SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.48 número1Interacción entre bacterias zoonóticas y amebas de vida libre: ¿un nuevo ángulo de un poliedro epidemiológico de importancia en salud pública?Enfermedades abortigénicas en lecherías de la Provincia de Nuble: prevalencia y análisis espacial índice de autoresíndice de assuntospesquisa de artigos
Home Pagelista alfabética de periódicos  

Serviços Personalizados

Journal

Artigo

Indicadores

Links relacionados

  • Em processo de indexaçãoCitado por Google
  • Não possue artigos similaresSimilares em SciELO
  • Em processo de indexaçãoSimilares em Google

Compartilhar


Archivos de medicina veterinaria

versão impressa ISSN 0301-732X

Arch. med. vet. vol.48 no.1 Valdivia  2016

http://dx.doi.org/10.4067/S0301-732X2016000100002 

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Diversidad genética al interior de los núcleos reproductivos de las razas pesadas del Plan Nacional de Fomento Equino basado en el análisis de loci microsatélites

Genetic diversity analysis in the reproductive nuclei of heavy breeds of the National Equine Promotion Plan by using microsatellite loci

 

A Ramírez-Revecoa*, R Hartleya,f, M Ortizb, O Ulloac,d, I Núñezd,e

a Laboratorio de Criobiología y Análisis de Funcionalidad Espermática, Instituto de Ciencia Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
b Laboratorio de Marcadores Moleculares, CIA-CENEREMA, Facultad de Ciencias Veterinarias,Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
c Haras Militar Pupunahue, Los Lagos, Chile.
d DGFER, Ejército de Chile, Santiago, Chile.
e Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Santiago, Chile.
f
Programa Doctorado en Ciencias Mención Biología Celular y Molecular Aplicada, Universidad de la Frontera, Temuco, Chile.
# Fondo de Fomento al Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDEF)
D08I1076
* alfredoramirez@uach.cl


SUMMARY

In Chile, the National Equine Promotion Plan for Agriculture (PNFE) aims to generate Chilean draft horses through absorbent crosses between native crossbred mares and fine heavy draft stallions belonging to the Chilean Army. The goal of this study was to characterise by microsatellite DNA analysis the genetic variability within the purebred core: Ardenés (20), Bretón (23) and Percheron (20). The individuals were analysed using 16 microsatellite locus (VHL20, HTG4, AHT4, HMS7, HTG6, AHT5, HMS6, ASB23, ASB2, HTG10, HTG7, HMS3, HMS2, ASB17, HMS1 and CA425). Molecular genotyping showed that the total number of alleles for several locus varied from 1 to 7; 3-6 and 2-7, according to each breed, with an average of 4.3; 4.8; 4.8 alleles per locus for the Ardennes, Breton and Percheron, respectively. Mean values of observed heterozygosity (Ho) were 0.63; 0.72 and 0.64 for each race, respectively. In all three cases, the mean observed heterozygosity was higher than expected heterozygosity (He) and Nei index. Heterozygosity and fixation index analysis revealed that the three cores showed a low level of inbreeding.

Key words: PNFE, equine, genetic variability, heterozigosity, microsatellite.


RESUMEN

El Plan Nacional de Fomento Equino para la Agricultura (PNFE) tiene el propósito de generar caballos chilenos de tiro por medio de cruzamientos absorbentes de hembras mestizas criollas con sementales finos de tiro pesado pertenecientes al Ejército de Chile. El objetivo de este estudio fue caracterizar, mediante uso de ADN microsatélites, la variabilidad genética al interior de los núcleos reproductivos finos de las razas Ardenés, Bretón de Montaña y Percherón. Se analizaron 20, 23 y 20 ejemplares mediante el uso de 16 locus de microsatélites (VHL20, HTG4, AHT4, HMS7, HTG6, AHT5, HMS6, ASB23, ASB2, HTG10, HTG7, HMS3, HMS2, ASB17, HMS1 y CA425). El genotipado molecular evidenció que el número total de alelos por locus varió de 1 a 7; 3 a 6 y 2 a 7, con un promedio de 4,3; 4,8; 4,8 alelos por locus para las razas Ardenés, Bretón y Percherón. Además, los valores medios de heterocigosidad observada (Ho) fueron de 0,63; 0,72 y 0,64 para cada raza; en los tres casos el valor medio de la heterocigosidad observada fue mayor que la esperada y que el índice de Nei. El análisis de heterocigosidad e índice de fijación revela que los tres núcleos no presentan déficit de heterocigosidad, indicando un bajo nivel de endogamia.

Palabras clave: PNFE, equinos, variabilidad genética, heterocigosidad, microsatélites.


 

INTRODUCCIÓN

Todos los años el PNFE despliega estaciones de monta y remonta (de 18 a 24) entre la VI y XIV Regiones del centro y sur de Chile. Recientemente, en la temporada reproductiva 2012-13 se logró servir 927 yeguas, dicha capacidad de cobertura está limitada por el número de reproductores del PNFE, el que a su vez está directamente relacionado con la calidad y estado genético de los núcleos reproductivos finos que mantiene el Ejército de Chile. Los reproductores desplegados son sementales inscritos en los registros de razas Ardenés, Bretón y Percherón. La raza Ardenés se originó en la frontera entre Francia y Bélgica, aunque se considera francesa. Es un caballo de tiro pesado, que se cree desciende del caballo prehistórico de Solutré y que era muy apreciado por los romanos. El Ardenés se creó para trabajos duros, lo que es obvio en todos los aspectos de su conformación, tiene buen carácter y es obediente, su alzada oscila entre 1,52-1,62 m (Fitzpatrick 2007). La raza Bretón se originó en la región francesa de Bretaña, al noreste del país. El estándar de raza se formó hace poco, pero la historia de su creación se remonta hace 4000 años, cuando los arios introdujeron ganado asiático en Europa. En Bretaña, el clima exigente y la mala tierra condicionaron la adaptación de los caballos autóctonos al entorno, el resultado fue un caballo muy vigoroso y longevo. Los tres tipos de Bretón son de carácter estable y dispuestos para el trabajo. Son extremadamente resistentes y tienen mucha energía, lo que les hace fáciles de mantener, su alzada oscila entre 1,65-1,79 m (Fitzpatrick 2007). El Percherón procede de La Perche, Normandía, norte de Francia. La raza es antigua; se remonta al año 732, cuando se dejó que los caballos árabes abandonados por los sarracenos tras su derrota en la batalla de Poitiers se cruzaran con yeguas pesadas de la región, surgiendo el Percherón. El caballo Percherón es elegante, de excelente temperamento, tranquilo, fácil de manejar y tiene una aguda inteligencia, su alzada oscila entre 1,65-1,80 m (Fitzpatrick 2007). En la figura 1 se muestran 3 reproductores del PNFE, cada uno representativo de cada raza.

 


Figura 1. Fotografías de tres reproductores pertenecientes al
núcleo reproductivo de equinos de tiro pesado del PNFE. Ardenés
(A), Bretón (B) y Percherón (C).
Pictures of three stallions belonging to the PNFE reproductive
core of heavy draft horses. Ardennes (A), Breton (B) and Percheron (C).

 

Los STR (por Short Tandem Repeat) o microsatélites, son una clase de marcadores genéticos comúnmente usados en estudios poblacionales y de control de parentesco (Fornal y col 2013). Los microsatélites se caracterizan por tener herencia mendeliana y codominante, ser frecuentes en el genoma y estar repartidos por todo él, además de ser muy polimórficos. Por lo demás, debido a su pequeño tamaño son eficientemente amplificados mediante uso de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) seguida de electroforesis. La mayoría de los microsatélites son informativos debido a su alto grado de polimorfismo y son usados en pruebas de paternidad en equinos (Marklund y col 1994, Lee and Cho 2006). Además, los marcadores de ADN pueden ser usados para examinar la estructura genética de una población, el nivel de endogamia, homocigosidad, distancia génica entre poblaciones o razas, planeamiento y manejo reproductivo o bien para el estudio y diseño de programas de preservación genética (Jozsa y col 2005). El objetivo de este trabajo fue determinar, de manera descriptiva, la variabilidad genética e índices de consanguinidad existentes en los tres núcleos reproductivos finos del PNFE. El análisis se basó en el uso de 16 marcadores microsatélites, estos fueron evaluados mediante PCR-multiplex y electroforesis capilar fluorescente. Se reportan los análisis por raza y por marcador al interior de cada núcleo reproductivo de: heterocigosidad observada (Ho), esperada (He), índice de Nei, índice de fijación (FIS), número promedio de alelos por locus (NA), contenido de información polimórfica (PIC) y riqueza alélica.

MATERIAL Y MÉTODOS

RAZAS Y MUESTREO

Sesenta y tres ejemplares fueron utilizados, de ellos 20 correspondieron a la raza Ardenés, 23 a la Bretón y 20 a la Percherón. A todos los animales se les extrajeron entre 20-40 folículos pilosos, los que fueron catalogados y mantenidos a T° ambiente hasta su envío al Laboratorio de Marcadores Moleculares del CIA-CENEREMA de la Universidad Austral de Chile.

EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO

A partir de cada muestra se seleccionaron 5-7 pelos que presentasen un folículo piloso visible. Dichos pelos se cortaron a 1 cm del bulbo. Estas muestras se dispusieron en un tubo Eppendorf de 1,7 mL, al que se le agregó 200 μL de solución al 5% de Chelex 100 y 1,0 μL de proteinasa K (20 mg/mL). Las muestras se incubaron a 56 °C toda la noche en un horno de cultivo (WTC Binder), y luego por 8 min a 95 °C, para inactivación de proteasas. Para separar el ADN genómico y eliminar impurezas de las muestras, el homogenizado fue centrifugado a 14.000 x g, por 2 minutos.

GENOTIPADO MOLECULAR

El genotipado consideró los 16 microsatélites recomendados por el Comité de Estandarización de Genética Equina de la Sociedad Internacional de Genética Animal (ISAG) para pruebas de paternidad y caracterización equina. Los marcadores analizados fueron los siguientes: VHL20 (van Haeringer y col 1994); HTG4, HTG6, HTG7 y HTG10 (Ellegren y col 1992); AHT4 y AHT5 (Binns y col 1995); HMS1, HMS2, HMS3, HMS6 y HMS7 (Guerin y col 1994); ASB23 (Lear y col 1999); ASB2, ASB17 (Breen y col 1997) y CA425 (Eggleston-Scott y col 1997).

PCR Y ANÁLISIS DE FRAGMENTOS DE AMPLIFICACIÓN

Las muestras fueron analizadas siguiendo un protocolo que consideró una reacción múltiple en un termociclador Geneamp modelo 2720 (Applied Biosystems). En cada reacción de PCR se utilizaron 20 ng de ADN genómico, diluidos a 8 μL y previamente cuantificado en espectro-fotometría UV a 260 nm (Shimadzu UVmini-1240), 100 pM de dNTP, entre 0,1 y 0,3 mM de cadaprimers (16 en total), tampón de PCR 1x y 1U de ampliTaqGold ADN polimerasa (Applied Biosystem). Las condiciones de reacción incluyeron una etapa inicial de desnaturalización del ADN por 10 min a 95 °C, seguida de 30 ciclos de amplificación consistentes en desnaturación por 30 seg a 95 °C, hibridación por 30 seg a 60 °C y elongación por 60 seg a 72 °C, para terminar con una etapa de extensión de 60 min a 72 °C.

De cada muestra amplificada se tomó 1 μL de ADN, al que se le adicionó 0,25 μL Liz 500 Size Estándar (Life Technologies) y 12 μL de formamida. Estos tubos, se sometieron a 95° C por 5 minutos, para posteriormente ser llevados al equipo de análisis de ADN, 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), donde se realizó la electroforesis capilar automatizada. Para el análisis de los fragmentos se utilizó el software Genemapper 4.0, del cual se obtuvo el electroferograma. Aplicando el criterio de asignación de genotipos según nomenclatura recomendada por la ISAG, se determinaron los genotipos presentes en cada uno de los locus de cada animal. En la figura 2 se muestra un electroferograma representativo de los análisis de microsatélites realizados.

 


Figura 2. Electroferograma representativo de microsatelites amplificados mediante PCR múltiple.
Representative electropherogram of multiplex PCR-amplified microsatellites.

 

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

El análisis de frecuencias alélicas, heterocigosidad observada y esperada y el índice de Nei fueron realizados con el programa POPGENE32 versión 1.31 (Yeh y col 1999). El Índice de Fijación o Coeficiente de endogamia (FIS) fue calculado con el programa GenAlEx 6.5 (Peakell and Smouse 2012). El Contenido de Información Polimórfica (PIC) fue determinado con el programa PICcalc (Nagy y col 2012).

RESULTADOS

La frecuencia alélica para cada microsatélite y para cada raza son presentados en el cuadro 1. Los valores de heterocigosidad observada y esperada, coeficiente de Nei, índice de fijación, número de alelos promedio, contenido de información polimórfica y riqueza alélica por locus son mostrados en el cuadro 2 y sus promedios finales por raza son mostrados en el cuadro 3.

 

Cuadro 1. Frecuencias alélicas de las razas Ardenés (AR), Bretón (BR) y Percherón
(PER) al interior de los núcleos reproductivos del PNFE.
Allelic frequencies of the Ardennes (AR), Breton (BR) and Percheron (PER) breeds in the
PNFE reproductive nuclei.

 

Cuadro 2. Heterocigosidad observada (Ho), esperada (He), índice de fijación (FIS),
número promedio de alelos por locus (NA), contenido de información polimórfica (PIC) y riqueza
alélica (NA) por locus de las tres razas al interior de los núcleos reproductivos del PNFE.
Observed heterozygosity (Ho) Expected (He), Fixation index (FIS), mean number of alleles
per locus (NA), Polymorphic Information Content (PIC) and Allelic Richness (AR) per
locus of three breeds into PNFE reproductive nuclei.

 

Cuadro 3. Tamaño de la muestra, heterocigosidad observada (Ho), esperada (He), índice
de Nei, índice de fijación (FIS), número promedio de alelos por locus (NA), contenido de
información polimórfica (PIC) y riqueza alélica (NA) en las tres razas del PNFE. Se muestran
los promedios y error estándar (Media ± SE).
Sample size, Observed Heterozygosity (Ho) Expected (He), Nei Index, Fixation Index (FIs),
mean number of alleles per locus (NA), Polymorphic Information Content (PIC) and
Allelic Richness (AR) for three PNFE breeds. Means and standard errors (Mean ± SE) are shown.

 

El número total de alelos para las razas Ardenés, Bretón y Percherón fue de 69, 77 y 78. Los loci que presentaron menor polimorfismo (1-3) fueron los siguientes: HTG6 con un alelo en la raza Ardenés, HMS1 y HTG6 con dos alelos en las razas Ardenés y Percherón y HTG7 con tres alelos en la raza Ardenés y HTG6 y HMS6 con igual número de alelos en la raza Bretón. En tanto el loci que presentó el mayor grado de polimorfismo fue VHL20 con siete alelos en núcleo Ardenés y Percherón; le siguieron ASB17 con seis alelos en los tres núcleos; AHT5 y HMS2 con seis alelos en los núcleos Bretón y Percherón; VHL2 y HMS3 con seis alelos en los bretones, ATH4 y HTG10 con seis alelos en el núcleo Percherón. El número promedio de alelos obtenido (NA) fue 4,31; 4,81 y 4,87 para los núcleos Ardenés, Bretón y Percherón.

A nivel general, el promedio de contenido de información polimórfica (PIC) por raza fue informativo, con valores de 0,54; 0,59 y 0,58, para las razas Ardenés, Bretón y Percherón. En términos específicos, los marcadores que no resultaron ser informativos (PIC < 0,5) por raza fueron los siguientes: Ardenés (HTG6; HMS2), Bretón HTG4; HTG6) y Percherón (HMS7; HTG6; HMS3 y HMS2). Por su parte, y en el mismo orden, los valores promedio de riqueza alélica (AR) fueron: 0,21; 0,20 y 0,24.

Los valores de heterocigosidad promedio (Ho) obtenidos en orden descendiente fueron 0,72 para los bretones, 0,65 para los percherones y la más baja con 0,63 para el núcleo Ardenés. El análisis de heterocigosidad por locus indicó que 4, 3 y 8 marcadores microsatélites presentaron mayor heterocigosidad esperada que observada para las razas Ardenés, Bretón y Percherón (cuadro 2).

Los niveles de heterocigosidad obtenidos mediante índice de Nei, y en orden decreciente, fueron 0,66; 0,62 y 0,59 para las razas Bretón, Percherón y Ardenés. Respecto del índice de fijación (FIS) o nivel de deficiencia de heterocigosidad los resultados observados fueron: -0,030; -0,064 y -0,003, para las razas Ardenés, Bretón y Percherón. Los valores negativos de FIS obtenidos en las tres razas indican que no existe deficiencia de heterocigotos al interior de los planteles y por lo tanto estas aún presentan un bajo nivel de consanguinidad.

DISCUSIÓN

El uso de microsatélites en equinos, como marcadores de polimorfismo genético, ha mostrado ser una valiosa y confiable herramienta tanto para análisis y de registro de parentesco como para los estudios de estructura genética de poblaciones, dentro de los que se destacan los análisis de consanguinidad o endogamia que pueda presentar una población y también los análisis de distancia génica que puedan existir entre poblaciones o razas.

En este estudio el número promedio de alelos obtenido (NA) fue de 4,31; 4,81 y 4,87 para los núcleos Ardenés, Bretón y Percherón (cuadro 3). Estos valores fueron considerablemente más bajos que los reportados en núcleos reproductivos de referencia (Haras Nacionaux, Francia), que reportan 6,09; 6,36 y 6,64 para las mismas razas (Leroy y col 2009).

Por lo demás, los valores de heterocigosidad promedio observada (Ho) obtenidos en las razas Ardenés y Percherón fueron más bajos (0,63 y 0,64) que los reportados en estudios núcleos franceses con 0,66 y 0,69 (Leroy y col 2009). En tanto, el valor de heterocigosidad observada (Ho) obtenida en la raza Bretón fue más alta que la reportada en núcleo de referencia, con 0,72 vs 0,65 (Leroy y col 2009). Además, los valores de heterocigosidad (Ho) observada obtenidos en nuestro estudio son considerablemente más altos que los reportados en una muestra de planteles polacos con valores de: 0,42; 0,38 y 0,40 (Iwanczyk y col 2006).

Al realizar el análisis de heterocigosidad usando el índice de Nei se obtuvieron los siguientes resultados en orden decreciente: 0,66; 0,62 y 0,59 para las razas Bretón, Percherón y Ardenés, se ajustaron mejor a los esperados cuando se compara con los mismos valores de referencia.

Respecto del índice de fijación (FIS) o nivel de deficiencia de heterocigosidad los resultados observados fueron: -0,030; -0,064 y -0,003, para las razas Ardenés, Bretón y Percherón, los que resultaron negativos en las tres razas y más bajos (Ardennes y Bretón) que los reportados por Leroy y col (2009), con 0,08; -0,02 y -0,01 para las tres razas, similares diferencias fueron observadas en el estudio de Pirault y col (2013) en ellos se obtuvieron los siguientes valores: 0,09; -0,02 y -0,18, para las tres razas. Finalmente en otro estudio, aunque menos reciente, Iwanczyk y col (2006), reportan índices de fijación (FIS) también negativos de: -0,02; -0102 y -0,01, para las mismas razas, siendo mayor en el caso de la raza Ardenés, menor en el caso de la Bretón e igual valor en el caso de la Percherón, que los obtenidos en nuestro estudio.

El análisis del índice de fijación no muestra evidencia de la existencia de endogamia al interior de los núcleos reproductivos (FIS negativos). Al contrario, el hecho de que el grado de polimorfismo presentado en cada núcleo (NA), comparado a los valores de referencia (Leroy y col 2009), sea más bajo, sumado el limitado número de individuos presentes en cada grupo (< 22 en c/u) y las cada vez más bajas posibilidades de proyectar cruzamientos no consanguíneos, sugieren que los niveles de consanguinidad se incrementarán de manera importante en las próximas generaciones, sin el ingreso de nueva genética.

Finalmente, la información y resultados obtenidos, constituyen una línea base sobre la que se podrá evaluar, de manera dinámica, la variabilidad genética al interior de los núcleos genéticos, derivada del manejo reproductivo del Haras Militar Pupunahue y de los eventos de flujo génico, ya sea por ingreso de nuevos ejemplares o la importación de semen o embriones de las respectivas razas.

AGRADECIMIENTOS

Especiales agradecimientos a todos los oficiales y personal militar de la DGFER por la colaboración recibida en la toma, registro y envío de las muestras al Laboratorio.

 

REFERENCIAS

Breen M, G Lindgren, MN Binns, J Norman, Z Irvin, K Bell, K Sandberg, H Ellegren. 1997. Genetical and physical assignments of equine microsatellites-First integration of anchored markers in horse genome mapping. Mammalian Genome 8, 267-273.         [ Links ]

Binns MM, NG Holmes, A Holliman, AM Scott. 1995. The identification of polymorphic microsatellite loci in the horse and their use in thoroughbred parentage testing. Brit Vet J 151, 9-15.         [ Links ]

Eggleston-Stott ML, A Delvalle, M Bautista, S Dileanis, E Wictum, AT Bowling. 1997. Nine equine dinucleotide repeats at microsatellite loci UCDEQ136, UCDEQ405, UCDEQ412, UCDEQ425, UCDEQ437, UCDEQ467, UCDEQ487, UCDEQ502 and UCDEQ505. Anim Genet 28, 370-371.         [ Links ]

Ellegren H, M Johansson, K Sandberg, L Andersson. 1992. Cloning of highly polymorphic microsatellites in the horse. Anim Genet 23, 132-133.         [ Links ]

Fitzpatrick A. 2008. Guía Completa de razas de caballos. 2da ed. Lisma Ediciones, Barcelona, España.         [ Links ]

Fornal A, A Radko, A Piestrzynska-Kajtoch. 2013. Genetic polymorphism
of Hucul horse population based on 17 microsatellite loci. Acta Biochim Pol 60, 761-765.         [ Links ]

Guérin G, M Bertaud, Y Amigues. 1994. Characterization of seven new horse microsatellites: HMS1, HMS2, HMS3, HMS5, HMS6, HMS7 and HMS8. Anim Gen 25, 62.         [ Links ]

Iwañczyk E, R Juras, G Cholewiñski, EG Cothran. 2006. Genetic structure and phylogenetic relationships of the Polish Heavy Horse. J Appl Genet 47, 353-359.         [ Links ]

Józsa C, B Bán, S Mihók, I Bodó. 2005. DNA microsatellite test of Hutsul horses in Hungary. EAAP 56th Annual Meeting, 5-8 June, Uppsala, Sweden.         [ Links ]

Lee S, G Cho. 2006. Parentage testing of Thoroughbred horse in Korea using microsatellite DNA typing. J Vet Sc 7, 63-67.         [ Links ]

Leroy G, L Calléde, E Verrier, JC Mériaux, A Ricard, C Danchin-Burge, X Rognon. 2009. Genetic diversity of a large set of horse breeds raised in France assessed by Microsatellite polymorphism Genetics Selection Evolution 41, 5.         [ Links ]

Marklund S, H Ellegren, S Eriksson, K Sandberg, L Andersson. 1994. Parentage testing and linkage analysis in the horse using a set of highly polymorphic microsatellites. Anim Genet 25, 19-23.         [ Links ]

Nagy S, P Poczai, I Cernák, AM Gorji, G Hegedüs, J Taller. 2012. PICcalc: an online program to calculate polymorphic information content for molecular genetic studies. Biochemical Genetics 50, 670-672.         [ Links ]

Peakall R, PE Smouse. 2012. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research-an update. Bioinformatics 28, 2537-2539.         [ Links ]

Pirault P, S Danvy, E Verrier, G Leroy. 2013. Genetic Structure and  Gene Flows within Horses: A Genealogical Study at the French Population Scale. PLoS ONE 8, e61544.         [ Links ]

Van Haeringen H, AT Bowling, JA Lenstra, KA Zwaagstra, ML Stott.  1994. A highly polymorphic horse microsatellite locus VHL20.  Anim Genet 25, 207.         [ Links ]

Yeh FC, R Yang, T Boyle. 1999. POPGENE, Microsoft Window-based  Freeware for Population Genetic Analysis. Version 1.31, University  of Alberta, Edmonton, Canada.         [ Links ]


Aceptado: 08.07.2015

Creative Commons License Todo o conteúdo deste periódico, exceto onde está identificado, está licenciado sob uma Licença Creative Commons