi-2-metil-7-metoxiquinolina [3]: P.F. 97-98ºC.¹H-RMN:8,65 (s, 1H, H₄, quinolina), 7,70 (d, 1H, H₅, quinolina,J = 8,4 Hz), 7,35 (d, 1H, H₈ quinolina, J = 2,2 Hz), 7,13 (dd,1H, H6, J = 8,4 Hz), 4,3 (c, 2H, CH₂-CH₃),3,9 (s, 3H, OCH₃), 3,0 (s, 3H, -CH₃),1,5 (t, 3H, -CH₂-CH₃). IR; 3010 (CH, aromático),2960 (CH, alifático), 1730 (C=O, éster), 1620 (C=C, quinolina),1480 (C=N, quinolina), 1140 (C-O, éster), 1069 (C-O, éter,833 (quinolina). EM (m/z): 245 (M⁺, 90,3%).

3-carboetoxi-2-metil-6-metoxiquinolina [4]: P.F. 79-80ºC.¹H-RMN:8,52 (s, 1H, H₄, quinolina), 7,87 (d, 1H, H₈, quinolina,J = 9,0 Hz), 7,33 (dd, 1H, H₇, J = 9,0, J = 2,2 Hz), 6,96 (d,1H,H₅, J=2,2 Hz), 4,4 (c, 2H, CH₂-CH₃),3,87 (s, 3H, OCH₃), 3,0 (s, 3H, -CH₃),1,4 (t, 3H, -CH₂-CH₃). IR; 3010 (CH, aromático,2960 (CH, alifático), 1715 (C=O, éster), 1600 (C=C, quinolina),1480 (C=N, quinolina), 1110 (C-O, éster), 1010 (C-O-C, alquil aromático),820 (quinolina).

3-carboetoxi-2-metil-8-metoxiquinolina [5]: P.F. 100ºC. ¹H-RMN:8,68 (s, 1H, H₄ de la quinolina), 7,42 (m, 1H, H₅de la quinolina), 7,10 (dd, 1H, H₆, J = 9,0, J = 5,0 Hz), 7,42(m, 1H, H₇ de la quinolina), 4,4 (c, 2H, CH₂-CH₃),4,1 (s, 3H-OCH₃), 3,1 (s, 3H, -CH₃Ar),1,5 (t, 3H, CH₂-CH₃). IR; 3010 (CH, aromático),2960 (CH, alifático), 1730 (C=O, éster), 1626 (C=C, quinolina),1450 (C-N, quinolina), 1280 (C-O-C, éter), 1130 (C-O-C, éteralquil aromático), 810 (quinolina), 740 (aromático).

3-carboetoxi-2-metil-7-fluoroquinolina [6]: P.F. 79-80ºC.¹H-RMN:8,55 (s, 1H, H₄, de la quinolina), 7,8 (m, 1H, H₅,quinolina), 7,3 (dd, 1H, H₈, J = 10 Hz; 2,2 Hz), 6,95 (m, 1H,H₆, quinolina), 4,31 (c, 2H, OCH₂-CH₃),2,91 (s, 3H, CH₃-Ar), 1,35), 1,36 (t, 3H, CH₃-CH₂).IR; 2950 (CH, alifático), 1730 (C=O, éster), 1660 (C=C, quinolina),1480 (C=N, quinolina), 1213 (C-O-C, éter), 1190 (C-F), 1140 (C-O,éster), 935 (CH, quinolina). EM (m/z): 233 (M⁺, 66%),232 (M⁺ -H, 3,2%), 218 (M⁺ -CH₃, 4,5%),188 (M⁺ -OC₂H₅, 100%), 187 (M⁺-OC₂H₅-H, 46,9%), 160 (M⁺ -OC₂H₅-H,46,9%), 160 (M⁺ -OC₂H₅-CO, 64,6%), 159(M⁺ -OC₂H₅-CO-H, 21,7%).

3-carboxetoxi-2-metil-6-fluoroquinolina [7]: P.f. 80-81ºC.¹H-RMN:8,5 (s, 1H, H₄, quinolina), 7,95 (m, 1H, H₈ quinolina),7,35 (d, 1H, H₅, J = 10 Hz), 7,05 (m, H₇, 1H, quinolina),4,35 (c, 2H, OCH₂-CH₃), 2,91 (s, 3H, CH₃-Ar),1,36 (t, 3H, CH₃-CH₂). IR; 2930 (CH, olefínico),1730 (C=O, éster), 1626 (C=C, quinolina), 1450 (C=N, quinolina),1250 (C-O-C, éster), 1196 (C-F), 1070 (C-O-C, étr), 950 (quinolina).

3-carboetoxi-2-metil-6-cloroquinolina [8]: P.F. 92ºC. ¹H-RMN:8,59 (s, 1H, H₄ de la quinolina), 7,96 (d, 1H, H₈,J = 9,0 Hz), 7,78 (d, 1H, H₅, J = 2,0 Hz), 7,54 (dd, 1H, H₇,J = 9,0 Hz; 2,0 Hz<), 4,31 (c, 2H, CH₂-CH₃),Bol. Soc. Chil. Quím., 45, N 1 (2000) 3,10 (s, 3H, CH₃),1,34 (t, 3H, -CH₂-CH₃). IR; 3010 (CH aromático),2965 (CH alifático). 1720 (C=O, éster), 1620 (C=C, quinolina),1480 (C=N, quinolina), 1280 (C-O-C, éter), 1170 (C-O éster),780 (C-Cl). EM (m/z): 251 (M⁺ +2, 21,8%), 249 (M⁺,63%), 234 (M⁺ -CH₃, 3,2%), 223 (M⁺ +2-C₂H₄,5,9%), 221 (M⁺ -C₂H₄, 17%), 203 (M⁺-C₂H₄ -H, 50,3%), 150 (M⁺ -C₂H₄O-CO-HCN,8,1%).

EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

Se utilizó la técnica de difusión en placa. Loscompuestos estudiados fueron probados en agar Mueller Hinton^21,22)inoculado con cultivos de 18 horas de cada uno de los microorganismos utilizadospara cada uno de los compuestos ensayados. Se utilizaron tres concentracionespara cada uno de los compuestos (100, 200 y 400 ppm en cloroformo), luegose adicionaron 50 &micro;l de cada dilución a discos de papel Difcode 13 mm de diámetro, y se colocaron en placas previamente preparadascon el agar inoculado. Las placas fueron incubadas de 18 a 24 h a 35&deg;C.paralelamente se realizó un control impregnando los discos de papelcon cloroformo. Luego se determinó la presencia de halos inhibición.Los resultados se muestran en la Tabla II.

TABLA II. Actividad antibacteriana delos análogos quinolínicos ensayados.

	Staphilococus aureus			Escherichia coli			Pseudomona aeruginosa
Compuesto	100 ppm	200 ppm	300 ppm	100 ppm	200 ppm	300 ppm	100 ppm	200 ppm	300 ppm
1	-	-	-	+	+	+	+	+	+
2	-	-	-	-	-	-	-	-	-
3	-	-	-	-	-	-	-	-	-
4	-	-	-	-	-	-	-	-	-
5	-	-	-	-	-	-	-	-	-
6	+	+	+	+	+	+	+	+	+
7	+	+	+	+	+	+	+	+	+
8	-	-	-	-	-+	+	-	-	+

	Bacilus subtilus			Salmonella paratyphy			Candida albicans
Compuesto	100 ppm	200 ppm	300 ppm	100 ppm	200 ppm	300 ppm	100 ppm	200 ppm	300 ppm
1	-	-	-	-	-	-	-	-	-
2	-	-	-	-	-	-	-	-	-
3	-	-	-	-	-	-	-	-	-
4	-	-	-	-	-	-	-	-	-
5	-	-	-	-	-	-	-	-	-
6	+	+	+	-	-	-	-	-	-
7	+	+	+	-	-	-	-	-	-
8	+	+	+	-	-	-	-	-	-

Los microorganismos utilizados para el ensayo fueron Staphylococcusaureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Salmonellaparatyphi B. y Candida albicans, todos pertenecientes al Cepariode la Cátedra de Microbiología de la Facultad de Farmaciade la Universidad Central.

RESULTADOS Y DISCUSION

Todos los análogos quinolínicos estudiados presentaronsimilares propiedades conformacionales, parecidas al ácido nalidíxico,mostrando sólo libertad conformacional alrededor del grupo éster,esto significa que cualquiera de ellos podría ocupar el espacioque puede ocupar el ácido nalidíxico en el receptor desdeel punto de vista estérico.

Todos los compuestos estudiados muestran densidades electrónicasmayores alrededor del grupo éster (Figura 2).Los análogos activos mostraron una densidad electrónica adicionalde alta densidad Bol. Soc. Chil. Quím., 45, N 1 (2000) alrededorde C5 y C7. El compuesto 5 inactivo no muestra estas regiones dealta densidad. Los compuestos inactivos 3 y 4 presentaronaltas densidades en la misma región pero la presencia del grupometilo probablemente causa un efecto estérico que disminuye susposibilidades de unirse al receptor.

Aunque los potenciales moleculares electrostáticos han sido mostradoscomo indicadores útiles para compararlos con el comportamiento biológicode los compuestos²³⁾, nuestros resultadosno mostraron diferencias significativas entre los compuestos activos einactivos (Figura 3).

El trabajo de síntesis fue realizado tal como había sidopreviamente reportado con resultados similares.

Con el fin de correlacionar en una forma preliminar la actividad antibacterianasobre la Escherichia coli con las propiedades calculadas, los compuestosse clasificaron como activos, medianamente activos e inactivos. Los activosfueron los compuestos que presentaron actividad en las tres concentracionesensayadas (100, 200 y 400 ppm) y fueron arbitrariamente asignados con unaactividad de 6.000. Los medianamente activos fueron activos a solo dosde las concentraciones ensayadas (200 y 400 ppm) y se les asignóarbitrariamente una actividad de 3.000. A los inactivos se les asignóuna actividad de 0.000.

Una vez asignadas las actividades fueron utilizadas junto con las propiedadescalculadas utilizando el programa CAChe Project Leader¹⁸⁾.Las propiedades incluidas fueron la conformación de mínimaenergía, los índices topológicos de forma, momentodipolar, área de la superficie accesible al solvente, nivel energéticodel HOMO, nivel energético del LUMO, diferencia en energíaentre HOMO y LUMO, y la actividad antibacteriana in vitro.

Luego se realizaron regresiones lineales con el fin de obtener indiciossobre cuales de las propiedades calculadas podrían afectar la actividadbiológica, para ello se escogieron las propiedades que nos dieronuna correlación (r²) alrededor de 0,5 (Tabla III) para luego realizar cálculos de regresión múltipleutilizando estos valores. Una vez realizado este cálculo se obtuvouna ecuación que se muestra en la última columna de la Tabla I, la cual nos dio el valor mayor de r². Luego se hizo ungráfico de los valores calculados para la actividad con esta ecuación,contra los valores determinados experimentalmente, obteniéndoseuna muy buena correlación de 0,979 (Figura 4).Esta buena correlación nos indica que a pesar de que nuestra ecuaciónno tiene valor predictivo ya que la actividad biológica no fue determinadaen una forma cuantitativa nos da muy buenos indicios sobre las propiedadesque influyen en la actividad antibacteriana de estos compuestos.

TABLA III. Valores de r² calculados por regresiónlineal entre las propiedades estudiadas y la actividad contra Escherichiacoli.

Propiedad	r2
Conformación de min energía	0,116
Energía del HOMO	0,606
Energía del LUMO	0,053
HOMO-LUMO	0,516
Indice de forma de orden 1	0,863
Indice de forma de orden 2	0,597
Indice de forma de orden 3	0,001
Momento dipolar	0,839

FIG. 2. Gráficos de densidad electrónica de loscompuestos activos 1,2,6,8 y de los compuestos inactivos 3,4 y 5.

FIG. 3. Gráficos de potencial molecular electrostáticode los compuestos activos 1,2,6 y 8; y de los compuestosinactivos 3, 4 y 5.

FIG. 4. Gráfico de la relación lineal entre losvalores de índice de actividad antibacteriana contra Escherichiacoli determinados experimentalmente (eje X) para los compuestos 1al 8; índice de actividad antibacteriana contra Escherichiacoli determinado experimentalmente vs. índice de actividad antibacterianacontra Escherichia coli calculado de acuerdo a la ecuaciónde la columna K, Tabla I, para los compuestos 1al 8 (eje Y).

CONCLUSIONES

Nuestros resultados muestran que la actividad antibacteriana de losanálogos quinolínicos estudiados puede ser relacionada conefectos estéricos y electrostáticos.

Aunque la ecuación obtenida por nosotros no puede medir la predictividadde la misma, nos sirvió para demostrar que la diferencia energéticaentre los orbitales de frontera HOMO y LUMO, los índices topológicosy el momento dipolar deben estar asociadas a la diferencia en actividadbiológica, y nos permiten sugerir la síntesis de otros compuestosrelacionados con similares características a los compuestos activos.

El uso de este estudio de relación estructura química-actividadbiológica aún cuando fue realizado en forma preliminar nosprovee de una técnica rápida y sencilla para planificar lasíntesis de nuevos análogos. Adicionalmente este estudionos sugiere que vale la pena continuar con el trabajo y realizar nuevosensayos biológicos ya no en forma preliminar sino en una forma cuantitativa,siendo especialmente interesantes los compuestos 6 y 7 quemostraron actividades contra gérmenes gram positivos y gram negativos.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece el soporte financiero del Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad Central de Venezuela, proyectos 06.03.440.95, 06.10.3337 y 06.10.3338.94
__________________________________
*Authors to whom correspondence should be addressed,Fax: 58-2-576-8067, e-mail: mtc1508@telcel.net.ve

REFERENCIAS

1. G. Lescher y colaboradores. J. Med. Pharm. Chem., 5, 1063 ( 1962).

2. R. Albrecht. Prog. In Drug Research, 21, 9 (1977).

3. J. Wolfson y S. Hooper. Clin. Microbiol. Reviews, 2, 4 (1989).

4. C. Siporin. Ann.Rev.Microbiol., 43, 601 ( 1989)

5. N.D. Harris. Synthesis, 220,( 1971)

6. T.P. Culbertson, J.P. Sánchez, L. Gambinoy J. Sesnie. J. Med. Chem., 33, 2270 (1990).

7. J.M. Domagala, C.L. Heifetz, M.P. Hutt, T.F. Mich, J.B. Nichols, M. Solomon y D.F. Worth. J. Med. Chem., 31, 991 (1988).

8. CAChe (Computer Aided Chemistry) version 4, 1998, Manual de referencia, Oxford Molecular Group, CAChe Scientific, Beaverton Oregon, E.E.U.U.

9. N.L. Allinger. J. the Am. Chem. Soc., 108, 8153 ( 1977).

10. G.L. Seibel, P.A. Kollman. Molecular Mechanicsand the Modeling of Drug Structures, en Comprehensive Medicinal Chemistry. Vol. 4. Quantitative Drug Design, C. Hansch, P.G. Sammes, J.B. Taylor, C.A. Ramdsen Eds., Pergamon, 125-138 ( 1990).

11. Cambridge Structural Database System, V5.15, 1998.

12. C.P. Huber, D.S.S. Gowda y K.R. Acharya. ActaCrystallogr., Sect. B, 36, 497 (1980).

13. Insigth II User Guide, MSI, San Diego, E.E.U.U.,septiembre 1997.

14. M. Billeter, A.E. Howard, L.D. Kuntz y P.A. Kollman.J.Am. Chem. Soc., 110, 8385 (1988).

15. P. Auffinger y G. Wipff. J. of ComputationalChemistry, 11, 19 (1990).

16. J.P. Stewart. Quantum Chemistry Program Exchange,programa 445 (1983).

17. A. Klaunt, G.Y. Schurmann. J. Chem. Soc. PerkinTrans 2, 2, 799 (1993).

18. CAChe (Computer Aided Chemistry, version 3,9, 1996,Project Leader, Oxford Molecular Group, CAChe Scientific, Beaverton Oregon,E.E.U.U.

19. L.H. Hall y L.B. Kier en Reviews in ComputationalChemistry, Cap. 9, Ed. K.B. Lipkowitz y D. Boyd (1992).

20. D.R. Adams, J.N. Dominguez y J.A. Perez. TetrahedronLetters, 24, 517 (1983).

21. J. Matsen y A. Barry. Manual of Clinical Microbiology,2da Edición, Editado por F. Lennete, E. Spaulding y J. Truant,Capítulo 46, 418 (1974).

22. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,The Williams S. Wilkins Co. 8ava Edición (1974).

23. C. Thompson, D. Higgins y C. Edge. J. Mol. Graphics,6,171 (1988).