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ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

Interacción entre los polimorfismos del receptor ß₁ y ß₂ adrenérgico como predictor de riesgo de insuficiencia cardiaca crónica

Interactions between ß₁ and ß₂ adrenergic receptor polymorphisms as risk factors for chronic heart failure

Francisco Moraga¹, Rodrigo Troncoso¹, Rosemarie Mellado¹, Guillermo Díaz-Araya¹, José Luis Vukasovic², Douglas Greig³, Osvaldo Pérez³, Lorena García¹, Juan Roldán¹, María Paz Ocaranza³, Jorge Jalil³, Mario Chiong¹, Pablo Castro³.

¹Unidad Farmacogenómica, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas,
²Hospital del Salvador, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.
³Departamento de Enfermedades Cardiovasculares, Pontificia Universidad Católica de Chile. Santiago, Chile.

Dirección para correspondencia

Background: ß adrenergic receptors (AR) are highly polymorphic and important regulators of cardiovascular homeostasis. Among these, ß₁ and ß₂ AR regulate cardiac contractility and frequency and are important pharmacological targets. Aim: To evaluate genotype and gene-gene interaction between ß₁-AR Arg389Gly and ß₂-AR ArglSGly GlnZ7Gly and Thrl 64Ile polymorphisms, as risk factors for HF. Material and methods: Eighty chronic HF patients and eighty-eight controls matched by age and sex were genotyped for ß₁ -AR Arg389Gly ß₂-AR ArgWGly, GlnZ7Glu and Thr164Ile polymorphisms. Results: The presence of ß₂-AR Glu afiele was a risk predictor for HF (odds ratio (OR) =2.81; 95% confidence intervals (CI) =1.49-5.31). Interactions that increased the risk for HF were found in patients carrying at least one of the ß₂-AR Glu and ß₂-AR Gly allele (OR =3.81; 95% CI =1.50-0.70) and ß₂-AR Glu and ß₁ -AR Gly allele combination (OR =5.51; 95% CI =2.19-13.86). Furthermore, the frequency of ß₂-AR Glu allele was higher among patients with a history ofacute myocardial infarction (with infarction: 0.534, without: 0.313, p =0.01). Conclusions: ß₂-AR Glu allele could be a risk predictor for HF. This risk could be enhanced by the additional presence of ß₂-AR GlyW or ß₁-AR Arg389 alleles. The frequency of ß₂-AR Gln27 Glu allele was higher among patients with a history of myocardial infarction.

(Key words: Catecholamines; Heart failure; Polymorphism, genetic; Receptors, adrenergic)

Se ha propuesto que los polimorfismos genéticos se asocian a la génesis o desarrollo de diversas enfermedades cardiovasculares y a la variabilidad individual a la respuesta farmacológica. Los receptores ß-adrenérgicos (ß-RA) son reguladores importantes de la homeostasis cardiovascular, siendo además un atractivo modelo para investigar las interacciones entre sus polimorfismos con la respuesta a fármacos o su relación con la susceptibilidad o progresión de las enfermedades cardiovasculares¹. Los ß-RAs (ß₁ y ß₂ y ß₃) son altamente polimórficos. Los ß₁-adrenergic y ß₂-RA son particularmente interesantes ya que regulan la contractilidad y frecuencia cardiaca y son también importantes blancos farmacológicos.

Se ha descrito que siete de los polimorfismos deß₁-RA producen un cambio de aminoácidos en la región codificadora^2-4. Dos de ellos son funcionalmente relevantes in vitro ^4-5. El cambio del nucleótido A145G genera la sustitución del aminoácido serina a glicina en el residuo 49 (Ser49Gly), afectando la internalización del receptor dependiente de agonista^3,5-7. Por otra parte, el cambio G1165C que sustituye glicina por arginina en el residuo 389 (Gly389Arg) se ha asociado a un mayor acoplamiento del receptor a la adenilato ciclasa ^4,6,7,8 . La frecuencia genotípica delß₁-RA Arg389Gly depende del grupo étnico⁹ y no regula la frecuencia cardiaca basal en sujetos sanos^9-11. Sin embargo, en pacientes con cardiopatía isquémica se ha observado una asociación entre este polimorfismo con varios parámetros hemodinámicos¹², por ejemplo la hipertensión arterial¹³, además actúa en forma sinérgica con la variante α_2C RA Del322-325, aumentando el riesgo de insuficiencia cardiaca (IC) crónica¹⁴. Esta última acción se produce por un efecto deletéreo de las catecolaminas circulantes asociada a una mayor funcionalidad del ß₁-RA, por una disminución de la retroalimentación negativa dependiente α_2CRA presináptico. El genotipo de ß₁-RA Arg389 tuvo un marcado efecto en la respuesta hemodinámica en reposo a atenolol¹⁵, como también en la respuesta antihipertensiva a metoprolol¹⁶.

Hasta ahora se han caracterizado 9 polimorfismos en el gen humano del ß₂-RA. Los más estudiados son la transición de A a G en la base 46 (Arg16Gly), la transversión G a C en la base 79 (Gln27Glu) y la transición de C a T en la base 491 (Thr164Ile)¹⁷. Las variantes ß₂-RA Gly16 y ß₂-RA Gln27 aumentan y disminuyen la regulación negativa del receptor por agonista, respectivamente. Los efectos in vivo de estos polimorfismos fueron inicialmente asociados con una mayor susceptibilidad al asma bronquial^18-21. El polimorfismo ß₂-RA Arg16Gly también ha sido asociado con hipertensión arterial^22-25 y aumentos de las presiones diastólica y sistólica^26,27. La variante ß₂-RA lie 164 es un alelo muy poco frecuente que disminuye la afinidad del receptor a su agonista²⁸ y ha sido asociado con la progresión de la IC²⁹.

En el corazón normal, losß₁-RA predominan. En cambio, en el corazón disfuncional la sobreac-tivación simpática lleva a una selectiva regulación negativa delß₁-RA y un incremento relativo en los ß₂-RA por sobre 40%³⁰. Dada la propiedad de los polimorfismos ß-RA, en particular ß₂-RA Arg16Gly y ß₂-RA Gln27Glu de regular negativa o positivamente al ß-RA, se propone que interacciones entre los polimorfismos del ß-RA son importantes en el desarrollo del síndrome de IC. Por la tanto, para determinar si las variantes ß₁-RA Arg389Gly, ß₂-RA Arg16Gly, ß₂-RA Gln27Glu y ß₂-RA Thr164Ile solas o en combinación representan un factor de riesgo para desarrollar IC, se genotipificaron estos polimorfismos en 168 sujetos: 80 pacientes con IC crónica y 88 controles sanos.

PACIENTES Y MÉTODO

Sujetos de estudio. Este estudio evaluó 80 pacientes con IC crónica y 88 controles sanos. Ambos grupos se reclutaron en el área de Santiago en el Hospital Clínico de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Los criterios de inclusión fueron: fracción de eyección de ventrículo izquierdo (FEVI) menor a 355 determinada por ventrículografía radioisotópica, IC clase II, III ó IV según la NYHA (New York Heart Association) y diagnóstico de miocardiopatía dilatada idiopática o cardiomipatía isquémica. La etiología isquémica se estableció por el antecedente de infarto del miocardio, cirugía de revascularización miocárdica, intervención coronaria percutánea, angina o evidencia de isquemia en test de esfuerzo o cintigrafía miocárdica.

El grupo control consistió en sujetos sanos, no relacionados entre ellos y sin factores de riesgo coronarios conocidos, esto determinado por un cuestionario y examen físico cardiovascular normal. El diseño del estudio fue aprobado por el Comité de Etica de la Pontificia Universidad Católica y todos los sujetos firmaron consentimiento informado.

Determinación de genotipo. El ADN genómico se obtuvo de muestras de sangre periférica por lisis hipotónica y extracción con fenol/cloroformo. Los polimorfismos ß₁RA Arg389Gly y ß₂-RA Thr164Ile se determinaron como se describieron previamente^11,31. Los polimorfismos ß₂-RA Arg16Gly y ß₂-RA Gln27Glu se determinaron amplificando con una sola reacción de PCR el gen del ß₂-RA y posterior digestión con las enzimas de restricción Ncol y Bbvl, respectivamente²⁰.

Estadística. Los resultados se presentan como promedios ± DS. Las frecuencias alélicas se determinaron usando procedimientos estándares. Se utilizaron los tests de y Fisher para analizar la asociación entre IC y los genotipos o alelos. Para evaluar las interacciones entre los polimorfismos ß₁-RA y ßRA se realizó una regresión logística, identificando el efecto de cada genotipo y su interacción con el riesgo de IC. Se calculó el odds ratio (OR) ajustado por edad y sexo para determinar la influencia de cada polimorfismo con el riesgo de IC. Finalmente, se utilizó test de para analizar el riesgo de infarto agudo del miocardio (IAM) asociado a cada polimorfismo, en pacientes con IC.

RESULTADOS

Las características clínicas de los pacientes con IC se muestran en la Tabla 1. De los 80 pacientes con IC, 65,1% se clasificaron en las clases III y IV de la NYHA. Todos estos pacientes se encontraban con su tratamiento habitual (diuréticos, digitálicos, inhibidores de la enzima convertidora de angio-tensinaI y ß-bloqueadores). La FEVI promedio al momento del enrolamiento fue de 25±9%. La edad promedio fue de 64±14 años (rango 23-91), siendo 88% de sexo masculino. La etiología fue isquémica en 43% y no isquémica en 57% de los pacientes. Se encontró hipertensión arterial, diabetes mellitus e hipercolesterolemia en 44%, 21% y 29% de los pacientes, respectivamente.

El grupo control compuesto por 88 sujetos sanos tuvo una edad promedio de 63±14 años (rango 40-92), siendo 80% de sexo masculino. Todos los sujetos controles estaban asintomáticos, sin historia mórbida previa significativa y con examen físico normal.

La Tabla 2 muestra el análisis de las frecuencias alélicas (FA) de los polimorfismos determinados. El alelo ß₂-RA Glu27 era más común en lo pacientes con IC (FA =0,400) que en los controles (FA =0,261; p =0,007). Las FAs para ß₂-RA Gly16, ß₂-RA Thrl64 y ß₁RA Arg389 no mostraron diferencias significativas en pacientes con IC y controles (Tabla 2).

Todas las frecuencias genotípicas determinadas cumplieron con el equilibrio Hardy-Weinberg. Cuando se analizaron los tres genotipos por polimorfismo en forma conjunta, la asociación del polimorfismo ß₂-AR Gln27Glu con IC se mantuvo significativa (Tabla 2). En efecto, 37,7% de los pacientes con IC portaban la variante genotípica ßRA Gln27Gln comparado con 61,4% de los controles. El análisis univariado también mostró una diferencia para el polimorfismo de ß₁-RA Arg389Gly (IC =3,8%, 47,4%, 48,7% vs control =5,7%, 27,3%, 67,0% para Gly/Gly, Gly/Arg y Arg/ Arg, respectivamente; p =0,027) (Tabla 2).

El OR no ajustado entre los pacientes con IC y los sujetos normales comparando aquellos que portan un alelo polimórfico con sujetos que eran homocigotos para ß₂-RA Gln27Gln fue de 2,65 (intervalo de confianza del 95% [CI ] : 1,42 a 4,90; p =0,003). La significancia estadística de este OR no se modificó al ajustar por edad y sexo, siendo el OR ajustado para pacientes con IC de 2,81 (CI =1,49 a 5,31; p =0,001) (Tabla 2).

Las FAs para ß₂-RA Gly16, ß₂-RA Thrl64 y ß₁RA Arg389 no mostraron diferencias significativas en pacientes con IC y controles (Tabla 2).

Puesto que los ß₁-adrenergic y ß₂-RAs coexisten en el corazón, se evaluó si sus distintas combinaciones polimórficas influían en el riesgo de desarrollar IC. A este respecto, se evaluó si el polimorfismo ß₂-RA Gln27Glu combinado ya sea con el polimorfismo de ß₂-RA Arg16Gly o ß_1-RA Gly389Arg aumentaban el riesgo de IC. No se consideró el polimorfismo ß₂-RA Thr164Ile en este análisis debido a su baja frecuencia.

Los sujetos se dividieron en 2 grupos, cada uno conteniendo 4 subgrupos como se muestra en la Tabla 3. Grupo 1 =homocigoto para ß₂-RA Arg16 yß₁-RA Gln27 (grupo de referencia); homocigotos para ß₂-RA Arg16 y heterocigoto para ß₂-RA Glu27; heterocigoto para ß₂-RA Gly16 y homocigoto para ß₂-RA Gln27; y heterocigoto para cualquier variante. Para el grupo 2 se utilizó una subdivisión similar, pero reemplazando ß₂-RA Arg16 con ß₁-RA Arg389.

En pacientes con IC, el análisis de dos loci mostró interacciones significativas entre los polimorfismos ß₂-RA Gln27Glu con ß₂-RA Arg16Gly y con ß₁-RA Arg389Gly. La combinación de los alelos ß₂-RA Glu27 y ß₂-RA Gly16 aumentó significativamente el OR para IC respecto al grupo de referencia (OR =3,81; CI =1,50 a 9,70; p =0,005). La combinación de los alelos ß₂-RA Glu27 y ß₁-RA Gly389 también aumentó significativamente el riesgo para IC comparado con el grupo de referencia (OR =5,51; CI =2,19 a 13,86; p <0,001) (Tabla 3).

Usando los datos de las Tablas 2 y 3 se calculó el riesgo relativo para IC asociado con la presencia del alelo ß₂-RA Glu27. La presencia de los alelos ß₂-RA Arg16 y ß₁RA Gly389 aumentó el OR en los sujetos que poseían el alelo ß₂-RA Glu27 desde 1,64 (CI =1,18 a 2,27, p =0,001) hasta 2,68 (CI =1,30 a 5,49; p =0,005) y de 2,10 (CI =1,34 a 3,30; p =0,001), respectivamente. Por lo tanto, la presencia adicional de los alelos ß₂-RA Arg16 o ß₁-RA Gly389 aumentó el riesgo relativo de IC atribuible al alelo ß₂-RA Glu27.

Para evaluar si estos hallazgos antes mencionados podían ser explicados por la diferencia de las frecuencias de este genotipo en base a la etiología de la IC (isquémica vs no isquémica) o según el antecedente de hipertensión arterial, se analizó sólo a los pacientes con IC. No se detectaron diferencias de frecuencias entre los dos subgrupos etiológicos ( =0,0002, p =0,99) o entre los pacientes con o sin hipertensión arterial ( =0,31, p =0,578).

Los parámetros clínicos de los pacientes con IC, incluyendo etiología, hipertensión, diabetes, FEVI, historia médica previa, IAM, etc. Fueron analizados en asociación con los polimorfismos de los ß₁- y ß₂-RA. Se encontró una asociación estadísticamente significativa entre ß₂-RA Gln27Glu y la prevalencia de IAM. Las frecuencias genotípicas para Glu/Glu, Gln/Glu, Gln/Gln en pacientes con IAM fueron 34,5%, 37,9% y 27,6%, mientras que aquellos pacientes con IC sin IAM fueron de 6,3%, 50,0% y 43,7%, respectivamente (p =0,006) (Tabla 4). Las frecuencias alélicas ß₂-RA Glu27 en pacientes con y sin IAM fueron de 0,534 y 0,313, respectivamente (p =0,010) (Tabla 4).

DISCUSIÓN

En este estudio se observó que los sujetos con el alelo ß₂-AR Glu27 presentaron un mayor riesgo para IC comparado con los homocigotos Gln27. Además, el análisis de dos loci mostró interacciones significativas entre las variantes ß₂-AR Gln27Gln conß₁-AR Arg389Arg o ß₂-AR Arg16Arg, aumentando el riesgo para IC.

La sobreactivación del sistema catecolaminér-gico en la progresión de la disfunción ventricular izquierda ha sido extensamente documentada^30,32-33. Los niveles incrementados de catecolaminas observados en pacientes con disfunción ventricular izquierda, en estadios iniciales son un mecanismo de compensación, pero progresivamente tienen un efecto crónico deletéreo sobre el miocardio. Como resultado de la sobreactivación catecolaminérgica, en corazones de pacientes con IC se observa un incremento en la relación de los ß₂-RA/ß₁--RA³⁰. Por lo tanto, polimorfismos que aumenten la regulación positiva o la actividad del ß₁-RA o por el contrario la disminuyan en el ß₂-RA, podrían tener efectos protectores sobre el miocardio^31-35.

Las consecuencias funcionales de los polimorfismos del ß₂-RA han sido ampliamente estudiadas en modelos in vivo e in vitro mostrando resultados conflictivos en relación a las variantes alélicas o haplotipos^14,17,28,37. Sin embargo, estudios recientes in vivo han demostrado que los sujetos que son homocigotos para los alelos ß₂-RA Arg16 y Gln27 tienen una desensibilización del receptor mediada por el agonista aumentada, mientras que quienes son homocigotos para el alelo ß₂-RA Glu27 tiene una mayor respuesta al agonista que los sujetos homocigotos para el alelo Gln27³⁸. De acuerdo a esta información, nuestros resultados muestran que los pacientes con IC que portan el alelo ß₂-RA Glu27 tienen un mayor riesgo de IC, y que este alelo cuando interactúa con el alelo ß₂-RA Gly16 el riesgo aumenta. Este resultado concuerda con nuestra hipótesis pues los alelos ß₂-RA Glu27 y Gly16 están asociados con la resistencia a la regulación negativa. Por consiguiente, estos pacientes tienen una mayor densidad de ß₂-RA lo que conduce a una progresión acelerada de la disfunción ventricular.

El alelo ß₁-RA Arg389 ha sido asociado a una mayor capacidad para unirse a adenilil ciclasa que el alelo Gly389³⁹. Ratones que sobrexpresan ß₁-ARg389 tienen una mejor contractibilidad que esos con el alelo Gly389⁴⁰. Como el ß_1-RA pred omina en el corazón normal y es regulado negativamente en el corazón disfuncional, la presencia de un alelo ß₁-RA Gly389 menos activo, puede deteriorar la respuesta basal a catecolaminas. Por lo tanto, la asociación de ß₁-RA Gly389 con ß₂-RA Glu27 puede facilitar un incremento relativo en la relación ß₂-RA/ß₁-RA observada en corazones insuficientes, con esto incrementando el riesgo de IC.

Hallazgos previos sugieren que el polimorfismo ß₁-RA Arg389Gly no está asociado con el riesgo para IC en sujetos de raza blanca o negra¹⁴. Sin embargo en sujetos de raza negra, este polimorfismo actúa en forma sinérgica con la variante a α_2C -RA Del322-325, aumentando el riesgo para IC¹⁴. La capacidad de ejercicio en pacientes con IC está asociada tanto con la variante ß₂-RA Thr164Ile como ß₁RA Gly389Gly. En nuestro estudio, los pacientes con IC y los controles sanos tuvieron una frecuencia similar del alelo ß₁-RA Gly389, pero con una frecuencia genotípica diferente. Sin embargo, el riesgo para IC no fue significativamente diferente, indicando que a pesar de la diferencia de frecuencia genotípica entre los pacientes con IC y el grupo control, la variante ß₁-RA Gly389Gly no es un predictor de riesgo para IC.

Recientemente, Forleo et al describieron que el alelo ß₁-RA Gly49 y los alelos ß₂-RA 5'LC-Cys19, Arg16 y Gln27 estaban asociados con un menor riesgo de IC en pacientes con cardiomiopatía dilatada idiopática⁴¹. Sin embargo, Covolo et al describieron que los polimorfismos del ß₁- y ß₂-RA no son un factor de riesgo para IC⁴². En nuestro estudio se observó que el alelo ß₂-RA Glu27 interacciona con el alelo ß₂-RA Gly16 o el alelo ß₁-RA Gly389, aumentando el riesgo para IC. Nuestros resultados sugieren que los sujetos portadores en forma simultánea de los alelos ß₂-RA Glu27, ß₂-RA Gly16 y ß₁-RA Gly389 tienen un riesgo mayor para IC comparado con los sujetos homocigotos para ß₂-RA Gln27, ß₂-RA Arg16 y ß₁-RA Arg389.

La Tabla 5 resume los diferentes estudios de los polimorfismos ß-RA y su relación con la función cardiaca y la IC. Dos de estos estudios han evaluado el efecto de los polimorfismos ß-RA en el riesgo de IC. Small et al informaron que no existía asociación entre el polimorfismo ß₁-ARg389Gly y el riesgo de IC, mientras Covolo et al estudiaron el impacto de los polimorfismos ß₁-RA Arg389Gly y los ß₂-RA Arg16Gly y Gln27Glu en el inicio de la IC, ninguno de estos polimorfismos presentó asociación con el riesgo de IC. Sin embargo, nuestros resultados muestran que sólo el ß₂-RA Gln27Glu es un marcador de riesgo de IC.

Por otro lado, algunos estudios han asociado la presencia de polimorfismos de receptores ß₁-, ß₂ y ß₃ con un mayor riesgo de cardiopatía coronaria. Estos estudios, realizados principalmente en poblaciones seleccionadas, no son concluyentes en cuanto a la asociación de polimorfismos ß₂ y presencia de infarto. De esta forma, un estudio realizado en mujeres con dolor torácico mostró mayor un mayor riesgo de presentar muerte, infarto agudo del miocardio o accidente cerebro vascular en presencia de polimorfismos ß₁- y ß₃.

Las diferencias en los criterios de inclusión de pacientes y la elección de los sujetos controles puede ser responsable de la diferencia de los resultados obtenidos en nuestro estudio comparados con la literatura^44,45. Nuestro grupo control fue especialmente seleccionado para contener un número alto de hombres mayores sin enfermedad o riesgo cardiovascular.

CONCLUSIONES

El alelo Glu27 del ß₂-AR fue un predictor de riesgo de IC, la cual aumenta con la presencia adicional de los alelos ß₂-RA Gly16 o ß₁-RA Arg389. En resumen, El genotipo y frecuencia del alelo ß₂-RA Glu27Glu se relacionó a la etiología de la IC crónica y con la prevalencia de infarto al miocardio.

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Recibido el 22 de octubre, 2007. Aceptado el 24 de julio, 2008.

Trabajo parcialmente financiado por Proyectos FONDECYT #1010992 (PC) y DID 14-02/01 (GDA).

Correspondencia a: Dr. Pablo Castro. Hospital Clínico Pontificia Universidad Católica de Chile. Marcoleta 367, Santiago, Chile. E mail: pcastro@med.puc.cl o Mario Chiong Lay. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile. Olivos 1007, Santiago 8380492, Chile. E mail: mchiong@uchile.cl