Rev Méd Chile 2009; 137: 321-328

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

 

Polimorfismo +49 A/G del gen del antígeno 4 del linfocito T citotóxico (CTLA-4) en la diabetes tipo 1: Asociación con el perfil de anticuerpos y citoquinas

+49 A/G genetic polymorphism of cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 (CTLA-4) in type 7 diabetes: Association with autoantibodies and cytokines

 

Francisco Pérez B¹, Ethel Codner D², Bárbara Ángel B¹, Iván Balic N^1a, Elena Carrasco P^3b.

² Laboratorio de Epidemiología Nutricional, Genética y Salud Pública. Instituto de Nutrición y Tecnología de los Alimentos (INTA), Universidad de Chile.
² Instituto de Investigaciones Materno Infantil (IDIMI), Universidad de Chile.
³ Unidad de Diabetes, Hospital San Juan de Dios, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. Santiago de Chile
^aBiotecnólogo
^bNutricionista

Dirección para correspondencia

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Background: Cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 (CTLA-4) has been one ofthe non HLA genes more commonly studied in type 1 diabetes mellitus (TID). CTLA-4 is a co-stimulation protein that has a key role in the negative regulation ofT cells and is related with a functional cytokine imbalance, generating a T helper (Th) 1 over Th2 dominance. Aim: To analyze the association of +49 A/G polymorphism of CTLA-4 and its relationship with autoantibodies and cytokine expression in recently diagnosed TID patients. Patients and Methods: CTLA-4 genetic variants and auto-antibody levéis were studied in 260 chiídren with TID and 255 healthy chiídren matched by age and gender +49 A/G polymorphism of CTLA-4 was studied by polymerase chain reaction and restriction fragmentpolymorphism (PCR-RFLP). Autoantibody levéis were measured by conventional ELISA. A panel of60 cytokines was studied simultaneously by serum array analysis in 15 TID and 15 healthy controls stratified according CTLA-4 genotype. Results: The +49 A/G genetic frequency was similar in TID cases and healthy chiídren. A positive anti-GAD65 and anti-IA-2 level was observed in 673% of TID group. This percentage was increased among GG carriers (79.4% to GAD65 and 70.6% to IA-2). Finally, TID patients carrying this genotype showed a high expression of interleukin 2, 10, tumor necrosis factor alpha and interferon gamma. Conclusions: The +49 A/G polymorphism of CTLA-4 was similar in diabetic and control chiídren. Among patients with TID and carriers of GG genotype, a higher frequency of anti-GAD65 and a preferential Thl cytokine expression profile was observed.

(Key words: CTLA-4 antigen; Cytokines; Diabetes Mellitus, type 1)

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La diabetes mellitus tipo 1 (DM1) es una enfermedad autoimmune, órgano-específica que se caracteriza por la destrucción de las células fi pancreáticas a través de mecanismos de necrosis o apoptosis mediado por células T reactivas^1-4. Su etiología es compleja y en ella se han involucrado factores genéticos y ambientales como participantes directos en el proceso inmunológico de destrucción celular^5-8. Desde el punto de vista genético, existe una gran diversidad de genes que se han relacionado a la enfermedad, comenzando desde las clásicas asociaciones con el sistema HLA, hasta recientes proteínas asociadas a la actividad y funcionalidad de las células T^9-10. Dentro de los genes candidatos estudiados se encuentra la región denominada IDDM12 localizada en el cromosoma 2q3, que codifica para regiones claves en la regulación del linfocito T, entre ellas el gen del antígeno 4 del linfocito T citotóxico (C7L4-4)^11-13.

El gen de CTLA-4 contiene cuatro exones y diversos sitios poµMórficos que se han relacionado con patologías de origen autoinmune¹¹. El gen de CTLA-4 ha sido propuesto desde hace varios años como un gen candidato en diversas enfermedades autoinmunes entre ellas la enfermedad de Addison, enfermedad celíaca y la tiroiditis autoinmune^14-17. El poµMorfismo +49 A/G del gen CTLA-4 ha sido asociado positivamente a DM1 en diversas poblaciones de países como Rusia, Polonia, España, Italia, Alemania y Bélgica^18-23. Sin embargo, también existe una serie de publicaciones en población japonesa, Reino Unido y Estados Unidos de Norteamérica que no muestran el mismo grado de asociación^24-26.

El poµMorfismo +49 A/G del gen CTLA-4 ha sido intensamente estudiado desde el punto de vista de su impacto sobre características de la DM1, de este modo la presencia del alelo G ha mostrado un importante grado de asociación con una edad más temprana de debut y con perfiles específicos de autoanticuerpos^27-30. Estudios in vitro, han relacionado la presencia del alelo G con bajos niveles de ARN mensajero para la molécula soluble CTLA-4 (sCTLA-4), describiéndose un posible papel funcional en el balance negativo de las células T reactivas^31-32.

En la DM1 el desequilibrio Thl/Th2 es un proceso gravitante mientras se produce el fenómeno de infiltración de células T a nivel pancreático (insulitis). A nivel de mecanismo, tanto las moléculas del complejo HLA, como las moléculas de regulación negativa (CTLA-4; CD95; PD-1) están capacitadas para señalizar al linfocito la inducción de determinadas citoquinas³³. Dentro de las respuestas Thl es posible observar la inducción de TNFα, IL-ß, IL-2 e INFγ, como moléculas con actividad pleiotrópica sobre la célula ß. Thl facilita la respuesta del complejo celular, mientras que Th2 (IL-4, IL-ß) favorece la respuesta de tipo citotóxico. Todas ellas son reguladas por el complejo Th3 el cual ejerce su papel a través de TGFß-1³⁴. Dada la fuerte evidencia que relaciona el importante papel de las citoquinas en la perpetuación de la muerte de la célula ß pancreática, el propósito de este estudio ha sido analizar la distribución del poµMorfismo +49 A/G del gen CTLA-4 en casos con DM1 y niños controles de Santiago y su relación con los autoanticuerpos GAD65 e IA-2 y perfil de citoquinas involucradas en los procesos necróticos o apoptóticos que subyacen a la aparición de la DM1.

PACIENTES Y MÉTODOS

El estudio conesponde a un diseño caso-control realizado en la Región Metropolitana. Los casos incidentes de DM1 conespondieron a niños y adolescentes menores de 15 años con diagnóstico reciente de la enfermedad (definido como evento ocurrido en las 3 semanas previas al ingreso al estudio), provenientes de diversos centros hospitalarios de la Región Metropolitana (Hospitales San Borja-Arriarán, Exe-quiel González Cortés y San Juan de Dios). Un total de 260 pacientes con DM1 (119 niñas y 141 niños) fueron incorporados al estudio. El grupo control estuvo formado por 255 niños aparentemente sanos (138 niñas y 117 niños), sin antecedentes familiares de diabetes u otras enfermedades autoinmunes (datos obtenidos mediante encuesta familiar). Los niños controles fueron contactados de tres colegios de Santiago (comunas de Quinta Normal, Independencia y Macul), se escogieron al azar en un llamado abierto y voluntario realizado en cada colegio por intermedio de los centros de padres respectivos por lo que estimamos que son comparables en términos de su estatus sociogenético respecto de los casos con DM1. En todos los casos y controles se analizó la frecuencia para el poµMorfismo +49 A/G del gen CTLA-4 y un perfil de autoinmunidad compuesto por los anticuerpos GAD65 e IA-2.

En forma paralela al estudio de frecuencias genotí-picas, se seleccionaron 30 niños del grupo total (15 DM1 y 15 niños controles) para realizar un segundo estudio de perfil de citoquinas utilizando un ELISA que determina en forma simultánea un patrón de distribución de 60 citoquinas. Este estudio descriptivo, consideró a los niños portadores de los genotipos GG y AA para el gen de CTLA-4 determinado previamente.

El protocolo de esta investigación fue aprobado por los comités de ética respectivos y todos los pacientes, controles o sus padres o tutores entregaron su consentimiento por escrito.

EXTRACCIÓN DE ADN Y DETERMINACIÓN DEL POLIMORFISMO CTLA-4

El ADN genómico se extrajo a partir de una muestra de sangre periférica (3 mi) utilizando técnicas estándares de lisis celular (Winkler, Santiago, Chile). El poµMorfismo +49 A/G del gen CTLA-4 se determinó mediante la utilización de partidores específicos (forward 5'- GCT-CTACTTCCTGAAGACCT -3' y reverse 5'- AGTCTCAC-TCACCTTTGCAG -3') que identifican la sustitución treonina (GCC) por alanina (ACC) en el codón 17 del exón 1 de CTLA-4. 0,25µg ADN genómico se amplificaron mediante PCR en un volumen total de 25 µl; 50 µM de cada dNTPs (Invitrogen, USA), 2 U de Taq ADN poµMerasa (Invitrogen, USA), 2,5 µl de 10 x PCR buffer, 0,8 µM de cada partidor. Las condiciones de amplificación fueron estandarizadas de la siguiente forma: denaturación inicial a 95°C por 4 min y 40 ciclos de amplificación consistentes en: denaturación a 95°C por 30 s, alineamiento a 56°C por 30 s y extensión a 72°C por 30 s en cada ciclo, con una extensión final en el último ciclo a 72°C durante 10 min; 10 µl de producto amplificado fueron incubados por dos horas a 37°C con 5 µl (2 U/µl) de la enzima de restricción Bbvl (New England Biolabs, UK) y el patrón de restricción fue resuelto en geles de agarosa al 2% con bromuro de etidio.

ANÁLISIS SEROLÓGICO DE ANTICUERPOS

Se realizó un análisis serológico semicuantitativo de anticuerpos anti-GADg₆₅ y anti-IA2 a través de un enzimoinmunoanálisis (ELISA) con las muestras en duplicado (Medizym® Diagnostic, Berlin, Alemania). Ambas determinaciones utilizan un punto de corte de 10 Ul/ml y se obtuvo una sensibilidad y especificidad de 92,3% y 98,6% para anti-GAD65 y de 75% y 98% para anti-IA-2. Todos los valores se encuentran dentro de los rangos esperados para un ELISA de acuerdo al programa DASP (Diabetes Antibody Standardization Programa.

ELISA SIMULTÁNEO DE CITOQULNAS

Para la determinación en forma simultánea de citoquinas se utilizó una matriz comercial para el análisis de 60 proteínas (Ray Bio Human Cytokines Antibody Array 6; Ray Biotech Inc, USA). Esta matriz permite identificar la expresión de múltiples citoquinas en una muestra de plasma o suero. Es un sistema cualitativo que permite detectar concentraciones límites de citoquinas que suelen quedar fuera de rango por sistemas de ELISA convencional (ejemplo valores ≤ 4 pg/ml). La muestra sérica diluida (1:10) se incubó con una membrana de nylon previamente bloqueada, incubándose toda la noche a 4°C. Las membranas se lavaron tres veces luego de la incubación, evitando deshidratación antes de ser expuestas a la mezcla de anticuerpos conjugados con biotina. En una segunda incubación a 4°C durante toda la noche, las membranas fueron reveladas mediante autorradiograma con tiempos de exposición de 3 a 5 minutos. La Figura 1 muestra la matriz utilizada en este análisis (Ray Bio Human Cytokine Antibody Array 6).

Los resultados de expresión de citoquinas obtenidos a través de esta matriz se definieron como: No detectada (ND), Baja Expresión y Alta Expresión luego de la integración de la intensidad densitométrica a partir del registro obtenido en el au torradiograma.

Estadística. Las comparaciones de frecuencia alélicas y genotípicas entre casos y controles fueron analizadas mediante las pruebas de Chi-cuadrado y prueba exacta de Fisher utilizando el programa SHESIS (URL: http://202.120.7.14/analysis/myAnalysis.php). Se evaluó la concordancia de las frecuencias genotípicas con respecto al equilibrio de Hardy-Weinberg mediante la prueba exacta de . Las comparaciones de las otras variables de estudio (perfil de anticuerpos) se analizaron a través de proporciones mediante la prueba t de Student. Las diferencias fueron consideradas estadísticamente significativas con un p <0,05.

RESULTADOS

Los resultados observados en la Tabla 1 muestran las características clínicas de los grupos de estudio. No se observaron diferencias para la distribución por género, ni distribución por edad en ambos grupos. El 67,3% de los pacientes con DM1 presentaron niveles detectables de al menos uno de los dos anticuerpos anti-GAD65 o anti-IA-2. El porcentaje de anti-GAD65 tuvo un porcentaje mayor (70,2%). En este estudio, sólo un niño control dio positivo para este anticuerpo. La distribución de frecuencias alélicas y genotípicas para el poµMorfismo +49 A/G de CTLA-4 se muestra en la Tabla 2. No se observaron diferencias al comparar el grupo de niños con DM1 versus el grupo control. La muestra analizada se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg en ambos grupos analizados.

La Tabla 3, muestra la distribución de los anticuerpos anti-GAD65 y anti-IA-2 en el grupo de niños con DM1 de acuerdo a la frecuencia genotípica de CTLA-4. Tanto para anti-GAD65, como para anti-IA-2, es posible observar un gradiente desde el genotipo AA (60,3% y 59,5%) hasta el genotipo GG (79,4% y 70,6%). La comparación de esta distribución de anticuerpos entre los genotipos CTLA-4 no anojó significancia estadística. Sin embargo, se observa una marcada tendencia (p =0,065 para anti-GAD) a una mayor proporción de este marcador de autoinmuni-dad en los genotipos portadores del alelo G.

La expresión de las principales citoquinas se describe en la Tabla 4. Se resume el resultado de 13 citoquinas cuya expresión ha sido expresada en tres categorías: No detectada, señal baja y señal alta. En el grupo DM1 se observaron cuatro patrones de alta expresión para IL-2, IL-10, TNFα e INFγ, específicamente en aquellos niños portadores del genotipo GG del gen CTLA-4. El grupo de niños controles mostró una mayor expresión para las citoquinas IL-4, IL-5, IL-6 y TGFß1 al compararlos con los niños con DM1 en los dos genotipos (AA y GG). Por último, mediante este sistema, fueron indetectables las citoquinas IL-Iα, IL-ß y TGFß3 tanto en casos, como en controles.

DISCUSIÓN

La importancia de la molécula CTLA-4 en la modulación de la respuesta inmune, ha sido evidenciada por los innumerables estudios realizados desde hace varios años con el fin de establecer su relación con patologías de origen autoinmune^2-3. En este contexto, nuestro estudio mostró que la distribución del poµMorfismo +49 A/G de gen CTLA-4 es semejante en DM1 chilenos que en la población general y su frecuencia alélica y genotípica es comparable a la descrita previamente en poblaciones caucásicas^18-19.

En el año 2005, una amplia revisión de 33 estudios que observaron la asociación del gen CTLA-4 con la DM1, concluyó que el único poµMorfismo con mejor asociación con DM1 correspondía a la variante +49 A/G del gen CTLA-4, a pesar de la heterogeneidad de las poblaciones analizadas³⁶. Desde el punto de vista de los autoanticuerpos, nuestros resultados indican que más de la mitad de los pacientes diabéticos estudiados presentaron al menos uno de los dos anticuerpos cuantificados (anti-GAD65 y anti-IA-2), mientras que en el grupo control la presencia de dichos anticuerpos fue prácticamente nula. Estos resultados no son sorprendentes ya que se conoce hace más de 10 años que la presencia de anti-GAD65 y anti-IA2 se encuentra elevada en aproximadamente 75% de los pacientes con debut reciente de DM1. Una interesante materia de estudio correspondió a la asociación que tiene la presencia de estos anticuerpos con los genotipos específicos del gen CTLA-4. Nuestros resultados mostraron una mayor frecuencia de los anticuerpos anti-GAD65 y anti- IA-2 en los pacientes portadores del genotipo GG, indicando que este genotipo podría estar condicionando una respuesta autoinmune más severa. Nuestra observación es concordante con estudios previos que han mostrado un fenómeno similar; la presencia del alelo G se ha relacionado a una edad más temprana de debut y con mayor presencia de autoanticuerpos GAD65 e ICA512^27-30.

Existe evidencia a través de experimentos "in vitro" con células Cosí que indican que la presencia del alelo G se correlaciona con una disminución de ~30% en la densidad de CTLA-4 en la superficie celular en comparación con aquellas células que presentan en su genoma el alelo A, de este modo, se postula que una disminución de CTLA-4 en la superficie del linfocito T, generaría un menor control sobre su proliferación y una mayor producción de citoquinas^37-38.

En este contexto, el segundo estudio presentado, estuvo enfocado en describir el ambiente inmunológico presente en los pacientes con DM1 y niños controles de acuerdo a las características genotípicas del gen CTLA-4. Este ensayo de expresión serológica de citoquinas usando un ELISA simultáneo, confirmó algunas tendencias interesantes al analizar los datos de acuerdo a la carga geno típica de los pacientes y controles. De esta manera, se observó que la presencia del genotipo GG concentró una mayor expresión de citoquinas que aportarían daño a la célula ß (IL-2, INFγ y TNEα, producidas por linfocitos Thl) y una menor expresión de citoquinas en teoría protectoras como el caso de IL-4 y TGFfi. Una posible explicación a estos resultados estaría dada por la ocurrencia de un desbalance en la proporción de linfocitos Thl y Th2 generado probablemente por la presencia del alelo G en homocigosis. Existe evidencia en ratones KO para la molécula CTLA-4 que indican una mayor diferenciación hacia una respuesta Th2³⁹, mientras que experimentos con bloqueadores de CTLA-4 generan una polarización de linfocitos Thl⁴⁰, datos que indican que un desbalance tanto hacia una respuesta Thl o Th2 es igualmente dañina para la inmunotolerancia. Es posible que el alelo G participe en una cadena de eventos ligados a citoquinas específicas, así por lo menos lo muestra el análisis simultáneo de cito-quinas realizado, donde existiría un desequilibrio entre "fenotipos alérgicos" (Th2) o "fenotipos tolerantes" (Thl). Una mayor expresión de IL-ß posiblemente estimule el fenotipo alérgico en los DM1 y una mayor expresión de células del tipo Th3 (TGFß1) estimule la presentación de un fenotipo más tolerante. El papel de CTLA-4 ha sido evidenciado desde la perspectiva clínica en la DM1 en varios estudios, con asociaciones ligadas a un debut más prematuro, perfil variado de citoquinas y muy recientemente a diferencias entre diabetes fulminante y diabetes 1A^41-42. Lo anterior, es concordante con nuestros resultados que muestran que este tipo de asociaciones podrían estar relacionadas a la presencia de genotipos específicos en el gen de CTLA-4.

Agradecimientos

Los autores agradecen la colaboración de todos los niños y sus familias participantes en este estudio. A los Hospitales San Juan de Dios, San Borja-Arriarán y a la Fundación de Diabetes Juvenil de Chile.

 

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Recibido el 14 de julio, 2008. Aceptado el 28 de noviembre, 2008.

Investigación financiada con el proyecto FONDECYT 1060790.

Correspondencia a: Dr. Francisco Pérez-Bravo. Laboratorio de Epidemiología Nutricional y Genética, INTA-Universidad de Chile. Casilla 138-11, Santiago. E mail: fperez@inta.cl