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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.131 n.12 Santiago dic. 2003

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872003001200002 

Rev Méd Chile 2003; 131: 1365-1374

 

Alteraciones genéticas en gastritis
crónica: Estudio de inestabilidad
microsatelital y pérdida de la
heterocigocidad

Juan Carlos Roa S, Miguel Angel Villaseca V, Iván Roa E,
Juan Carlos Araya O.

Microsatellite instability and loss of
heterozygosity in chronic gastritis

 

 

 

 

 

 

Background: Multifocal chronic gastritis, associated to intestinal metaplasia, is considered a preneoplastic lesion, closely associated to intestinal type gastric cancer. Aim: To study the frequency of microsatellite instability (MSI) and loss of heterozygosity (LOH) in areas of chronic gastritis and intestinal metaplasia in gastric biopsies of patients without cancer. Material and methods: Gastric biopsy samples from 34 patients without cancer (22 with multifocal atrophic gastritis and 12 with diffuse antral gastritis), were studied. Glands from areas of chonic gastritis and intestinal metaplasia and lymphocytes, were collected using laser microdissection of paraffin embedded samples. The analysis of 15 mono and dinucleotide microsatellites was used to assess LOH and MSI. Results: LOH and MSI were found in some of the markers in 55% (12/22) and 59% (13/22) of cases with intestinal metaplasia, respectively. Only one of 12 areas with diffuse atrophic gastritis had MSI and a different area had LOH (p <0.05 or less, when compared with areas of multifocal atrophic gastritis). Three areas of normal epithelium in patients with multifocal atrophic gastritis, also had alterations. Most of these alterations were concordant with adjacent areas with intestinal metaplasia. Conclusions: LOH and MSI was found in areas of intestinal metaplasia in more than half of the studied cases and in few areas of atrophic gastritis without intestinal metaplasia. These findings suggest that genotypic alterations may precede phenotypic modifications and that intestinal metaplasia is a preneoplastic lesion (Rev Méd Chile 2003; 131: 1365-74).
(Key Words: Gastritis; Metaplasia; Stomach Neoplasms)

Recibido el 8 de mayo, 2003. Aceptado en versión corregida el 25 de agosto, 2003.
Trabajo financiado parcialmente por proyectos DID UFRO # 2029 y FONDECYT
# 1020283.
Departamento de Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera,
Temuco, Chile.

El cáncer gástrico es la primera causa de muerte por cáncer en la población chilena, con una tasa de mortalidad de 19,5 x 100.000 en la población general y de 25,3 x 100.000 en la de sexo masculino. En la región de la Araucanía (IX) la tasa de mortalidad por esta neoplasia se eleva hasta 24,8 x 100.000 en la población general y 33,7 x 100.000 en la de sexo masculino. Con estas cifras, la probabilidad media que un chileno muera por cáncer de estómago es de alrededor de 3%, transformando a esta enfermedad en un problema de salud pública importante1.

La gastritis crónica es considerada como una lesión preneoplásica en la secuencia de eventos morfológicos y genéticos de la carcinogénesis, gástrica2. En este sentido, existe multiplicidad de datos que confirman que la gastritis multifocal atrófica (MAG)3 está íntimamente relacionada con la carcinogénesis del cáncer gástrico de tipo intestinal4. Por otro lado, la gastritis difusa antral (DAG) se asocia a úlcera duodenal sin relación aparente con evolución a cáncer gástrico5,6.

La pérdida de la heterocigocidad (LOH) es una lesión frecuente y relevante en la carcinogénesis debido a que se encuentra ligada en forma directa con la inactivación de genes supresores de tumores, favoreciendo de esta forma la proliferación neoplásica7. Existen estudios en cáncer gástrico que muestran asociación entre la presencia de LOH en genes específicos y tasas de crecimiento8, estado clínico9 y nivel de infiltración10. En neoplasias malignas de estómago se observa LOH en cerca de 30% de los casos informativos en la zona del gen APC11, en 27-35% de los casos informativos en la zona del gen DCC9, considerado como un evento tardío dentro de la progresión maligna12, y de 30% de los casos informativos en la zona del gen retinoblastoma9,13. Además, LOH también es habitual en el cromosoma 5q21, en relación a los genes APC/MCC14, tanto en cáncer gástrico como en metaplasia intestinal y en lesiones displásicas15.

La inestabilidad microsatelital (MSI) en locus cromosómicos asociados a importantes genes es un evento frecuente de la progresión de los tumores malignos humanos. Un importante grupo de los carcinomas gástricos esporádicos presentan alto índice de inestabilidad microsatelital, que es la expresión de un estado de inestabilidad genética, mediada por la inactivación del sistema reparador de ADN (Mismatch Repair System MMR), el cual está compuesto por al menos 6 genes, siendo los más importantes MLH1, MSH2 y MSH616,17. Esta inactivación ocurre tanto por mutación como por hipermetilación del área promotora génica. Aunque la inestabilidad microsatelital en sí no siempre tiene un efecto carcinogenético debido a que la mayoría de los microsatélites se encuentran en áreas no expresables de ADN, este defecto es un buen indicador del estado de estabilidad genética. La MSI puede revestir importancia cuando los microsatélites se encuentran formando parte de genes encargados de funciones celulares específicas, tales como los genes TGFb RII, BAX, E2F4 y b2 microglobulina. La presencia de MSI en estos genes ocurre en casos con alto índice de MSI y por tanto también son utilizados como test de pesquisa de casos con MSI18-21.

En el estudio de la inestabilidad microsatelital existen numerosos marcadores y aun cuando existen criterios específicos para su estudio en el cáncer de colon, éstos no están definidos para otros órganos ni para material fijado en formalina e incluido en parafina. Sin embargo, se considera que la presencia de MSI en más de 30% de los marcadores estudiados corresponde a un grupo especial con alta frecuencia de MSI relacionado con la inactivación MMR22.

Estudios pareados que incluyen áreas tumorales y áreas normales controles, demostraron inestabilidad microsatelital entre 7% y 97% de los marcadores analizados. La MSI ha sido observada en 32% de los carcinomas gástricos y en 20 a 38% de las metaplasias intestinales23-25, con una frecuencia de MSI de alto grado que fluctúa entre 10,5 y 17%. Además, se ha observado una mayor frecuencia de MSI de alto grado en los cánceres de tipo intestinal (25%) que en los carcinomas de tipo difuso (4%)26.

Se ha postulado que las vías de LOH e MSI corresponden probablemente a vías carcinogenéticas diferentes. Sin embargo, esta afirmación no es fácil de probar, debido a que en los casos de MSI de alto grado las eventuales pérdidas alélicas no debiesen ser consideradas como tales ya que por la misma inestabilidad ellas no necesariamente corresponden a tal fenómeno22.

El objetivo de este trabajo fue estudiar la frecuencia y distribución de inestabilidad microsatelital y pérdida de la heterocigocidad de pacientes portadores de gastritis atrófica multifocal en un grupo de pacientes sin cáncer, pero provenientes de una zona de alto riesgo de desarrollar cáncer gástrico.

Material y método

Selección de la muestra. Veintidós pacientes sin cáncer gástrico y con áreas de gastritis atrófica multifocal que presentaban metaplasia intestinal de tipo incompleto, identificadas mediante tinción de Azul Alcian y doce pacientes con gastritis antral difusa fueron seleccionados para el estudio. Todos los casos fueron obtenidos del archivo de biopsias endoscópicas gástricas del Departamento de Patología de la Universidad de La Frontera, Temuco, Chile. Secciones seriadas de 6 µm fueron cortadas de las muestras fijadas en formalina buffer e incluidas en parafina usando técnicas de asepsia para evitar contaminación cruzada.

Microdisección y extracción de ADN. La microdisección fue desarrollada utilizando un aparato de microdisección Láser Pixcell I (Arcturus Engineering Inc., Mountainview, CA) equipado con una fuente de bajo poder (50-mW) con un rayo láser27,28. La microdisección por captura láser (LCM) fue utilizada para seleccionar células desde secciones no cubiertas con cubreobjeto y teñidas con hematoxilina. Este procedimiento se realiza mediante la aplicación de un dispositivo plástico de calidad óptica revestido por un polímero en la zona basal de manera que las áreas donde este polímero entra en contacto con el láser se derrite momentáneamente permitiendo la adhesión y captura de grupos celulares o células aisladas en forma selectiva (Figura 1). Se microdisecó zonas de epitelio histológicamente "normal" (sin metaplasia intestinal), áreas de metaplasia intestinal y control interno dado por linfocitos del infiltrado inflamatorio. Una vez disecado el tejido se digirió en 50 a 100 µl de proteinasa K a 52°C por 16-18 h. La proteinasa K fue denaturada a 95°C por 15 min y las soluciones de ADN fueron almacenadas a _20°C.

Figura 1. Panel de cuatro microfotografías LCM. (A) Metaplasia intestinal incompleta HE X 40. (B) Sección sin cubreobjetos listo para ser colocado en el microdisector LASER. (C) Sección luego de la microdisección, mostrando las áreas faltantes. (D) Microfotografía que muestra material microdisecado en el dispositivo de captura. Obsérvese la buena delimitación de los bordes glandulares disecados.

Microsatélites seleccionados: Para los estudios de MSI y LOH se seleccionaron iniciadores ("primers") que flanquean áreas microsatelitales de tipo mononucleótidos (A)n y dinucleótidos (CA)n en regiones altamente polimorfas (Tabla 1). Los marcadores fueron elegidos en base a su proximidad con genes supresores de tumores conocidos, a la posición de supuestos genes supresores de tumores o debido a la presencia de un alto porcentaje de heterocigocidad del área microsatélital, siendo de esta manera casos informativos. Otro criterio de selección correspondió a marcadores altamente eficientes en material de archivo22,29,30.

Análisis de PCR - inestabilidad microsatelital: La reacción de polimerasa se hizo en 5 µl de templado en un volumen total de 15 µl e iniciadores en una concentración de 0,5 mmol/L. Uno de los iniciadores fue marcado con fósforo radiactivo a32 (>18x1012 Bq/mmol) con la utilización de quinasa T4. La concentración de dinucleótidos fue de 200 mmol/L cada uno y la de magnesio 1,5 mmol/L. Las temperaturas de hibridación fueron optimizadas para cada marcador. Se realizó electroforesis de los productos de PCR en geles denaturantes de formamida-urea. Los geles fueron fijados en una solución de ácido acético metanol al 10% por 12 min y luego lavados por 12 min en agua desionizada. El secado se realizó al vacío a 80°C y la exposición autorradiográfica por 12 a 24 h a temperatura ambiente.

Definición de inestabilidad microsatelital: Cambio de cualquier longitud debido ya sea a inserciones o deleciones de una unidad repetitiva mono o dinucleótida, en un microsatélite dentro una población celular (es decir tumor o metaplasia intestinal), cuando son comparados con la amplificación de ADN del tejido normal. Los casos fueron caracterizados como inestabilidad microsatelital de alto grado (MSI-H) (>30% de los marcadores analizados alterados), inestabilidad microsatelital de bajo grado (MSI-L) (<30% de los marcadores utilizados) y estabilidad microsatelital (MSS), que correspondió a todos aquellos casos que no presentaron MSI en ninguno de los marcadores22 (Figura 2).

Definición de pérdida de heterocigocidad (LOH): Un caso informativo (heterocigoto) muestra 2 alelos en la resultante autorradiografía de una mucosa no-neoplásica (control normal). La heterocigocidad constitucional fue determinada por el examen de linfocitos microdisecados estromales. La pérdida de uno de los alelos en el tejido tumoral o en la metaplasia intestinal en comparación con el control normal representa la pérdida alélica31 (Figura 3).

 

Figura 2. Placa autorradiográfica de gel de poliacrilamida mostrando MSI con los marcadores D3S1262 y D18S55. Los casos están ordenados en pares o tríos según corresponda (N=control normal del paciente (linfocitos); MN=mucosa normal; MI=metaplasia intestinal). Los asteriscos muestran las áreas de inestabilidad microsatelital en comparación con los controles internos normales representados por bandas o grupos de bandas extras en las zonas superiores.


Figura 3. Placa autorradiográfica de gel de poliacrilamida mostrando LOH con los marcadores D3S3640 y D17S250. Los casos están ordenados en pares o tríos según corresponda (N=control normal del paciente (linfocitos); NM=mucosa normal; MI=metaplasia intestinal). Los asteriscos muestran los alelos o fragmentos de alelos perdidos en áreas de metaplasia intestinal en comparación con el control interno normal. Obsérvese la pérdida alélica idéntica en las áreas de MN y MI en uno de los casos.

Análisis estadístico: Para el análisis estadístico se empleó análisis de correlación cruzada entre la frecuencia de la pérdida de la heterocigocidad en las lesiones premalignas y mucosa histológicamente normal, utilizando el test exacto de Fisher.

Resultados

La microdisección láser permitió la obtención de ADN suficiente para la amplificación en todos los casos estudiados. Sin embargo, en algunos casos en particular no se logró amplificación con la totalidad de los marcadores seleccionados.

Pérdida de la heterocigocidad (LOH). Se encontró LOH en uno de los marcadores (D3S1067) en un paciente con DAG.

Se observó LOH en 12 de 22 áreas de metaplasia intestinal (55%; Tabla 1 y Figura 2). Las regiones más frecuentemente alteradas fueron D5S346, D3S1262 y D17S250. Además, tres de las 22 áreas de metaplasias intestinales estudiadas mostraron dos o más marcadores de ADN alterados (Tabla 1). Cinco pacientes con MAG mostraron LOH en la zona de epitelio de revestimiento histológicamente normal, tres de ellos con un patrón de LOH igual en sus respectivos epitelios de metaplasia intestinal (Tabla 2).

Inestabilidad microsatelital (MSI). Uno de los doce pacientes con DAG mostró inestabilidad microsatelital en la mucosa gástrica aparentemente normal (D3S1262). Por otro lado, 3 pacientes con MAG mostraron inestabilidad microsatelital en el epitelio histológicamente normal, sin metaplasia intestinal. Dos de estos 3 casos mostraron el mismo tipo de MSI en sus respectivos epitelios con metaplasia intestinal (el otro caso no fue concluyente debido a que no fue posible obtener una amplificación de PCR en la región alterada en la respectiva metaplasia intestinal).

Algún grado de MSI fue observada en 13 de 22 áreas de metaplasia intestinal (59%; Tabla 1 y Figura 3). Las regiones más frecuentemente alteradas fueron el D3S1262, D5S346 y BAT 40. Sin embargo, todos los casos mostraron un fenotipo de inestabilidad de bajo grado (MSI-L). Además, seis de los 12 marcadores estudiados no presentaron inestabilidad microsatelital en los casos estudiados (Tabla 1).

Las diferencias encontradas en la frecuencia de al menos uno de los marcadores de LOH (p=0,05) y MSI (p=0,04) entre áreas con DAG y MAG fueron significativas (Tabla 3).

Discusión

La microdisección por captura láser fue siempre efectiva en la obtención de poblaciones celulares específicas para el análisis por PCR27. El material fijado en formalina e incluido en parafina es proclive a presentar artefactos especialmente en los estudios de LOH, lo cual se relaciona con el nivel de concentración de ADN32. Para evitar una mala interpretación de LOH o de inestabilidad microsatelital, se utilizó un mínimo de 10 ng de ADN por cada ronda de PCR de amplificación (más de 500 células por cada PCR).

La metaplasia intestinal de la mucosa gástrica es un evento clave en los modelos de carcinogénesis gástrica2. Si bien existen diferentes tipos de metaplasia intestinal en mucosa gástrica la cual depende del tipo de mucinas que se secreta, que estarían en relación con el grado de intensidad de la metaplasia y de su relación con cáncer33,34. Este aspecto no fue categorizado debido a que una subdivisión en el grupo de estudio impediría la obtención de resultados concluyentes. Un estudio previo de otros autores con pacientes portadores de gastritis crónica y metaplasia intestinal (sin cáncer) mostró casos con inestabilidad microsatelital de alto y bajo grado24. Aun cuando ninguno de nuestros casos exhibió un alto grado de inestabilidad microsatelital, 59% de las metaplasias intestinales (en pacientes sin cáncer) mostraron bajos niveles de MSI en alguno de los marcadores utilizados. Además, 55% de los pacientes con metaplasia intestinal mostró LOH, algunos de ellos presentando múltiples pérdidas alélicas.

Estos datos sostienen que una acumulación progresiva de alteraciones genéticas en áreas de metaplasia intestinal contribuye al desarrollo del cáncer gástrico, representando un importante evento molecular en la carcinogénesis gástrica en múltiples etapas. Además, este bajo nivel de inestabilidad satelital y la frecuencia de LOH se compara favorablemente con la vía carcinogenética gástrica del LOH35 por daños múltiples y no específicos sobre el ADN, provocados por factores ambientales tales como la dieta, la infección por Helicobacter pylori y la alta ingesta de sal35,36.

Las regiones más frecuentes del ADN con LOH fueron D5S346, D3S1262 y D17S250. D5S346 se encuentra localizada cerca del gen APC/MCC y D17S250 cerca del gen TP53, ambos comúnmente alterados en el cáncer gástrico de tipo intestinal15,37,38.

El gen APC/MCC (poliposis adenomatosa familiar del colon) ubicado en el cromosoma 5q21 juega un rol importante en la carcinogénesis del cáncer de colon. El locus APC ha sido relacionado a las moléculas de adhesión celular y su alteración puede favorecer la diseminación metastásica39. Además, LOH en la región 5q21 se asocia con un peor pronóstico15,40. En nuestro estudio de pacientes sin cáncer y con metaplasia intestinal demostramos un desbalance alélico (LOH) en la zona APC/MCC en 3 de 18 casos informativos (17%), dos de ellos con lesiones similares en la zona del epitelio gástrico adyacente (no metaplásico).

El 30% de los pacientes con cáncer gástrico tienen LOH en la zona del gen TP5313,37,41. El estudio actual reveló la presencia de LOH en el gen TP53 en 3 de 10 casos informativos (30%), uno de ellos con una lesión genética similar en la mucosa normal adyacente. Estos hallazgos en las zonas normales epiteliales mas los encontrados en APC/MCC y otros marcadores sugieren que las alteraciones genéticas precederían a los cambios fenotípicos de la metaplasia intestinal. Estos datos no han sido previamente descritos en la literatura. Esta disparidad puede ser explicada por el método utilizado para obtener células para los análisis de ADN, con un muy bajo nivel de contaminación del ADN provocado por células estromales tales como los linfocitos, permitiendo la exposición de lesiones genéticas sutiles en epitelios gástricos histológicamente normales.

La presencia de LOH en el gen DCC fue de 8%, por debajo de los datos descritos en cáncer gástrico avanzado42,43, indicando que estas alteraciones genéticas probablemente aparecen tardíamente durante la progresión del cáncer gástrico38.

Las regiones más frecuentemente alteradas con MSI fueron D3S1262, D5S346 y BAT40. Ninguno de los casos presentó alto grado de inestabilidad microsatelital, lo que fue concordante con los resultados del marcador BAT26 y con lo reportado en la literatura44. El microsatélite BAT26 es del tipo mononucleótido Poliadenina (A)n localizado en el quinto intrón del gen hMSH2 y es altamente sensible (93%) y específico (95%) para detectar casos con alto grado de inestabilidad microsatelital30,45-47.

Se encontró 59% de frecuencia de inestabilidad de bajo grado lo cual es similar a una comunicación de Leung en 2000 que demostró 38% de MSI-L en áreas de metaplasia intestinal de individuos sin cáncer, lo que sugiere que la acumulación de MSI en áreas de metaplasia intestinal puede contribuir al desarrollo de cáncer gástrico, representando un evento molecular importante en el modelo de carcinogénesis gástrica en múltiples etapas22.

Es interesante notar la marcada diferencia que se encontró en la frecuencia de alteraciones genéticas tanto para LOH (p=0,05) y MSI (p <0,05) en casos de DAG y MAG (Tabla 3) lo que reafirma, por un lado, la condición de lesión preneoplásica del MAG y, por otro, la condición de lesión no precursora del DAG5,6.

Los carcinomas gástricos en humanos muestran una prevalencia de inestabilidad microsatelital que varía entre 13 y 44%, la cual es mayor que cualquier otro tipo de cáncer esporádico en humanos48,49. Existen datos que indican que la hipermetilación de los islotes del CpG en las regiones promotoras del hMLH1 se encuentran asociadas en forma muy fuerte con MSI en los cánceres gástricos50-54, sugiriendo un mecanismo epigenético en la inactivación del sistema de reparación de ADN en este grupo de cánceres. Además, la hipermetilación de las regiones promotoras de MLH1 están asociadas con una pérdida del producto proteico del gen, que son eventos significativos en el desarrollo de tumores invasivos50-52.

La presencia de alteraciones genéticas en mucosas no neoplásicas ha sido previamente descrita24. Los datos confirman que estos hallazgos están presentes aun en los epitelios histológicamente normales, sin metaplasia intestinal, haciendo presumir que las alteraciones genotípicas anteceden este tipo de alteraciones fenotípicas. La alta frecuencia de alteraciones genéticas genera algunas preguntas sobre el significado e importancia de ellas. Sin embargo, es lógico suponer que la acumulación de eventos favorezca el proceso carcinogenético. Por otro lado, no todas las lesiones genéticas producidas necesariamente tendrían que desencadenar una proliferación neoplásica, ya que el epitelio gástrico tiene una de las más altas tasas de recambio celular, con una continua pérdida de células, que podrían prevenir la perpetuación de los errores y con ello prevenir la aparición de carcinomas gástricos en la mayoría de los individuos que acarrearían estos y otros daños genéticos.

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