Rev Méd Chile 2003; 131: 711-718

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

Identificación de subtipos B y F de VIH-1 en pacientes chilenos Maritza Ríos V1, Carola Villanueva C1, Carolina San Martín1, Eugenio Ramírez V1,2. Identification of B and F human immunodeficiency virus subtypes in Chilean patients

Background: Type I human immunodeficiency virus (HIV) is characterized by a great genetic variability. There are three groups of virus throughout the world: O, N and M. Group M is responsible for AIDS pandemic and is subdivided in 9 genetic subtypes. Most viral strains in South America are subtype B. Aim: To determine the frequency of HIV subtypes in Chilean patients. Material and methods: Genetic analysis of C2-V3-C3 region of the gene env in HIV strains coming from 77 Chilean subjects infected by different means. DNA heteroduplex mobility assay was used to determine HIV subtypes. Results: Sixty eight cases were infected with subtype B (88.3%) and nine cases were infected with subtype F (11.7%). Conclusions: Subtype B is the predominant HIV in Chile, but subtype F is also present (Rev Méd Chile 2003; 131: 711-8).
(Key Words: HIV infections; HIV seroprevalence; Human immunodeficiency viruses)

Recibido el 3 de diciembre, 2002. Aceptado en versión corregida el 27 de mayo, 2003.
¹Centro Nacional de Referencia del SIDA, Subdepartamento Virología,
Instituto de Salud Pública de Chile.
²Departamento Laboratorios de Salud, Instituto de Salud Pública de Chile.

El virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) es un retrovirus que se caracteriza por presentar una gran variabilidad genética. Los análisis filogenéticos del VIH-1 de las diferentes regiones geográficas han revelado que el virus puede ser dividido en tres grupos: O (del inglés outlier), N (del inglés new, no-M y no-O) y M (del inglés major)¹. Los virus pertenecientes a los grupos O y N están limitados al continente africano, con algunos pocos casos del grupo O en Europa y en los Estados Unidos. Por su parte, los virus del grupo M son responsables de la pandemia del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y están, a su vez, subdivididos en formas genéticas principales, incluyendo subtipos y sub-subtipos (A1, A2, B, C, D, F1, F2, G, H, J y K). Además, se han identificado 14 formas recombinantes circulantes (CRF del 1 al 14), virus recombinantes únicos, varios genomas aún no clasificados, así como también coinfecciones^2-4.

Los estudios de epidemiología molecular del VIH-1 en Sudamérica han demostrado que el subtipo predominante en la región es B, con la circulación restringida geográficamente de otros subtipos⁵. En Brasil se ha demostrado la predominancia del subtipo B, con la presencia adicional de los subtipos A, C, D y F^6-8. También se han descrito los virus recombinantes B/F, B/C y la coinfección por dos subtipos^3,9,10. En otros países sudamericanos también se ha descrito la circulación predominante del subtipo B. Sin embargo, en Argentina, Bolivia, Uruguay, Perú, Paraguay y Venezuela se ha detectado el subtipo F^11-13, en Perú y Guyana Francesa el subtipo A^13,14 y en Uruguay el subtipo E¹⁵. Además en Argentina, Uruguay y Venezuela se han detectado virus recombinantes B/F y CRF-012 B/F^16-20.

Aún no se comprende completamente el significado o la importancia biológica de la variabilidad genética del VIH-1. Sin embargo, se han descrito diferencias importantes entre los subtipos genéticos en propiedades biológicas como: virulencia, tropismo y transmisibilidad^21-23, utilización de los correceptores de quimoquinas²⁴, tropismo en líneas celulares²⁵, progresión en la enfermedad^25,26, susceptibilidad a algunas drogas antirretrovirales²⁷ y sensibilidad de algunos métodos de cuantificación de carga viral28,29. Estos hallazgos han llevado a las autoridades sanitarias y a la comunidad científica internacional a establecer que los programas de prevención del SIDA, y de desarrollo de vacunas efectivas contra el VIH-1, deben considerar la información epidemiológica sobre la distribución de los subtipos de VIH-1 en las diferentes regiones geográficas del mundo.

La epidemiología molecular del VIH y sus implicancias para el conocimiento epidemiológico de la pandemia, el entendimiento de la transmisión viral y la patogenia del SIDA, y el desarrollo y eficacia de vacunas y terapias antirretrovirales ha sido un tópico de gran interés científico y sanitario a nivel mundial^1,30,31. Sin embargo, hasta el momento existe muy poca información publicada sobre la epidemiología molecular del VIH-1 y sus variantes genéticas que circulan en Chile. Un estudio basado en el secuenciamiento genético del provirus de 21 pacientes infectados de Santiago determinó la presencia exclusiva del subtipo B³². Otro estudio realizado mediante tipificación de la respuesta serológica con péptidos sintéticos también detectó el subtipo B como el más prevalente en Santiago³³. Sin embargo, estos dos estudios podrían carecer de representatividad nacional por el limitado número de casos y el origen geográfico de los pacientes analizados. En nuestro trabajo presentamos la subtipificación de VIH-1 en 77 chilenos infectados, distribuidos geográficamente en todo el país.

MATERIAL Y MÉTODO

Pacientes. En este trabajo se estudiaron muestras de 77 personas infectadas con VIH-1 mediante diferentes vías de exposición. Los casos estudiados fueron obtenidos a partir de pacientes ingresados al Centro Nacional de Referencia de Retrovirus, del Instituto de Salud Pública de Chile, entre los años 1989 y 2001. Se incluyeron 43 recién nacidos que correspondieron a pacientes evaluados a través del programa nacional de vigilancia clínica-epidemiológica del SIDA pediátrico. Treinta y cuatro pacientes adultos correspondieron a personas a las cuales se les realizó el examen de confirmación de la infección del VIH-1. En todos los casos se confirmó el diagnóstico de infección con VIH-1 mediante la presencia de anticuerpos en el plasma mediante dos ensayos comerciales de ELISA y el inmunoensayo en línea Lia-tek. Además en cada caso se determinó la presencia del provirus en los PBMC mediante la detección de regiones genéticas de los genes pol y env mediante PCR.

Muestras. En cada uno de los casos se tomó una muestra de 5,0 ml de sangre con anticoagulante. Se obtuvieron las células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque³⁴. Los PBMC fueron almacenados con medio RPMI, adicionado con 10% SBF y 5% DMSO, en ambiente de nitrógeno líquido hasta los análisis genéticos.

Ensayo de Movilidad de Heterodupletes (HMA). A partir de los PBMC se obtuvo el DNA mediante extracción con el método de fenol-cloroformo. El ensayo de HMA se realizó de acuerdo a protocolos descritos³⁵. Brevemente, el primer PCR se realizó con los partidores ED5 y ED12, amplificando un fragmento de 1,2 kb de longitud que abarca el gen env desde la región V1 hasta V5. El segundo PCR anidado se ejecutó con los partidores ED31 y ED33, amplificando un fragmento de 0,5 kb de longitud que abarca la región C2-V3-C3 del gen env (Figura 1). Este fragmento amplificado se usó para subtipificar las cepas chilenas de VIH-1 por HMA. Los subtipos fueron asignados por la generación de heterodupletes con el fragmento análogo de un conjunto de subtipos de referencia internacional. El análisis de la movilidad de los heterodupletes se realizó después de una electroforesis en geles de poliacrilamida al 5%, tal como se describió previamente (Figura 2)³⁵.

Figura 1. Esquema de obtención de fragmento PCR gen env utilizado en la genotipificación de subtipos del VIH-1 por HMA.

Figura 2. Ensayo de movilidad de heterodupletes (HMA) del gen env para la genotipificación de subtipos de VIH-1. M1, muestra paciente 1 (subtipo B1); M2, muestra paciente 2 (subtipo B2); B1, B2, B3, F1 y F2, subtipos de referencia de VIH-1. Posición de hebras de DNA simples (1), heterodupletes (2) y homodupletes (3).

RESULTADOS

En este estudio analizamos el subtipo genético del VIH-1 de muestras provenientes de 43 niños nacidos de madres infectadas con VIH-1 (Tabla 1). Del total de niños analizados, 27 eran de sexo masculino y 16 de sexo femenino. El promedio de edad de este grupo fue 5,23±3,29 años, con un rango de 2 hasta 14 años. Treinta y uno (72,1%) recién nacidos residían en la Región Metropolitana, repartiéndose los otros 12 casos en 7 regiones geográficas (I, IV, V, VIII, IX, X y XI). Los análisis genéticos mediante HMA del gen de la envoltura del VIH-1 indicaron la presencia de dos subtipos virales distintos. Treinta y seis (83,7%) casos correspondieron al subtipo B y siete (16,3%) casos estaban infectados con el subtipo F. Todos los casos de subtipo F fueron adicionalmente confirmados mediante secuenciamiento genético de un fragmento de 580 pb que abarca la región C2-V3-C3 del gen de la gp 120 de HIV-1 (resultados no mostrados). En este grupo se determinó la circulación del subtipo F en niños nacidos a partir del año 1992 (paciente 8) y 1993 (paciente 11). Sin embargo, estos dos casos correspondieron a recién nacidos de una misma madre chilena que estaba radicada en Argentina y que posteriormente se trasladó a Chile. Luego, esta mujer tuvo un tercer hijo en el año 1997 (paciente 48) que constituiría el primer caso de subtipo F detectado en un niño nacido en Chile. Los otros 4 casos posteriores fueron recién nacidos sin ninguna relación epidemiológica entre ellos.

En este trabajo se estudiaron 24 casos de homo/bisexuales: 22 homosexuales y 2 bisexuales (Tabla 2). El promedio de edad de este grupo fue 37,2±12,6 años, con un rango de 19 hasta 76 años. La gran mayoría de ellos residía en la Región Metropolitana (79,2%), el resto tenía residencia en las regiones IV (1), V (2), VII (1) y XI (1). En la totalidad (100%) de estos individuos se determinó la presencia sólo del subtipo B del VIH-1.

Por otra parte, se analizaron muestras de 10 casos asociados a transmisión heterosexual, detectados entre los años 1994 y 2001 (Tabla 3). El promedio de edad de este grupo fue 32,8±7,3 años, con un rango de 24 hasta 44 años. Siete (70%) de estas personas residían en la Región Metropolitana, dos casos residían en la VII región y uno en la X región. Este grupo estaba compuesto por 5 mujeres y 5 hombres. Mediante HMA se determinó la infección de 8 personas con el subtipo B y dos con el subtipo F; un hombre y una mujer. El subtipo F más precozmente detectado fue encontrado en una muestra de una mujer en el año 1994 (paciente 22) madre de tres recién nacidos infectados verticalmente (pacientes 8, 11 y 48).

En síntesis, en este estudio se analizaron muestras de 77 casos infectados con VIH-1, distribuidos en 9 regiones de Chile. El genotipo B se encontró en 68 pacientes (88,3%) y el genotipo F en 9 casos (11,7%). El subtipo F se detectó en hijos infectados congénitamente por sus madres infectadas con VIH-1 y en pacientes heterosexuales. En los pacientes homo/bisexuales se determinó la presencia exclusiva del subtipo B (Tabla 4).

DISCUSIÓN

Los estudios de epidemiología molecular del VIH-1 en Sudamérica han demostrado que el subtipo predominante en la región es B, con la circulación restringida geográficamente de otros subtipos⁵. En Brasil, el subtipo F es el más prevalente entre los individuos infectados con VIH-1, después del subtipo B, representando entre 15 y 20% del total de infectados³⁶. Estudios recientes en aislados F de Brasil sugieren una muy baja resistencia a ciertos inhibidores de proteasa, como ritonavir e indinavir, por parte de las cepas de este subtipo³⁶. En otros países de la región también se ha descrito la circulación predominante del subtipo B, con la circulación restringida de otros subtipos, por ejemplo: F^11-13, A^13,14 y E¹⁵; junto a virus recombinantes B/F y CRF-012 B/F^16-20.

En Chile, existe muy poca información publicada sobre la epidemiología molecular del VIH-1 y sus variantes genéticas que circulan en el país. Los únicos dos estudios publicados fueron realizados con un limitado número de casos de Santiago, encontrándose fundamentalmente la presencia del subtipo B^32,33. En uno de ellos se describió la presencia de algunos pocos casos de subtipo A³³. Sin embargo, esos análisis fueron realizados mediante tipificación de la respuesta serológica con péptidos sintéticos del asa V3, metodología para la cual se ha descrito que puede tener una correlación de hasta 17% con los análisis genéticos efectuados con HMA o secuenciamiento del genoma viral. En consecuencia, internacionalmente se acepta que la subtipificación de VIH-1 mediante estudios genéticos es la más apropiada ya que se han detectado la presencia de secuencias octaméricas de aminoácidos similares en la punta del asa V3 en los VIH-1 que pertenecen a diferentes subtipos genéticos, tales como A, B, C, D, F, G y H³⁷. En estas circunstancias, el hallazgo preliminar del subtipo A en Santiago necesita ser confirmado genéticamente ya que la similitud a nivel de las secuencias de aminoácidos agrupa incorrectamente variantes de VIH-1 que pertenecen a subtipos genéticos diferentes, los cuales poseen secuencias genómicas distintas. En nuestro estudio hemos determinado por HMA que en una población de 77 casos infectados en Chile con VIH-1, 88,3% estaba infectado con el subtipo B y 11,7% con el subtipo F. El subtipo B predominó en los recién nacidos y en los casos heterosexuales, siendo el único subtipo detectado en los casos homo o bisexuales. Así, el subtipo F fue detectado en hijos infectados congénitamente y en pacientes heterosexuales. Esto epidemiológicamente es muy interesante, ya que recientemente en Argentina se determinó la presencia mayoritaria del subtipo F sobre el B en pacientes heterosexuales; a diferencia de la mayor circulación del subtipo B en hombres homosexuales³⁸. Estos resultados han llevado a plantear la hipótesis que en ese país se habrían desarrollado dos epidemias independientes de diferentes subtipos de VIH-1. Nuestros resultados en Chile muestran una circulación del subtipo F diferente a lo determinado en Argentina.

Por otra parte, aún no se entiende completamente la importancia biológica o el significado de la enorme variabilidad genética del VIH-1. Se han descrito diferencias entre los subtipos genéticos a nivel de múltiples propiedades biológicas, tales como: virulencia, progresión en la enfermedad, susceptibilidad a drogas antirretrovirales, etc^21-29. Ello ha sido motivo para desarrollar numerosos programas de vigilancia molecular de los subtipos de VIH-1 en distintas zonas geográficas del mundo. La información epidemiológica obtenida a través de estos estudios moleculares son de gran utilidad en la actualidad como un apoyo a los programas de prevención del SIDA, permitiendo conocer el comportamiento epidemiológico de la pandemia, ayudar al entendimiento de la transmisión viral y la patogenia del SIDA, y al desarrollo de vacunas y terapias antirretrovirales eficaces^1,30,31.

De acuerdo a nuestros antecedentes, este trabajo es el primer estudio publicado que demuestra la circulación en Chile de un subtipo genético de VIH-1 diferente de B, es decir el subtipo F. Además, nuestros resultados concuerdan plenamente con lo encontrado en otros países de la región que señalan la predominancia de la circulación del subtipo B. En estas circunstancias, estimamos que estos hallazgos deberían ser considerados para el diseño de estudios epidemiológicos en mayor escala en nuestro país para conocer las variantes genéticas del VIH-1 que circulan en Chile.

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Correspondencia a: Dr. Eugenio Ramírez. Departamento Laboratorios de Salud, Instituto de Salud Pública de Chile. Avenida Maratón 1000, Ñuñoa, Santiago. Teléfono: (562) 3507573. Fax: (562) 3507573. E mail eramirez@ispch.c