Rev Méd Chile 2009; 137: 377-382

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

 

Detección y tipificación de virus papiloma humano en adenocarcinoma de cuello uterino mediante reverse line blot, Región de La Araucanía, Chile

Detection and genotyping of human papillomavirus in biopsies of uterine cervical adenocarcinoma

 

Priscilla Brebi M^1a, Carmen Gloria Ili G^1a, Jaime López M^1a, Patricia García M^1a, Angélica Melo A^1b, Sonia Montenegro H^1,3c, Pamela Leal R^1,4d, Pablo Guzmán G², Juan Carlos Roa S^1,2.

¹ Laboratorio de Patología Molecular, Departamento Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.
² Unidad de Anatomía Patológica-Citología, Hospital Dr. Hernán Henríquez Aravena, Temuco, Chile.
³ Departamento de Especialidades, Facultad de Medicina, Universidad de Concepción, Concepción, Chile.
^a Estudiante Programa de Doctorado en Ciencias Mención Biología Celular y Molecular Aplicada, Universidad de La Frontera.
^b Tecnólogo Médico
^c Médico Veterinario. Doctor en Biología Molecular
^d Ingeniero Agrónomo. Doctor en Biología Celular y Molecular Aplicada

Dirección para correspondencia

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Background: The genotyping of Human Papillomavirus (HPV) will improve knowledge about the local epidemiological association of this virus with adenocarcinoma. Aim: To determine the frequency of HPV genotypes in biopsies of women with uterine cervical adenocarcinoma in a geographic region of Chile. Materials and Methods: Forty-one cervical biopsies with a pathological diagnosis of adenocarcinoma, corresponding to all women diagnosed with this cancer between 2002 and 2004, were analyzed. Viral gene Ll was amplified by PCRfor viral detection. HPV genotyping was carried out by a Reverse Line Blot technique. Results: Seventy one percent of biopsies were positive for HPV. The most common genotypes found were HPV 16 (61%), followed by HPV 18 (19.5%). Eighty seven percent of biopsies had a single HPV infection. Three patients had a multiple HPV infection. All of the latter were infected by HPV 16, associated with other three viral genotypes (45, 52 and 66). No low-risk HPV genotypes were found. Conclusions: In this sample of biopsies, there was a high prevelence of HPV 16 and a low prevalence of HPV 18, which historically has been related to adenocarcinoma. The genotypes found correspond to those described in South America.

(Key words: Genotype; Human papilloma virus; Uterine cervical neoplasms)

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El cancer cervicouterino (CCU) es la segunda neoplasia maligna más frecuente en mujeres y la quinta causa de muerte por cancer a nivel mundial¹. Anualmente se diagnostican más de 450.000 casos, con un cuarto de millón de muertes por esta causa². El 80% de las mujeres afectadas pertenecen a países en vías de desarrollo¹.

En Chile el CCU ocupa el cuarto lugar dentro de las neoplasias malignas que afectan a la población femenina³, siendo la causa de muerte más frecuente entre mujeres de 35 y 54 años⁴. Según datos del Ministerio de Salud en 2005, la incidencia de CCU en Chile es de 18,7 casos por 100.000 mujeres de las cuales fallecen alrededor de 700, siendo la tasa de mortalidad de 8,3 por 100.000 mujeres⁵. En la Región de La Araucanía, constituye la tercera causa de muerte por cáncer, desplazando al cancer de mama al cuarto lugar³.

El CCU puede clasificarse en dos tipos dependiendo del epitelio cervical afectado. El tipo escamoso o epidermoide (SSC) es el más frecuente y se encuentra en 90% de los casos. El adenocarcinoma (ACC), que afecta al epitelio glandular del cérvix y corresponde aproximadamente a 10% de los CCU⁶. Actualmente, la frecuencia del ACC ha ido en aumento desde 5% hasta 34% en algunos países⁷. Este hecho se relaciona con la mayor frecuencia de infecciones genitales por virus papiloma humano (HPV), sumado a otros factores como tratamiento anticonceptivo oral y tabaquismo⁸.

El rol del HPV en el desanollo del CCU se encuentra bien establecido^9,10, habiéndose acreditado su participación hasta en 99,7% de los casos^8,11.

Se han descrito más de 200 tipos virales de HPV de los cuales aproximadamente 40 presentan tropismo por el área anogenital y mucosas, los que pueden ser agrupados en HPV de alto riesgo y bajo riesgo oncogénico dependiendo de su asociación con lesiones de alto grado o carcinomas invasores¹². Los HPV de bajo riesgo incluyen los tipos 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 6l, 72 y 81 entre los más frecuentes. De ellos los más importantes son los tipos 6 y 11 que producen principalmente condilomas tanto en hombres y mujeres^8,13. Los HPV de alto riesgo que han sido considerados con potencial oncogénico son los tipos 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73 y 82 por su presencia en lesiones de alto grado y carcinomas. El genotipo más importante y frecuente en el CCU es el HPV 16^8,13.

Se ha observado en algunas regiones geográficas como en Asia-Pacífico, una mayor prevalencia de HPV 18 en ACC, principalmente en mujeres jóvenes¹⁴. Sin embargo, diversos estudios realizados en Norteamérica, Sudamérica y algunos países de Europa, han demostrado una mayor incidencia de HPV 16. Ambos genotipos son causantes de aproximadamente de 85% de los casos de ACC¹⁵. En Chile son reducidos los datos sobre la epidemiología del HPV y su asociación con el desarrollo de lesiones neoplásicas del cuello uterino, no existiendo publicaciones en el país sobre ACC. Existen diversas metodologías para la detección y tipificación de HPV, entre las cuales destacan Southern blot, hibridación Dot Blot, secuenciación y enzimoinmunoensayo, captura híbrida, reverse Une blot (RLB), enzimas de restricción (PCR-RLFP) y PCR en tiempo real^16-19. RLB es una técnica eficiente, eficaz y económica, siendo capaz de identificar simultáneamente hasta 38 genotipos diferentes. Además es mucho más sensible y específica que las técnicas realizadas mediante enzimas de restricción y dot-blot²⁰.

La alta tasa de infección por HPV, principalmente en la adolescencia¹³ y su indiscutible asociación con el desarrollo de CCU llevó a la necesidad de crear vacunas como metodología de prevención primaria. Actualmente, a nivel mundial existen 2 vacunas en el mercado. Ambas incluyen los tipos virales más frecuentes en CCU como son HPV 16 y 18²¹. Además estas vacunas presentan reactividad cruzada incompleta con los genotipos virales de alto riesgo oncogénico HPV 31 y 45^22-24.

En consideración con lo expuesto anteriormente se ha propuesto como objetivo determinar la frecuencia de genotipos de HPV en muestras de biopsias de mujeres con diagnóstico de ACC en la región de La Araucanía.

MATERIAL Y MÉTODO

Muestras. Se seleccionaron 41 biopsias de cuello uterino (muestras de archivo fijadas en formalina e incluidas en parafina), con diagnóstico histopatológico de adenocarcinoma en la Unidad de Anatomía Patológica - Citología del Hospital Hernán Henríquez Aravena de Temuco, Chile. Cabe mencionar que estas muestras corresponden al total de mujeres con diagnóstico de adenocarcinoma de la región de La Araucanía que consultaron el Policlínico de Patología Cervical entre los años 2002 y 2004. Este estudio fue autorizado por el Comité de Ética del Servicio de Salud de la Región de La Araucanía.

Extracción ADN. Manualmente, se microdisecaron 8 cortes de 7 mieras de cada caso, de acuerdo al área señalada en la placa teñida con hematoxilina-eosina (HE). El tejido fue digerido en buffer de lisis con proteinasa K (1 mg/mL). Se precipitó el ADN con isopropanol y finalmente se hidrato para su almacenamiento a -20^oC hasta su análisis²⁵.

PCR beta globina. Todas las muestras fueron sometidas a un PCR simple para el gen de la beta globina para evaluar la calidad del ADN extraído y excluir así las muestras con ADN degradado o no amplificable¹⁶.

Controles para PCR. Como control negativo del PCR específico para HPV se empleó ADN genómico humano (Promega) y como blanco se utilizó mezcla de PCR sin ADN. Como controles positivos para HPV se emplearon plásmidos recombinantes solicitados al ATCC (American Type Culture Collection), probados previamente en diluciones de 100, 50, 10 y 5 pmol/ µL, para determinar la sensibilidad del método.

Detección de HPV. Se realizó mediante PCR con los partidores GP5+ y GP6+biotinilado, los que permiten amplificar un fragmento de 150 pb del gen Ll del virus y detectar una amplia gama de tipos de HPV, tanto de alto riesgo (16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73 y 82 subtipos IS39 y W13B/MM4), como de bajo riesgo (6, 11, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 57, 6l, 71, 72, 81, 83, 84 y CP6108)^20,26. Tipificación de HPV. Los productos de PCR biotinilados fueron sometidos a la técnica de Reverse Line Blot (RLB). Este método permite la hibridación no radiactiva de los productos de PCR biotinilados con diferentes sondas de oligonucleótidos (basadas en lo descrito por Snijders 2006)^26,27, utilizando un sistema de Miniblotter. Las oligosondas complementarias a cada upo viral (HPV 6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 6l, 66, 68, 70, 71, 72, 73, 81, 82 y 83, conteniendo un grupo amino en el extremo 5') son unidas en forma covalente a una membrana de nylon cargada negativamente. Después de unir las sondas, la membrana se gira 90° en el Miniblotter. Las ranuras del Miniblotter, ahora perpendiculares a las líneas de las sondas, son llenadas con productos de PCR marcados con biotina. La hibridación tiene lugar en el Miniblotter y se visualiza usando streptavidina marcada con peroxida-sa, que interactúa con el producto de PCR biotinilado, seguido por detección quirnioluminiscente mediante autonadiografía. Como control positivo de RLB se utilizó una mezcla de los productos de PCR de plásmidos de HPV. Como control negativo se usó el producto de PCR de ADN genómico y como blanco mezcla de PCR sin ADN (Figura 1)^20,26.

RESULTADOS

La detección del HPV se realizó en 41 muestras individuales con diagnóstico histopatológico de ACC. La edad de las pacientes fluctuó entre 24 y 78 años, con un promedio de 48 años. De las mujeres en estudio, 26,8% tenían edad entre 24-40 años, 51,2% entre 41-60 y 22,0% sobre 60 años de edad.

Detección de HPV. Todos los casos estudiados fueron positivos para beta globina, por lo tanto, no hubo exclusión de muestras del estudio debido a calidad del ADN, procediendo posteriormente a realizar PCR del gen viral L1, obteniéndose 29 muestras positivas (70,7%) y 12 negativas (29,3%) para HPV (Tabla 1).

Tipificación de HPV. Los genotipos de HPV encontrados en las muestras de ACC fueron: HPV 16 (61,0%), HPV 18 (19,5%), HPV 45, 52 y 66 (2,4% cada uno) (Tabla 1).

Del total de los casos positivos para HPV 86,2% (61,0% del total) correspondieron a casos de infección única (IU), es decir, por solo un tipo viral y 13,8% restante (9,8% del total) fueron casos de infección por múltiples tipos virales (IM) (Tabla 1). Los resultados de la tipificación viral en las IU evidencian una frecuencia de HPV 16 de 84,0%, conespondiendo a más de 50,0% del total de los casos estudiados, seguido por HPV 18 con 16,0% de estos casos. Las IM registraron, además de los HPV 16 y 18, tres genotipos virales distintos, los HPV 45, 52 y 66 (Tabla 2).

DISCUSIÓN

El rol carcinogénico del HPV en el carcinoma escamoso del cuello uterino se encuentra bien descrito en la literatura^9,10,12,16, no así su rol en la patogenia del ACC, debido a la baja frecuencia de este tipo dentro de la totalidad de las clases de CCU^7,28. En este estudio se analizaron muestras de biopsias de pacientes de la Región de La Araucanía, con ACC de cuello uterino. Entre las edades de 35 y 55 años se obtuvo un mayor número de mujeres infectadas (56,09%), lo cual se conelaciona con lo descrito por otros autores⁴. Se confirma una alta asociación entre ACC y HPV que alcanza 70,7%, coincidiendo con lo reportado por otros autores^7,15,28,29. Sin embargo, este porcentaje de positividad es levemente inferior pero no estadísticamente significativo a lo observado en otras publicaciones, donde alrededor de 80% de las muestras presentaban infección por HPV^7,29-31. Esto se debería a dos posibles causas: primero en el material de archivo, existe una degradación del ADN viral durante los procesos de fijación en formalina, lo que dificulta su amplificación^32,33 y segundo a que en ACC, debido a que se trata de un epitelio glandular, existe una mayor integración viral, lo que genera un bajo porcentaje de ADN viral en forma episomal, el cual es detectable más eficientemente por técnicas de biología molecular²⁸-³².

El HPV 16 ha sido identificado como el genotipo viral más común en carcinoma escamoso del cuello uterino, mientras que HPV 18 se ha relacionado más a ACC y a carcinoma adenoescamoso especialmente en países del Asia-Pacifico^18,34,35. Sin embargo, otros autores registraron una mayor prevalencia de HPV 16 en casos de ACC tanto en Norteamérica, América Latina y Escocia, respectivamente, coincidiendo con los datos obtenidos en el presente estudio, donde se encontró este genotipo viral en 51,2% de las infecciones únicas y en todos los casos de infección múltiple^31-33.

En lugares como África, Asia, Europa y Suda-mérica, se menciona una mayor frecuencia de HPV 16, coincidiendo con lo descrito por Trottier, Ferreccio, Muñoz, Clifford entre otros^{4,13,18,36,37}. Según lo descrito por Muñoz y Bosch en 1999, el genotipo 16 es además el más frecuente en todos los países de Europa, América del Norte, Centro-américa y América del Sur, África y Asia Sudoriental³⁸. Esto a excepción de Indonesia, donde el tipo 18 es el más común. La distribución de los genotipos virales registrados es similar a lo observado en otros países de Sudamérica como Perú, Brasil, Colombia y Paraguay³¹.

La técnica Reverse Line Blot utilizada para la tipificación de los genotipos virales, presenta ventajas, entre las cuales se destaca que permite discriminar entre HPV de alto y bajo riesgo oncogénico, en forma específica, permitiendo llevar a cabo un estudio de buena calidad experimental^20,27. En este estudio sólo se registraron HPV de alto riesgo oncogénico. La ausencia de genotipos de bajo riesgo oncogénico incluso en las infecciones múltiples podría indicar una ventaja competitiva de los virus de alto riesgo, prevaleciendo debido a su mejor capacidad de integración genómica en la célula huésped y confirma su alto potencial carcinogénico en esta neoplasia^8,12. Los genotipos detectados en ACC, son similares a los descritos por otros autores, prevaleciendo HPV 16 y 18 los cuales concuerdan con las altas tasas de frecuencia de ambos tipos virales alrededor del mundo. Asimismo estos resultados indican que la vacunación profiláctica contra la infección por HPV prevendría también el desarrollo de CCU y de la mayoría de los adenocarcinomas en la población chilena^30,33.

Agradecimientos

Los autores agradecemos a la Unidad de Anatomía Patológica-Citología, Hospital Dr. Hernán Henríquez Aravena, Temuco por su apoyo en la recolección de muestras. Además, a la Dra. María Alejandra Picconi, por su ayuda en la recopilación de información.

 

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Recibido el 24 de junio, 2008. Aceptado el 15 de diciembre, 2008.

Trabajo financiado por proyecto DIUFRO DI08-0076 y CORFO INNOVA 07CNI3PBT-222.

Correspondencia a: Dr. Juan Carlos Roa S. Departamento de Patología, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera. Manuel Montt 112. Código Postal 478-1176. Temuco, Chile. Fono: 045-325729. Fax: 045-296530. E mail: jcroa@ufro.cl