Agricultura Técnica (Chile) 67(3):244-252 (Julio-Septiembre)

INVESTIGACIÓN PRODUCCIÓN VEGETAL

Utilización de Microsatélites para la Determinación de la Polilla de la Manzana Cydia pomonella L. (Lepidoptera: Tortricidae) en Chile Central

Utilization of Microsatellites to Determine Genetic Variability of the Codling Moth Cydia pomonella L. (Lepidoptera: Tortricidae) in Central Chile

Juan L. Espinoza¹, Eduardo Fuentes-Contreras²*, Wilson Barros¹, Claudio Ramírez<sup>2

1</sup> Universidad de Talca, Facultad de Ciencias Agrarias, Casilla 747, Talca, Chile. E-mail: efuentes@utalca.cl *Autor para correspondencia.
² Universidad de Talca, Instituto de Biología Vegetal y Biotecnología, Casilla 747, Talca, Chile.
Recibido: 20 de julio de 2006.                                                                          Aceptado: 26 de octubre de 2006.

ABSTRACT

Codling moth (Cydia pomonella L.) is the main pest of pip fruits worldwide. Despite its economic importance, little is known about the genetic structure and patterns of movement at local and regional scale, important aspects for establishing a control strategy for this pest. An analysis of genetic variability on six populations of C. pomonella using microsatellite was performed in the two major apple (Malus domestica Borkh.) growing regions of Central Chile. In spite of geographic distances between some populations (aprox. 180 km), there was little genetic differentiation among populations (F_ST = 0.0-0.0097 and G_ST = 0.005-0.127), without isolation by distance, and high levels of gene flow (Nm ≈ 250). High frequencies of null alleles were found over all loci across populations (Na = 0.292) which seem to explain the significant heterozygote deficiencies found. Approximatelly 98% of the variance was found within individuals and very little at the other hierarchical levels. The high levels of genetic diversity and gene flow detected seem to indicate that the codling moth populations studied in both regions have an almost continuous distribution.

Key words: gene flow, population structure, biotechnology.

RESUMEN

La polilla de la manzana (Cydia pomonella L.) es la plaga más importante de los frutales pomáceos en el mundo. A pesar de su gran importancia económica, poco se sabe acerca de su estructura genética y patrones de movimiento a escala local y regional, aspectos importantes para establecer una estrategia de control de esta plaga. Mediante la utilización de microsatélites se realizó un análisis de la variabilidad genética de seis poblaciones de la polilla de la manzana en las dos principales regiones productoras de manzanas (Malus domestica Borkh.) en Chile Central. A pesar de las distancias geográficas entre algunas poblaciones (aprox. 180 km), se encontraron bajos coeficientes de diferenciación genética entre poblaciones (F_ST = 0,0-0,00097 y G_ST = 0,005-0,127), sin presencia de aislamiento por distancia, y con altos niveles de flujo génico (Nm ≈ 250). Se encontraron altas frecuencias de alelos nulos (Na = 0,292) para todos los loci, a través de las poblaciones analizadas, lo que explicaría el significativo déficit de heterocigotos encontrado. Aproximadamente un 98% de la variabilidad genética encontrada corresponde a una variación intraindividual, atribuyéndose prácticamente nada a los demás niveles jerárquicos. La alta diversidad génica y los altos niveles de flujo génico parecen indicar que las poblaciones estudiadas de la polilla de la manzana en ambas regiones estudiadas están distribuidas formando casi un continuo.

Palabras clave: flujo génico, estructura poblacional, biotecnología.

INTRODUCCIÓN

La principal plaga de los frutales pomáceos a nivel mundial es la polilla de la manzana (Cydia pomonella L.), la cual es también la plaga más importante del manejo fitosanitario del manzano (Malus domestica Borkh.) en Chile (Klein y Waterhouse, 2000). Esta plaga probablemente fue introducida hacia fines del 1800, estando actualmente distribuida desde la Región de Tarapacá a la Región de Los Lagos. Las poblaciones de C. pomonella más significativas desde el punto de vista económico, se ubican entre las regiones del Libertador General Bernardo O’Higgins y del Maule (aprox. 33°40’ a 35°50’ lat. Sur), las cuales concentran más del 80% de la superficie productora de manzanas a nivel nacional (Klein y Waterhouse, 2000).

El control tradicional de esta plaga con insecticidas neurotóxicos está siendo reemplazado progresivamente por programas de manejo integrado de plagas (MIP), los cuales incluyen insecticidas más selectivos y el uso de feromonas sexuales en programas de manejo de áreas extensas (Dorn et al., 1999; Calkins y Faust, 2003). Estas estrategias de control requieren información más detallada sobre la estructura y dinámica de las poblaciones de la polilla de la manzana, en particular sobre la dispersión y migración de la plaga tanto a nivel del huerto y su entorno como a nivel regional. Indirectamente es posible obtener esta información en forma eficiente a partir de la estimación cuantitativa de la variabilidad genética de las poblaciones de C. pomonella mediante la utilización de marcadores moleculares (Timm et al., 2006). En esta línea se han realizado estudios con isoenzimas en poblaciones de C. pomonella de Francia y Suiza, los cuales no encontraron diferencias significativas entre poblaciones de diversos orígenes geográficos y plantas hospederas (Buès y Toubon, 1992; Buès et al., 1995). Por el contrario, Timm et al. (2006) compararon poblaciones de C. pomonella de Sudáfrica mediante Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados (AFLPs), encontrando diferenciación significativa entre poblaciones de diferentes localidades geográficas independientemente de la planta hospedera.

Para el caso de Chile no existen antecedentes sobre la estructura y dinámica de las poblaciones de C. pomonella desde un punto de vista genético, aunque existen datos sobre resistencia incipiente a algunos insecticidas que sugieren que pueden existir altos niveles de flujo génico entre huertos con y sin aplicación de estos agroquímicos (Reyes et al., 2004; Fuentes-Contreras et al., 2007). Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue determinar la variabilidad genética y frecuencias genotípicas de poblaciones de C. pomonella provenientes de seis huertos de manzano de Chile Central, mediante la utilización de marcadores moleculares de tipo microsatélite desarrollados recientemente para esta plaga (Franck et al., 2005; Zhou et al., 2005). En particular, determinar si existe diferenciación entre poblaciones provenientes de las diferentes localidades, y si la ésta se correlaciona con la distancia geográfica entre localidades.

MATERIALES Y MÉTODOS

Marcadores moleculares. Los marcadores microsatélites o Secuencias Simples Repetidas (SSRs) son regiones del genoma en las que una secuencia corta, 2-6 pares de bases, se repite un cierto número de veces. Cada locus microsatélite tiene alelos con distinto número de repeticiones, lo cual se evidencia en bandas de distinto tamaño luego de su amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estos marcadores se heredan de manera codominante, permitiendo diferenciar bandas en individuos homocigotos y heterocigotos (Zhang, 2004). Los microsatélites presentan altas tasas de mutación, lo que permite diferenciar individuos estrechamente emparentados (Zhang, 2004). Esta alta variabilidad genética es muy útil para describir la estructura y flujo génico en poblaciones de insectos.

Los siguientes marcadores microsatélites específicos para C. pomonella se eligieron por su alto nivel de polimorfismo: Cp1.63, Cp2.39, Cp2.P, Cp3.169, Cp1.179, Cp3.56, Cp3.180 y Cp3.K, cuyas secuencias y características principales fueron detalladas por Franck et al. (2005).

Localidades y material biológico. Mediante la instalación detrampas de cartón corrugado durante marzo del 2005, se recolectaron entre 15 y 40 larvas diapausantes de C. pomonella en cada localidad (185 individuos en total). Estas larvas se separaron según el sexo y preservaron en etanol 95% a 4 ºC hasta que se realizó la extracción del ADN. Las localidades incluidas en el estudio fueron: Graneros 1 (34º03` lat. Sur, 70º39` long. Oeste) y Graneros 2 (34º04` lat. Sur, 70º43` long. Oeste) en la Región del Libertador General Bernardo O’Higgins; Los Niches (35º02` lat. Sur, 71º11` long. Oeste), Molina (35º06` lat. Sur, 71º16` long. Oeste), Pencahue (35º23` lat. Sur, 71º48` long. Oeste) y Colín (35º28` lat. Sur, 71º44` long. Oeste) en la Región del Maule.

Extracción del ADN. El ADN se extrajo desde las cabezas de las larvas según el protocolo de “salting out” (Sunnucks y Hales, 1996), moliendo el tejido con buffer de extracción TNES (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 400 mM, EDTA 20 mM, SDS 0,5%) e incubando en Proteinasa K (10 mg mL^-1) (Invitrogen, Sao Paulo, Brasil) por toda la noche a 37 °C. Las proteínas se precipitaron por adición de NaCl 5 M y subsecuentes centrifugaciones, recuperando de esa manera el sobrenadante. El ADN presente en este sobrenadante se precipitó con etanol en distintas concentraciones, además de centrifugaciones y frío. Finalmente, el ADN se secó en estufa (37 °C) y se resuspendió en 50 mL de agua ultra pura estéril. Para mejorar la pureza del ADN en algunas situaciones se utilizó el protocolo del Quantum Prep^® Plasmid Miniprep Kit (Bio-Rad Life Science, Hercules, California, USA), realizando sólo los pasos finales de purificación del ADN ya extraído, resuspendiendo finalmente las muestras en 50 mL y almacenando hasta su uso a –20 °C.

Amplificación del ADN. Las reacciones de PCR para los partidores específicos de C. pomonella se prepararon de acuerdo con Franck et al. (2005) en volúmenes de reacción de 10 mL, conteniendo Tris-HCl 10 mM pH 9,0, KCl 50 mM, MgCl₂ 1,5 mM, 50 mM de cada dNTP, 0,4 mM de cada partidor, 0,5 U de Taq DNA polimerasa (Invitrogen, Sao Paulo, Brasil) y 2 mL de ADN extraído. Las amplificaciones se realizaron usando un termociclador (MJ Research PTC-200, Waltham, Massachusetts, USA) con las siguientes condiciones de amplificación: un paso de desnaturalización inicial de 2 min a 94 °C, seguido de 30 ciclos consistentes de 30 s a 94 °C, 40 s a temperatura de “annealing” específica de 55 ºC para los partidores Cp3.169 y Cp3.K, y de 61 ºC para los partidores Cp1.63, Cp2.39, Cp2.P, Cp1.179, Cp3.56 y Cp3.180 y 40 s a 72 °C, además de un paso de extensión final de 3 min a 72 ºC.

Los productos de PCR se confirmaron en un gel de Agarosa-TBE 1X al 2,0%, cargando 2 mL de la reacción, previa adición de colorante, y comparándolo con un marcador de 100 pares de bases (pb) (Invitrogen, Sao Paulo, Brasil). Las amplificaciones exitosas se resolvieron por electroforesis en un gel de poliacrilamida al 6%, los que se visualizaron por tinción con nitrato de plata de acuerdo al protocolo del kit Silver Sequence (Promega Biosciences, Madison, Wisconsin, USA), y los tamaños de cada banda se registraron manualmente contra un marcador pGEM^®-3Zf(+) Vector (Promega Biosciences, Madison, Wisconsin, USA), previamente analizado en el laboratorio y cargado en el mismo gel.

Análisis estadístico. Con el programa MICRO-CHECKER v.2.2.3 (Van Oosterhout et al., 2004) se revisaron posibles corrimientos (stuttering) en el tamaño de bandas, amplificación predominante de alelos pequeños (dropout), ausencia de bandas en el gel (alelos nulos), y eventuales errores tipográficos. Posteriormente, los estadísticos básicos como el número promedio de alelos por locus (a), riqueza alélica efectiva por locus y por población (r), y diversidad génica de Nei (H) se obtuvieron de las frecuencias alélicas con el programa FSTAT v.2.9.3 (Goudet, 2001). Estimadores de heterocigocidad de Nei, tales como el índice de fijación (F_IS), heterocigosis media esperada total (H_T), heterocigosis media esperada por población (H_S) y coeficiente de diferenciación génica (G_ST) (Nei, 1973), también se calcularon para cada locus polimórfico usando el programa FSTAT v.2.9.3. La frecuencia de alelos nulos (Na) para cada población y locus se estimó mediante el programa MICRO-CHECKER v.2.2.3, utilizando el método de Chakraborty et al. (1992).

Un análisis jerárquico de varianza molecular (AMOVA) basado sobre 1.023 permutaciones, entregó los componentes de varianza sobre la base del coeficiente de diferenciación génetica entre poblaciones (F_ST), coeficiente de endogamia de poblaciones (F_IS) y coeficiente de endogamia total (F_IT) (Excoffier et al., 1992). La prueba de diferenciación de poblaciones contra la hipótesis nula de uniformidad genética se corrigió por el método secuencial de Bonferroni (Sokal y Rohlf, 1995) basada en 1.000 permutaciones de genotipos multilocus entre pares de poblaciones utilizando el programa ARLEQUIN v.2.0 (Schneider et al., 2000).

Se calcularon estimaciones del número de migrantes por generación (Nm) entre pares de localidades usando el algoritmo de Wright [(1-F_ST) (4 F_ST)^-1] (Hartl, 2000). Los valores de F_ST y distancia geográfica (km) entre pares de poblaciones se correlacionaron a fin de evaluar el grado de aislamiento por distancia. Para ello se realizó un análisis de regresión simple, obteniendo de esta forma el coeficiente de correlación de Pearson (r) mediante el programa SPSS v.10.0 (SPSS, 1999). Finalmente, la asociación entre matrices de distancia genética [F_ST (1-F_ST)^-1] y distancia geográfica (km) entre pares de poblaciones se evaluó con la Prueba de Mantel, utilizando 1.000 permutaciones aleatorias con el programa XLSTAT v.7.5.2 (XLSTAT, 2007).

RESULTADOS

Los ocho loci de microsatélites seleccionados presentaron un total de 210 alelos en los 185 individuos de C. pomonella examinados. Estos loci microsatélite permitieron diferenciar 185 genotipos multilocus, correspondientes a cada uno de los individuos analizados. El locus Cp3.169 presentó la mayor riqueza alélica (r) (6,53), mientras el locus Cp3.180 presentó el menor valor de esta variable (1,82) (Cuadro 1).

Cuadro 1. Número de alelos, rango de tamaño y riqueza alélica para ocho microsatélites polimórficos aislados de polilla de la manzana, Cydia pomonella, colectadas en seis localidades en Chile Central.
Table 1. Number of alleles, size range and allelic richness for eight polymorphic microsatellites isolated from codling moth, Cydia pomonella, collected in six localities of Central Chile.

Tres de las seis poblaciones analizadas presentaron todos sus loci polimórficos, mientras Graneros 1 presentó el locus Cp3.180 monomórfico, y Graneros 2 y Pencahue presentaron el locus Cp2.P monomórfico (Cuadros 1 y 2). La riqueza alélica (r) de cada población fluctuó de 3,36 para Pencahue a 4,37 para Los Niches (Cuadro 2). Por otro lado, sobre la base de la diversidad génica promedio de Nei (H), la población de Molina fue la más diversa, seguida por las poblaciones de Los Niches, Colín, Graneros 2, Graneros 1 y finalmente Pencahue (Cuadro 2).

Cuadro 2. Estadísticos de diversidad génica multi-locus para seis poblaciones de polilla de la manzana, Cydia pomonella, estimados por el pool genético de ocho marcadores microsatélites polimórficos.
Table 2. Multi-locus gene diversity statistics for six populations of codling moth, Cydia pomonella, estimated by the genotype gene pool of eight polymorphic microsatellite markers.

Las desviaciones de las frecuencias genotípicas desde las esperadas según el equilibrio de Hardy-Weimberg (H-W) para cada población, fueron medidas por el índice de fijación (F_IS). El valor de F_IS más alto fue de 0,304 en la población de Graneros 2 y el menor en Colín con 0,072 (Cuadro 2). Los alelos nulos se encontraron en una frecuencia relativamente alta (Na = 0,443 a 0,235) (Cuadro 2), lo que probablemente está asociado a la deficiencia de heterocigotos encontrada.

La distribución de parámetros de diversidad genética para cada locus se presenta en el Cuadro 3. La diversidad genética total (H_T) varió desde 0,131 en el caso del locus Cp3.180 a 0,844 en el caso del locus Cp3.169, mientras la diversidad genética dentro de la población (H_S) para estos mismos locus varió desde 0,130 a 0,820. La mayoría de los marcadores microsatélites exhibieron niveles pronunciados de diferenciación haplotípica en el área geográfica muestreada, como lo revelan los valores del coeficiente de diferenciación genética G_ST (Cuadro 3). El valor G_ST promedio de 0,05 indicó que sólo un 5% del total de la diversidad genética detectada fue explicado por las diferencias entre poblaciones. Un análisis de todas las poblaciones y loci resultó en un valor F_IS de 0,389, significativamente diferente de cero (P ≤ 0,001), es decir con una deficiencia de heterocigotos en las poblaciones analizadas. Cuando los loci fueron analizados de manera individual, todos resultaron con valores F_IS positivos, siendo los ocho loci significativamente diferentes de cero, es decir con una deficiencia de heterocigotos en las poblaciones analizadas. Sin embargo, nuevamente la alta frecuencia de alelos nulos (Na = 0,593 a 0,158) en seis de los ocho loci analizados probablemente esté relacionada con la deficiencia de heterocigotos observada (Cuadro 3).

Cuadro 3. Estadísticos de diversidad génica para cada locus dentro de seis poblaciones de Cydia pomonella estimados por ocho marcadores microsatélites (SSRs) polimórficos.
Table 3. Single-locus gene diversity statistics within six populations of Cydia pomonella estimated by using eight polymorphic microsatellite markers (SSRs).

En el AMOVA se encontró que todas las pruebas de diferenciación para los diferentes niveles jerárquicos fueron significativas, no detectándose diferencias estadísticas dentro y entre las diferentes poblaciones de polilla de la manzana (Cuadro 4). La mayor parte de la varianza fue encontrada dentro de los individuos (97,87%, F_IS = 0,02137, P < 0,001), luego entre individuos dentro de poblaciones (2,14%, F_IT = 0,02133, P < 0,001) y finalmente casi totalmente ausente entre poblaciones (-0,01%, F_ST = -0,00005, P < 0,001). No se encontró aislamiento por distancia, ya que la regresión simple entre F_ST y distancia geográfica (km) resultó no significativa (r = 0,007, P > 0,05). Del mismo modo, la prueba de Mantel indicó que no hay correlación significativa entre las matrices de divergencia genética y distancia geográfica entre pares de poblaciones (r = 0,010, P > 0,05).

Cuadro 4. Análisis jerárquico de varianza molecular (AMOVA) de la variación genética de Cydia pomonella.
Table 4. Hierarchical analysis of molecular variance (AMOVA) of the genetic variation of Cydia pomonella.

El Cuadro 5 muestra el coeficiente de diferenciación genética entre poblaciones (F_ST) y la distancia geográfica calculada entre pares para las seis poblaciones de C. pomonella en Chile Central. Para las muestras de poblaciones examinadas, los valores más altos de diferenciación genética sobre el pool genético de haplotipos fue indicado entre las poblaciones de Pencahue y Los Niches (F_ST = 0,00097), entre las cuales se obtuvieron valores significativos a un intervalo de confianza del 95%. Lo mismo ocurrió entre las poblaciones de Pencahue y Molina, con un valor de F_ST = 0,00083. En las seis poblaciones estudiadas se encontró que existen bajos niveles de diferenciación genética, no habiendo diferencias estadísticamente significativas entre todos los pares de poblaciones, a excepción de las comparaciones entre Pencahue y Los Niches y entre Pencahue y Molina (Cuadro 5).

Cuadro 5. Diferenciación genética entre poblaciones (F>ST) (debajo de la diagonal) y distancia geográfica entre pares de poblaciones (km) (sobre la diagonal) de Cydia pomonella. Pruebas significativas para los valores F_ST entre pares de poblaciones fue conducido para 1.000 permutaciones de los datos al azar. El nivel de significancia fue ajustado por el método secuencial de Bonferroni (Sokal y Rohlf, 1995).
Table 5. Genetic differentiation between populations (F_ST) of Cydia pomonella (below diagonal) and geographic distance among population pairs (km) (above diagonal). Significant tests for population pairwise F_ST-values were conducted by 1.000 random permutations of data. The significance level was adjusted by the sequential Bonferroni method (Sokal and Rohlf, 1995).