Rev Méd Chile 2007; 135: 1103-1110

Artículos de Investigación

Mutaciones en genes gyrA y gyrB en cepas de bacilos Gram negativos aisladas en hospitales chilenos y su relación con la resistencia a fluoroquinolonas

Mutations in gyrA and gyrB genes among strains of Gram-negative bacilli isolated from Chilean hospitals and their relation with resistance to fluoroquinolones

Mery De la Fuente C^1a. Priscila Dauros S^1b, Helia Bello T^1c, Mariana Domínguez Y , Sergio Mella M², Marcela Sepúlveda A^2,3d, Raúl Zemelman Z^3e, Gerardo González R^1f.

¹Laboratorio de Antibióticos, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas; ²Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina, Universidad de Concepción y ³Universidad San Sebastián. Concepción, Chile.
^aBioquímico. MSc Microbiología
^bBiólogo
^cBioquímico. DSc Ciencias Biológicas
^dBioquímico. MSc Microbiología. Dipl. Micología Médica
^eQuímico Farmacéutico. Dipl. Bacteriology. MSc Public Health
^fLic. Biología. MSc Microbiología. DSc Ciencias Biológicas

Dirección para correspondencia

Background: A progressive frequency of resistance to fluorquinolones is observed among Gram-negative bacilli. Aim: To investigate the mechanism of resistance to fluoroquinolones mediated by mutations affecting gyrA and gyrB genes in strains of Gram negative bacüli isolated from CMean hospitals. Material and method: Minimal inhibitory concentration of fluoroquinolones was determined in 91 randomly selected nalidixic acid-resistant strains of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa, isolated from hospitals of 12 Chilean cities. Quinolone resistance determining region (QRDR) was amplified by PCR and mutations were determined by restriction fragment length polymorphism (RFLP) and DNA sequencing. Results: Strains with mutation in codon 83 of gyrA showed decreased susceptibility to ciprofloxacin with MICs ranging from 0.25 to 1024 fig/ml. The sequencing of PCR products for gyrA indicated amino acid changes in the QRDR region. One strain ofE. coli presented a double mutation, in codon 83 Ser to Leu as well as in codon 87 Asp to Asn. In strains ofK. pneumoniae, however, the change of codon 83 was Ser to Tyr, in A. baumannii was Ser to Leu and in P. aeruginosa was Thr to He. No strains with mutations affecting gyrB were found. Conclusions: Mutations in codon 83 of gyrA is a frequent genetic event involved in the mechanism leading to decreased susceptibility to fluoroquinolone in strains of Gram-negative bacilli.

(Key words: DNA Gyrase, Fluoroquinolones; gyrA gene product; gyrB gene product)

Las fluoroqulnolonas ejercen una favorable actividad sobre bacilos Gram negativos aeróbicos, sin embargo, se ha descrito en forma progresiva un aumento de la resistencia a estos antibióticos. Entre los mecanismos de resistencia a las fluoroqui-nolonas se encuentran alteraciones en las enzimas blanco por mutaciones puntuales en los genes que codifican para subunidades de estas enzimas y, por otra parte, la disminución en la acumulación del compuesto dentro de la bacteria. Además, recientemente se ha descrito un mecanismo de tipo plasmídico, determinado por el gen qnr¹-².

En E. coli, las mutaciones en los genes gyrA y gyrB, que codifican para la subunidad A y B de la ADN girasa, respectivamente, se encuentran en una zona llamada QRDR (región determinante de resistencia a quinolonas) específica para cada subunidad^3,4. En gyrA, estas mutaciones afectan con mayor frecuencia al codón 83 y en segundo lugar al codón 87. Una mutación provoca una susceptibilidad disminuida a las fluoroquinolonas y una doble mutación estaría asociada a elevados niveles de resistencia¹. El mecanismo de resistencia determinado por mutaciones en el gen gyrA ha sido descrito en K. pneumoniae⁵, A. baumannifi y P. aeruginosa , especies de creciente importancia en el ambiente hospitalario. En gyrB, las mutaciones más frecuentes ocurren en los radones 426 y 447, siendo de menor importancia clínica que las que ocurren en gyrA^s; a pesar de su descripción en aislados de E. colfi y P. aeruginosa¹⁰.

El objetivo de este trabajo fue investigar la presencia de estas mutaciones y su relación con la resistencia a fluoroquinolonas en cepas de bacilos Gram negativos aislados en hospitales de Chile.

MATERIAL Y MÉTODO

Cepas bacterianas. Se seleccionaron al azar 91 cepas de bacilos Gram negativos, las que cumplían con la condición de ser resistentes a ácido nalidíxico y distintas en cuanto a sus características de aislamiento (fecha, hospital y tipo de muestra). Se incluyeron 18 cepas de K. pneumoniae, 24 de E. coli, 24 de A. baumanniiy 25 de P. aeruginosa. Las cepas fueron aisladas desde diversas muestras clínicas en hospitales de las ciudades de Iquique (4 cepas), Valparaíso (6 cepas), Santiago (19 cepas), Constitución (3 cepas), Talca (4 cepas), San Carlos (1 cepa), Chillan (1 cepa), Tomé (3 cepas), Concepción (27 cepas), Talcahua-no (10 cepas), Lota (3 cepas), Coronel (9 cepas) y Puerto Montt (1 cepa), entre los años 1990 y 2004 y se mantuvieron a -70°C, en una suspensión glicerol-agua 50% v/v y caldo tripticasa en proporción 1:2.

Estudio de susceptibilidad a las quinolonas. Se determinaron los patrones de resistencia mediante el método de difusión en agar, según las normas del NCCLS (actualmente CLSI), 2002¹¹. Los agentes antibacterianos utilizados fueron: ácido nalidíxico (AN), ciprofloxacina (CIP), levofloxacina (LEV), moxifloxacina (MXF) y gatifloxacina (GTX). Los niveles de resistencia se estudiaron determinando la concentración mínima inhibitoria de AN, CIP, LEV y MXF, mediante el método de dilución seriada en agar según el NCCLS (actualmente CLSI), 2002¹².

Amplificación de la zona QRDR de los genes gyrA y gyrB. Se seleccionaron cepas de diferentes niveles de resistencia, año de aislamiento y origen geográfico. La amplificación se realizó mediante la reacción de la polimerasa en cadena (RPC) utilizando partidores específicos para la zona QRDR de cada especie bacteriana (Tabla 1). La mezcla de reacción contenía 2,5 µL de dNTPs (1,25 mM de cada desoxlnucleótldo), 2,5 µl de tampón de RPC 10x, 1,5 lü de cada partidor (20 pM), 1,25 µl de MgCl₂ (50 mM), 5,6 µl de agua destilada estéril (ADE), 0,125 µl de Taq ADN polimerasa (5U/µl) y 10 µl del templado de ADN. El templado se obtuvo a partir del sobrenadante de un cultivo de 10⁹ UFC/ml sometido a ebullición por 15 min y centrifugado a 14.000 rpm por 5 min¹³.

La amplificación fue realizada usando el siguiente programa: 96°C por 3 min, seguido de 24 ciclos de 96°C por 15 s, 50°C por 30 s y 70°C por 90 s, y una extensión final 70°C por 5 min. Los productos de RPC fueron separados por electroforesis en gel de agarosa 1% a 100 V en tampón TAE (40 mM TRIS-HC1, 20 mM NaAc, 2 mM Na₂EDTA H₂0, 1,02 M ácido acético). La detección se realizó por tinción del gel con bromuro de etidio (0,5 mg/L) y posterior visualización en un transiluminador de luz UV.

Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). La mezcla de reacción incluyó 5 µl del producto RPC, 2 µl de tampón correspondiente a la enzima a utilizar, 12,5 µl de ADE y 0,5 µl de la enzima. Esta mezcla se incubó a 37°C por 4 h y los productos de digestión fueron separados mediante electroforesis a 50 V en gel de agarosa de alta resolución al 1,7%.

Secuenciación del producto RPC. Se secuenció el producto de RPC para gyrA de 8 cepas y de gyrB para 5 cepas, las que fueron elegidas de acuerdo a presencia o ausencia de la mutación detectada por RFLP. El ADN fue purificado con el kit Wizard PCR Prep DNA Purification System (Promega) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las muestras fueron secuenciadas directamente mediante el método dideoxi en un secuenciador automático de ADN Abi 3730 ó 3100 en la empresa MWG de Estados Unidos de Norteamérica.

RESULTADOS

Detección de mutaciones mediante RFLP. El amplificado por PCR correspondiente a la zona QRDR del gen gyrA se sometió a un análisis con enzimas de restricción (RFLP). El RFLP permite detectar fácilmente mutaciones en el codón 83, ya que, en E. coli, K. pneumoniae, A. baumannii y P. aeruginosa, éste se encuentra localizado en el sitio de restricción de las enzimas utilizadas.

En 21/24 (88%) de los aislados de E. coli se detectó una mutación en el codón 83 de gyrA, con pérdida del primer sitio de restricción para la enzima Hinfl, lo que llevó a la obtención de dos fragmentos, de 388 y 288 pb, respectivamente. En 18/24 (75%) de las cepas seleccionadas de A. baumannii se detectó esta mutación, con pérdida del sitio de restricción de la enzima Hinfl. En 19/ 25 (76%) de las cepas P. aeruginosa se detectó la mutación, con pérdida del sitio de restricción de la enzima SstII. Por último, en 14/18 (78%) de las cepas de K. pneumoniae se detectó la mutación, encontrándose también dos fragmentos, de 388 y 288 pb, con pérdida del primer sitio de restricción de Hinfl.

En la Tabla 2 se muestra la frecuencia de cepas en las que se encontró mutación que afecta al codón 83 del gen gyrA y los niveles de resistencia a ciprofloxa-cina, molécula utilizada como representante de las fluoroquinolonas. De acuerdo a la categorización informada por Brown y Amy es⁷, se encontró que todas las cepas con nivel de resistencia medio (hasta 32 µg/ml) o elevado (>32 µg/ml) a ciprofloxacina, presentaron la mutación en el codón 83 del gen gyrA. En cambio, en las cepas con bajo nivel de resistencia (≤ 1 µg/ml) esta mutación fue infrecuente, encontrándose sólo en 3 de 22 cepas (13,6%). En ninguna de las cepas ensayadas se detectó mutaciones en los codo-nes 426 y 447 de gyrB.

Secuenciación. Se realizó un alineamiento con la secuencia patrón para cada especie: E. coliK-12 EMBL X06373, K. pneumoniae GenBank AF052258, A. baumannii EMBL 82165 y P. aeruginosa GenBank L29417 (Figura 1). En E. coli, la cepa ECR-17 mostró una mutación de C a T en la segunda posición del codón 83, resultando en el cambio de Ser a Leu; además, se observó un cambio de G a A en la primera posición del codón 87, lo que implicó el cambio de Asp a Asn. Esta cepa presentó elevados niveles de resistencia a todas las fluoro-quinolonas ensayadas (32 µg/ml) (Tabla 3). La cepa EC-145, la cual fue susceptible a las fluoroquinolo-nas, no mostró ninguna mutación.

La cepa K-49 de K. pneumoniae tuvo un cambio de C a A en la segunda posición del codón 83, resultando en la mutación de Ser a Tyr; esta cepa mostró elevados niveles de resistencia a ciprofloxacina (256 µg/ml). En la cepa K-218 no se observó mutación y fue susceptible a las fluoroquinolonas.

En A. baumannii, la cepa 90-39 tuvo una mutación en la posición 83, lo que produjo un cambio de Ser a Leu, debido al cambio de C a T en la segunda posición del codón y sus niveles de resistencia fueron elevados para todas las quinolonas. La cepa 90-38 no mostró ninguna mutación y presentó un nivel de resistencia intermedia a ciprofloxacina y fue susceptible a moxifloxacina y levofloxacina.

La cepa P-103 de P. aeruginosa tuvo una mutación de Thr a lie en la posición 83, producto de un cambio de C a T en la segunda posición del codón, presentando niveles de resistencia elevados a todas las quinolonas. La cepa P-15 no presentó mutaciones y fue susceptible a las fluoroquinolonas.

El producto de RPC secuenciado del gen gyrB no evidenció cambios nucleotídicos que se tradujeran en un cambio en la secuencia aminoacídica en la zona QRDR. En una cepa de K. pneumoniae y en una de P. aeruginosa la zona QRDR permaneció totalmente conservada en el producto de RPC secuenciado.

DISCUSIÓN

La mutación en el codón 83 de gyrA fue encontrada en todas las cepas resistentes a fluoroquinolonas, lo que indica que este mecanismo está involucrado en la resistencia y efectivamente disminuye la susceptibilidad de estas bacterias, pero no necesariamente las convierte en clínicamente resistentes^1,15,16. La resistencia de importancia clínica depende del cambio aminoacídico ocurrido y, además, de la existencia de otras mutaciones, particularmente en la topoisomerasa IV, como también de otros mecanismos, como son la participación de bombas de eflujo.

La secuencia aminoacídica obtenida a partir de la secuencia de ADN, permitió la comparación con una secuencia sin mutación, obtenida desde bases de datos. Así, se logró establecer que las secuencias de los productos de RPC concuerdan con lo descrito por otros autores^14,17,18. Por ejemplo, las secuencias nucleotídi-cas de las cepas de E. colí susceptible (EC-145) y la cepa de E. colí K12 presentaron exactamente los cambios descritos previamente por Weigel y col¹⁴. Estos cambios nucleotídicos correspondieron a mutaciones silenciosas, por lo que no se tradujeron en cambios aminoacídicos. En cambio, en los codones 83 y 87 de la cepa resistente de E. colí se encontró una doble mutación, descrita anteriormente^1,14, que se ha asociado con niveles elevados de resistencia a quinolonas. Respecto de las cepas de K. pneumoniae, se observó un cambio de Ser a Tyr, el que ha sido informado por otros autores en cepas con valores bajos a medios de CIM (CIM_CIp <2 y 16 µg/ mi, respectivamente)^5,14,19. Debido a que en este trabajo se encontró un nivel elevado de resistencia a ciprofloxacina (256 µg/ml), es posible sugerir que, además, podrían existir mutaciones en genes de la topoisomerasa IV, o bien en genes reguladores de bombas de eflujo. En las mutaciones de la cepa de A. baumannii se observó un cambio de Ser a Leu. Este cambio ha sido anteriormente asociado a niveles medio a elevado de resistencia a ciprofloxacina (CIM 4-128 µg/ ml)^6,20,21, lo cual coincide con el nivel de resistencia a ciprofloxacina de la cepa de A. baumannii analizada en el presente estudio, sobre la cual ciprofloxacina presentó una CIM de 256 µg/ml. El nivel de resistencia de la cepa de P. aeruginosa P-103 puede ser explicado por la mutación única en gyrA, ya que el cambio de Thr a lie se ha asociado con elevados niveles de resistencia (CIM_CIp >32 µg/ml)²²; sin embargo, al igual que en A. baumannii, no se descarta que existan otros mecanismos involucrados.

Al parecer, en las bacterias ensayadas en este trabajo, las mutaciones en el gen gyrB no juegan un rol de importancia en su resistencia a fluoro-quinolonas. No obstante, este mecanismo ha sido informado para cepas de E. coli y P. aeruginosa^9,10. Debido a que se ha descrito un posible aumento de afinidad por ciprofloxacina a causa de una mutación en el codón 447 de la zona QRDR de gyrB²³, se secuenciaron cepas con bajos niveles de resistencia a ciprofloxacina, pero no se detectó ninguna mutación en estas bacterias.

Este trabajo permite afirmar que, en general, la resistencia a fluoroquinolonas se debe a múltiples mutaciones secuenciales en genes que codifican diversos mecanismos, por lo que las cepas que presentan mutación en gyrA son de gran importancia clínica, ya que la presencia de una mutación aumenta la probabilidad de adquirir nuevas mutaciones^24,25 . En general, la resistencia a quinolonas es adquirida en forma gradual, a diferencia de la resistencia mediada por la adquisición de material genético exógeno (plásmidos, transposones, etc.), donde habitualmente hay un incremento brusco de las CIM²⁴, fenómeno típico de la resistencia a ß-lactámicos y aminoglucósidos-aminociclitoles.

Este concepto de importancia para el clínico, debe motivar la utilización de quinolonas en forma rigurosa, privilegiando su uso cuando no hay otras alternativas terapéuticas y utilizando dosis y duración adecuada de tratamiento²⁶. Por otra parte, estos resultados también sugieren la necesidad de proseguir estos estudios moleculares en un intento por comprender, de manera más integral, este importante fenómeno multifactorial que involucra la resistencia a fluoroquinolonas en las especies de bacilos Gram negativos.

Agradecimientos

Agradecemos a la Sra. Magda Hernández y Sra. Evelyn Benavente por su asistencia técnica, como también a todos los laboratorios de los hospitales incluidos en este estudio, por enviarnos desinteresadamente las cepas analizadas en este trabajo.

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Recibido el 26 de septiembre, 2006. Aceptado el 27 de marzo, 2007.

Financiamiento: Proyecto FONDECYT 1040482.

Correspondencia a: Gerardo González R. Departamento de Microbiología. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad de Concepción. Tel: 41-2203237. Fax: 41-2245975. Casilla 160-C. Concepción. Chile. E mail: ggonzal@udec.cl