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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.134 n.8 Santiago ago. 2006

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872006000800006 

Rev Méd Chile 2006; 134: 981-988

Artículos de Investigación

 

Genotipificación de aislados clínicos de Helicobacter pylori en base a genes asociados a virulencia cagA, vacA y babA2. Primer aislamiento de una cepa babA2 positiva en pacientes chilenos

Genotypying of clinical isolates of Helicobacter pylori by cagA, vacA and babA2 virulence associated genes. First detection of a babA2 positive strain in Chilean patients

 

Apolinaria García C1a, Ricardo Barra T1b, Carolina Delgado Sch2, Fernando Kawaguchi P3, Natalia Trabal F1c, Sonia Montenegro H4d, Carlos González C1a.

1Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas.
2Departamento de Patología y
3Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina, Universidad de Concepción. Concepción, Chile.
4Molecular Immunogenetics Laboratory, Ochsner Clinic Foundation, New Orleans, LA Estados Unidos de Norteamérica.
aBioquímico, Magíster en Microbiología. Doctora en Ciencias Biológicas
bAlumno de Química y Farmacia
cLicenciada en Ciencias Biológicas, Magíster en Microbiología.
d Médico Veterinario, Magíster en Microbiología, PhD en Molecular Pathology.


Background: Helicobacter pylori-associated gastroduodenal diseases depends on host characteristics, environmental conditions and bacterial virulence factors, such as cagA, vacA y babA2 gene products. Moreover, peptic ulcer disease has been related with cagA+, vacAs1m1 strains, while metaplasia and gastric cancer has been associated to cagA+, vacAs1 and babA2+ H pylori strains. Gene babA2 has not yet been described in clinical isolates from Chilean patients. Aim: To investigate the presence of cagA, vacA (s and m) and babA2 genes in clinical isolates of H pylori from Chilean patients. Material and Methods: Sixty six isolates from 41 patients were genotyped by PCR, using primers for s1a, s1b, s2, m1, m2, cagA and babA2 genes as previously described. Results: cagA gene was detected in 16 isolates (24.2%) while vacAs1a, vacAs1b, vacAs2, vacAm1 and vacAm2 were detected in 28 (42.4%), 14 (21.2%), 17 (25.8%), 21 (31.8%) and 29 isolates (43.9%), respectively. One isolate (1.5%) was babA2 positive, being the first isolate with this genotype described in Chile. Besides the babA2+ genotype this clinical isolate also presented cagA+ and vacAs1a which has been related with metaplasia or gastric cancer. Five isolates showed an ulcerogenic profile cagA+, vacAs1m1. Conclusions: The results presented indicate the prevalence of vacAs1m1 genotype among the clinical isolates analyzed, and a low frequency of babA2 genotype (Rev Méd Chile 2006; 134: 981-8).

(Key-words: babA protein, Helicobacter pylori; cagA protein, Helicobacter pylori; Helicobacter pylori; vacA protein, Helicobacter pylori)


La infección por Helicobacter pylori establece, en la mayoría de los individuos infectados, una inflamación crónica, asintomática, de larga duración en la región antro-pilórica del estómago, posiblemente debido a que los mecanismos defensivos inmunológicos del huésped fallan en su eliminación1,2. La persistencia de la infección en ciertos pacientes resulta en el desarrollo de patologías severas, que progresan de gastritis crónica a úlcera péptica, gastritis atrófica, linfoma de MALT y adenocarcinoma gástrico3-5. A pesar de la alta prevalencia de la infección por H pylori, sólo una minoría de individuos infectados desarrolla una patología severa maligna. Esto puede deberse a la diversidad genética entre individuos6; a factores ambientales, como tipo de dieta, edad de la primera infección7 y a factores de virulencia específicos de la bacteria8,9. El gen cagA, que codifica un antígeno inmunodominante, no se presenta en todas las cepas de H pylori10, pero forma parte del islote de patogenicidad (cagPAI), que contiene 31 genes11. Por lo tanto, su detección molecular indica la presencia del PAI en el cromosoma del microorganismo9. Las cepas cag+ (cepas tipo I) se asocian a mayor virulencia, al inducir daño gástrico visible, mientras que las cepas cag- (cepas tipo II) se asocian a menor virulencia y se comportan como bacterias comensales más que patógenas11. La citotoxina vacuolizante VacA es secretada por alrededor de 50% de las cepas de H pylori y causa degeneración vacuolar de las células gástricas epiteliales y ulceración de la mucosa gástrica12. La citotoxina está codificada por el gen vacA, que puede presentar mosaico genético en base a variaciones alélicas en las regiones media (alelos m1 o m2 y subtipos) y de señal (alelos s1 o s2 y subtipos) del gen13,14. Específicamente, se ha demostrado que cepas vacA s1/m1 poseen una elevada actividad citotóxica en comparación con cepas s1/m2 y que cepas s2/m2 no tendrían actividad citotóxica13.

Recientemente, se ha demostrado que factores de adherencia bacteriana contribuyen a la patogenicidad de H pylori15-17. Así, la adhesina, codificada por el gen babA2, favorece una unión persistente entre el microorganismo y la célula epitelial gástrica por unión de la célula bacteriana a través de su proteína BabA2 con antígeno de grupo Lewis B (LeB), presente en la mucosa gástrica18. Por lo tanto, cepas de H pylori babA2positivas presentan mayor capacidad de adherencia, en cambio, las cepas babA2 negativas se adhieren débilmente18. Esta adherencia se ha asociado con altos niveles de infiltración linfocitaria, atrofia glandular, metaplasia intestinal e incremento de la proliferación epitelial, reportándose una asociación significativa con úlcera duodenal y cáncer gástrico19. De acuerdo a Yu y col (2002)17, el gen babA2 podría ser un marcador molecular útil para identificar pacientes con mayor riesgo de presentar patologías severas asociadas a infecciones por H pylori.

Alves Oliveira y col (2003)20, en un estudio en Brasil, informaron una fuerte asociación entre babA2 y la presencia de úlcera péptica o carcinoma gástrico.

Es importante considerar que la frecuencia de determinantes de virulencia y su asociación con patologías gastrointestinales varía considerablemente en diferentes regiones geográficas. La presencia de más de uno de estos genes de virulencia se asociaría con mayor severidad de la lesión gástrica. Se ha informado que cepas cagA+, vacAs1m1 estarían asociadas a la presentación de úlceras y cepas triple positivas cagA+, vacAs1, babA2+, además de úlcera, se asociarían con metaplasia y adenocarcinoma gástrico19,21.

En Chile, más de 90% de los pacientes con úlcera péptica y 42% de quienes consultan por dispepsia no ulcerosa están infectados con H pylori22. A pesar de la elevada prevalencia de infección por H pylori en nuestro país, aún son pocos los trabajos en genotipificación de cepas incluyendo los genes cagA y vacA23-25 y no se encuentran trabajos con respecto al gen babA2.

El objetivo del presente estudio fue genotipificar cepas de H pylori aisladas de pacientes con patología gastroduodenal en base a los genes cagA, vacA (región s y m), incluyendo el gen babA2, no detectado previamente en cepas chilenas.

Material y método

Pacientes y biopsia. Se incluyeron cuarenta y un pacientes que consultaron por sospecha de patología digestiva alta en centros hospitalarios de la ciudad de Concepción, en los años 2001 y 2002, y que fueron sometidos a gastroduodenoscopia y biopsia gástrica. Se obtuvo consentimiento informado de los pacientes para utilizar parte de la biopsia de la zona antral o del cuerpo para cultivo y genotipificación. Se siguieron las recomendaciones del European Helicobacter pylori Study Group, 199726.

Condiciones de cultivo e identificación. Las biopsias gástricas se maceraron y homogenizaron en suero fisiológico y una alícuota (100 µl) fue cultivada en agar Columbia suplementado con 5% de sangre de caballo e inhibidor de la microbiota acompañante (DENT), a 37°C, en microaerofilia (10% de CO2), por cuatro días. Las colonias se identificaron mediante test de ureasa, catalasa y tinción de Gram. A partir de los cultivos identificados positivamente como H pylori, se realizó una suspensión del total de bacterias desarrolladas en cada placa y se almacenó en caldo Tripticasa con 15% de glicerol, a -70°C.

Cepas de H pylori. Se incluyeron 66 aislados clínicos de H pylori para realizar la genotipificación. Como cepa de referencia, se empleó la cepa ATCC 43504 (cagA+, vacAs1m1, babA2+).

Extracción de ADN. El ADN se extrajo de acuerdo al método descrito por Mazurier y col27, a partir de una suspensión en suero fisiológico estéril de todas las colonias desarrolladas en un subcultivo de H pylori obtenido del cepario mantenido a -70°C y sembrado en agar Columbia suplementado con 5% de sangre de caballo e inhibidor DENT e incubado en las condiciones descritas anteriormente. El ADN extraído se suspendió en agua destilada estéril libre de nucleasas y se procesó de inmediato o se almacenó a -20°C hasta su uso.

Genotipificación de las cepas de H pylori por PCR simple para los genes cagA, vacA y babA2. Las secuencias de los partidores utilizados, el tamaño de los productos esperados y las referencias para las condiciones de amplificación respectivas, se describen en la Tabla 1. Las muestras se amplificaron por PCR convencional, de acuerdo a las condiciones citadas en las respectivas referencias. Los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,7% (p/v) seguido de tinción con bromuro de etidio (0,5 µg/ml) y visualización mediante transiluminador UV.

Resultados

La pesquisa de genes de virulencia en aislados clínicos de H pylori, constituye una herramienta importante para caracterizar y detectar cepas específicas que presentan mayor potencial patogénico. El análisis de 66 aislados clínicos de H pylori permitió la detección de amplicones cagA, vacAs1 y vacAm1 (Figura 1). El gen cagA se detectó en 24,2% de los aislados clínicos analizados (16/66), en tanto que el gen vacAs1a se detectó en 42,4% de las muestras; vacAs1b fue detectado en 21,2% y vacAs2 en 25,8% de las muestras, respectivamente (Figura 2). Llamó la atención, el primer aislamiento de una cepa portadora del gen babA2, el cual codifica para la proteína BabA, que se ha asociado con mayor adherencia y patologías más severas. Esta cepa se consideró aislado puro, pues sólo se amplificaron los genes vacA s1a y vacA m1 en la suspensión bacteriana. Además, este aislado fue cagA+, constituyendo un genotipo de mayor patogenicidad en la especie (cagA+, vacAs1m1 y babA2+). Cabe señalar, que la presencia de cagA y babA2 no constituyen marcadores para diferenciar mezclas, lo que sí pueden sugerir los genes vacA.

Figura 1. Detección de genes de virulencia mediante PCR, en suspensiones de colonias de Helicobacter pylori obtenidas desde biopsias gástricas de pacientes con patología gastroduodenal. A) M: marcador de peso molecular (Ladder plus, Fermentas), 1: aislado clínico de Helicobacter pylori, 2 y 3: cepa ATCC 43504 (control positivo), 4: control negativo. B) M: marcador de peso molecular (Ladder plus, Fermentas), 1-5: aislados clínicos de Helicobacter pylori, 6: cepa ATCC 43504 (control positivo), 7: control negativo. C) M: marcador de peso molecular (Ladder plus, Fermentas), 1-4: aislados clínicos de Helicobacter pylori, 5: cepa ATCC 43504 (control positivo), 6: control negativo. D) M: marcador de peso molecular (Ladder plus, Fermentas), 1-3: aislados clínicos de Helicobacter pylori, 4: cepa ATCC 43504 (control positivo), 5: control negativo.

Figura 2. Distribución de los genes cagA, babA2 y vacA en suspensiones de colonias de Helicobacter pylori obtenidas desde biopsias gástricas de pacientes de la Octava Región con patología gastroduodenal.

Por otra parte, se observó amplificación simultánea de los genes s1a y s1b en 4/66 aislados clínicos de las muestras de biopsia gástrica (4,1%) y de s1 y s2, en otras 9 muestras (18%), indicativo de la presencia de más de un genotipo en la muestra de biopsia del paciente. Cinco aislados (7,6%) no amplificaron con los partidores empleados para s1a, s1b o s2. Similar a lo observado en un estudio anterior, se detectó mayor prevalencia de genotipo vacAm2 (56,1%) que de genotipo vacAm1 (31,8%) en las muestras. La amplificación simultánea de m1 y m2 fue en 5/66 aislados clínicos (7,6%), en tanto que, no hubo amplificación para m1 o m2 en el 19,7% de los aislados clínicos.

Discusión

Nuestro grupo de investigación está abocado a caracterizar cepas de H pylori que infectan a pacientes locales, en base a genes de virulencia de importancia reconocida por su asociación con patologías gastroduodenales severas23,29. También contamos con información patofisiológica útil, que puede tener implicancias clínicas significativas30, pues estudios de poblaciones de oriente y occidente señalan que los factores de virulencia de H pylori varían de acuerdo a la localidad geográfica y a la edad del individuo31. Así, se ha demostrado que los factores de virulencia difieren en las cepas obtenidas de diferentes poblaciones16,32-34. Esta diferencia en localidad geográfica se ha puesto de manifiesto en estudios en Japón, que muestran una prevalencia de babA2 cercana a 85%15, y en resultados obtenidos de población coreana, que presentaron 36,1% de cepas babA2 positivas16.

La amplificación de más de un tipo de secuencia señal o de región media de vacA en las muestras, sugiere la presencia de infección múltiple. Esto concuerda con los hallazgos de otros autores, que han detectado infección por múltiples cepas tipificadas a través de diferentes genes35-37. En forma similar a lo observado por nuestro grupo en 200123, en que se incluyeron los aislados clínicos de los años 1999-2000, las muestras de las biopsias gástricas incluidas en este estudio (años 2001-2002), mantuvieron la prevalencia del genotipo cagA- en los aislados clínicos. Resultados similares se observaron al emplear la región media del gen vacA como marcador, dado que sigue siendo prevalente entre los aislados clínicos el genotipo vacAm2. Sin embargo, hubo un marcado predominio de aislados con genotipo vacAs1 en las muestras, a diferencia de lo informado anteriormente23.

Los resultados obtenidos también muestran que 5 aislados (7,6%) presentaron un perfil genético relacionado con cepas ulcerogénicas (cagA+, vacAs1m1) y uno (1,5%), con un perfil genético presente en cepas asociadas a metaplasia o adenocarcinoma gástrico (cagA+, vacAs1, babA2+)19,21.

Estudios de genotipificación de cepas de H pylori de pacientes chilenos han mostrado que la presencia del gen cagA o de la variante alélica vacAs1, no tendrían un valor predictivo de riesgo de patologías gástricas severas. Sin embargo, cuando la cepa presenta el genotipo cagA+/vacA s1m1, habría un mayor riesgo de desarrollar enfermedad péptica ulcerosa23,24. Así, los resultados presentados sugieren la existencia de un porcentaje significativo de pacientes en la Región del Bío-Bío, con riesgo potencial de adquirir enfermedad péptica ulcerosa en base a los genotipos de H pylori. Por otra parte, resultados presentados con población de la Región de la Araucanía25, concluyen que la presencia del gen cagA o de los alelos s1/m1 del gen vacA, se correlaciona directamente con la infiltración por neutrófilos y con la severidad del daño epitelial, mientras que el genotipo vacAs2/m2 se asocia en forma significativa con daño ligero de la mucosa o ausencia de daño. Además, no se observó relación entre los alelos iceA y los hallazgos patológicos de la gastritis25.

La detección del gen babA2 en un aislado clínico de H pylori constituye el primer informe de este genotipo en población chilena. La baja frecuencia con que se detectó este gen en el estudio, sugiere que babA2 podría ser un marcador útil para predecir riesgo de adquirir enfermedades gástricas severas asociadas a H pylori, como se ha señalado en la literatura para algunos países17, ya que en nuestra población, cagA y vacA por sí solos no se asociarían con daño gástrico severo25.

En relación con la adherencia, además de BabA, se han descrito al menos 32 proteínas de membrana externa en H pylori y varias de ellas tendrían un papel en adherencia a la superficie del epitelio gástrico38. Entre éstas, se puede mencionar, a las proteínas SabA o adhesina de unión al ácido siálico; la lipoproteína asociada a adherencia, la OipA o proteína inflamatoria de membrana externa y la HpaA, que es un factor de adherencia a células sanguíneas y media la adhesión a ácido siálico38,39. Con respecto a esta última adhesina, en un estudio en que se realizó un análisis de sueros de pacientes chilenos infectados por H pylori, encontraron que HpaA, CagA y VacA son los antígenos más frecuentemente reconocidos. Este resultado sugiere que el bajo porcentaje del gen babA2 se debería a que las cepas analizadas en nuestro trabajo también podrían presentar la adhesina HpaA40.

Finalmente, la baja prevalencia del gen babA2 puede ser sugerente de su importancia como marcador específico para cepas de mayor capacidad adherente y con mayor potencial patogénico. Así, los resultados, en su conjunto, indican que las cepas de H pylori aisladas de pacientes chilenos con alguna patología gastroduodenal, tendrían un considerable potencial patogénico y que el gen bab2 debiera incluirse en los estudios de pesquisa de cepas con mayor virulencia.

 

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Recibido el 18 de agosto, 2005. Aceptado el 28 de febrero, 2006.

Trabajo financiado por Proyecto Dirección de Investigación Universidad de Concepción (DIUC): 203 036 024-1.0.

Correspondencia a: Dra. Apolinaria García. Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción. Casilla 160-C, Concepción, Chile. Teléfono: 56-(41)-204144. Fax: 56- (41)-245975. E mail: apgarcia@udec.cl

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