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Revista médica de Chile
versión impresa ISSN 0034-9887
Rev. méd. Chile v.131 n.2 Santiago feb. 2003
http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872003000200002
Rev Méd Chile 2003; 131: 135-143
Distribución de alelos de los genes |
Background: Genes for dopamine receptor DRD4 and dopamine transporter DAT1 are highly polymorphic. Two alleles of these genes, namely the DRD4.7 and the DAT1*9 are frequently associated to the attention deficit disorder with hyperactivity. In Europe, the allele for DRD4 receptor with four repetitions (DRD4.4) has the highest frequency, with a median of 69%, followed by DRD4.7, with a frequency of 15%. South American indigenous populations have higher frequencies for DRD4.7 (61%) than for DRD4.4 (29%). The ten repetition allele for DAT1 transporter has a high frequency among Europeans (72%) and Amerindians (100%). The allele DAT1*9 is the second most frequent allele. Aim: To study the frequency of DRD4 and DAT1 alleles in a Chilean population sample. Material and methods: One hundred serum samples were obtained from blood donors in two public hospitals in Santiago. Polymorphic regions for DRD4 and DAT1 were amplified by polymerase chain reaction. Results: The allele DRD4.4 had a frequency of 59% and DRD4.7 a frequency of 27%. The allele DAT1*10 had a frequency of 74%, followed by DAT 1*9, with a frequency of 23%. Discussion: In a Chilean population sample, the frequency of DRD4 and DAT1 alleles was very similar to that of European populations (Rev Méd Chile 2003; 131: 135-43).
(Key Words: Alleles; Carrier proteins; Gene frequency; Receptors, dopamine)
La importancia del neurotransmisor dopamina (DA) como regulador de diferentes funciones del sistema nervioso central es bien conocida1. La DA pertenece al grupo de neurotransmisores llamados catecolaminas, junto a la adrenalina y la noradrenalina, con los cuales comparte un grupo aromático común (3,4-dihidroxifenilo o catecol) y una cadena lateral etilamino. Si bien presentan diversas modificaciones, las tres están íntimamente relacionadas y, de hecho, forman tres eslabones seguidos en la cadena de síntesis en la cual están involucradas cuatro enzimas. La DA se sintetiza a partir de la transformación del aminoácido tirosina, como precursor, a través de dos reacciones catalizadas por dos de las cuatro enzimas participantes: la tirosina hidroxilasa (TH) participa en la síntesis de la L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), que es seguida por una descarboxilación catalizada por la L-aminoácido aromático descarboxilasa (LAAD), que produce DA2.
Los mecanismos de almacenamiento, liberación y recaptación de la dopamina son similares a los del resto de las catecolaminas.
La recaptación de DA está a cargo del transportador de DA (DAT1), una glicoproteína de la membrana plasmática que reacumula dicho neurotransmisor liberado hacia el espacio sináptico y extraneuronal por terminales en las varicosidades del axón y a través de este mecanismo regula la concentración de DA en el espacio extracelular3,4.
Una vez que la DA es liberada al espacio sináptico, se une a receptores específicos presentes en la membrana plasmática de la neurona postsináptica. Los receptores para DA, en términos de estructura bioquímica, pertenecen a una familia con siete dominios transmembrana asociados a la proteína G1. Se conocen cinco tipos de receptores dopaminérgicos, los cuales se han agrupado según homología en su secuencia nucleotídica, organización genómica, transducción de señales y distribución tisular en dos subgrupos: uno de ellos corresponde a DRD1 y DRD5 y el otro es el conformado por los receptores DRD2, DRD3 y DRD45.
Los genes involucrados en la transmisión y el metabolismo del sistema dopaminérgico han sido investigados como posibles candidatos responsables de algunos desórdenes neuropsiquiátricos6-8. La desregulación del sistema dopaminérgico ha sido relacionada con la enfermedad de Parkinson, síndrome de Gilles de la Tourette, trastorno por déficit atencional e hiperactividad (TDAH) y la generación de tumores pituitarios1. Las sustancias que causan adicción afectan principalmente al sistema mesolímbico dopaminérgico, entre otros sistemas neurotransmisores9. Los psicoestimulantes, los narcóticos y la nicotina ejercen su efecto descargando DA en el núcleo accumbens10. Cocaína y anfetamina aumentan la concentración de DA en el espacio sináptico por bloqueo de la actividad del DAT1 y reversión de la vía transportadora de éste11. Estudios de ligamiento genómico total (whole genome linkage scans) han evidenciado genes asociados a alcoholismo en el cromosoma 11p, en proximidad al receptor DRD410.
Estas evidencias dejan de manifiesto la necesidad de estudiar aspectos genéticos moleculares del sistema dopaminérgico asociados a estos trastornos. El receptor DRD2 de rata fue el primero en ser aislado12. El gen para DRD2 está compuesto de ocho exones, siete de los cuales son codificantes13. El gen DRD4, ubicado en el cromosoma 11p15.514, está compuesto por cinco exones codificantes y genera una proteína de 387 aminoácidos1. El gen DRD4 posee un polimorfismo de repetición en tandem de número variable (VNTR) en el tercer exón, que codifica para el tercer loop citoplasmático, cada repetición correspondiendo a 48 pares de bases, que se pueden repetir de 2 a 11 veces15. Por su parte el gen que codifica para el DAT1, localizado en el cromosoma 5p15.3, posee un polimorfismo VNTR en la región 3' no codificante, con unidades de repetición de 40 pb, dando origen a diez alelos diferentes según la presencia de 3 a 13 copias16. Ambos polimorfismos han sido relacionados con desórdenes neuropsiquiátricos.
Varios estudios han presentado una asociación entre el alelo de 7 repeticiones del receptor DRD4 y alteraciones como el TDAH17-28, el rasgo de personalidad "novelty-seeking" o búsqueda de nuevas emociones, que se asemeja al TDAH29,30, el rasgo "harm-avoidance" o rechazo al daño31 y el abuso de sustancias. En el caso del DAT1, también se ha especulado sobre una asociación con el TDAH32-34, el abuso de sustancias35-37 y la paranoia inducida por cocaína38. Con respecto al TDAH es importante señalar que en otros estudios no se han encontrado asociaciones tanto con DRD439-45 como con DAT114,23,26,46.
La motivación por efectuar el presente trabajo, que se inscribe en el área interfásica de la psiquiatría molecular, guarda relación con el hecho que se desconocía la distribución de los diferentes alelos de los genes DRD4 y DAT1 en la población chilena.
Nuestro estudio representa un paso previo para establecer asociaciones de trastornos neuropsiquiátricos con marcadores genéticos moleculares como por ejemplo los polimorfismos del receptor DRD4 y el transportador DAT1. Entre estos trastornos es de especial relevancia el TDAH, por su relación con conductas adictivas como alcoholismo y consumo habitual de opiáceos y cocaína en jóvenes y adultos47,48. Un tercio de los drogadictos en tratamiento tienen historial de TDAH, tres cuartos de este tercio son hombres y presentan comportamiento antisocial; además, los individuos con TDAH generalmente consumen estimulantes y alcohol de manera más temprana y severa, constituyendo el grupo de peor pronóstico49.
Material y método
Muestra poblacional. La muestra analizada corresponde a la población de Santiago de Chile. Especímenes de sangre correspondientes a cien individuos, fueron obtenidos de donantes en los bancos de sangre de los hospitales José Joaquín Aguirre y Roberto del Río, previa firma de un consentimiento informado.
Métodos utilizados. El DNA genómico se extrajo utilizando la técnica descrita por Lahiri y Numberger (1991)50. Luego se utilizó la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), para amplificar las regiones polimórficas VNTR de los genes correspondientes al receptor de dopamina DRD4 y al transportador de dopamina DAT1.
Para el VNTR del tercer exón del gen para el receptor de dopamina DRD4 se utilizó básicamente una modificación del protocolo descrito por Nanko y col, en 199351. Los partidores utilizados fueron los siguientes: 5'-AGGTGGCACGTCGCGCCAAGCTGCA-3' 5'-TCTGCGGTGGAGTCTGGGGTGGGAG-3'. La reacción de amplificación contenía 200 a 500 ng de DNA, 25 pmoles de cada primer, 1 U de Taq polimerasa (fermentas), 200 mM de cada uno de los desoxirribonucleótidos (dATP, dTTP, dCTP y dGTP), 2 mM de MgCl2, DMSO al 10% y el buffer suministrado con la polimerasa, en un volumen final de 20 µl. Algunas muestras fueron ratificadas para confirmar los datos utilizando 7-deasaGTP (50% de dGTP y 50% de 7-deaza-dGTP) en la mezcla de PCR.
Para el VNTR del transportador de dopamina DAT1 presente en la región 3' no codificante del gen, con 40 pb por unidad, la amplificación se realizó según una modificación del protocolo descrito por Sano y col (1993)52. Los partidores utilizados fueron los siguientes: 5'-TGTGGTGTAGGGAACGGCCTGAGA-3' 5'-TGTTGGTCTGCAGGCTGCCTGCAT-3'. En un volumen final de 20 µl conteniendo 200 a 500 ng de DNA, 25 pmoles de cada primer, 1 U de Taq polimerasa (fermentas), 200 mM de cada uno de los desoxirribonucleótidos (dATP, dTTP, dCTP y dGTP), 2 mM de MgCl2 y el buffer suministrado con la enzima, se llevó a cabo la reacción de amplificación.
La amplificación se realizó en un termociclador (MJ Research, Inc PTC-100) y fue común para ambos VNTR: denaturación inicial de 95ºC por 5 min, seguida de 35 ciclos (denaturación 95ºC por 1 min, apareamiento 65ºC por 1 min, extensión 72ºC por 1 min) y una extensión final a 72ºC por 5 min. Para evitar el apareamiento entre partidores fue necesario incluir un inicio a temperatura alta (hot start) de 90ºC por 6 min antes de agregar la Taq polimerasa. Los productos de amplificación fueron visualizados en geles de agarosa al 2,5% teñidos con bromuro de etidio.
Resultados
Con el objeto de comparar las frecuencias génicas correspondientes a los loci DRD4 y DAT1 obtenidos en este estudio con frecuencias descritas para otras poblaciones de interés, se comentan a continuación los resultados descritos para europeos e indígenas sudamericanos.
En efecto, para el receptor DRD4 el alelo de 4 repeticiones es el más prevalente en Europa con una frecuencia media de 69%, seguido del alelo de 7 repeticiones con una frecuencia media de 15% y en tercer lugar el alelo de 2 repeticiones con una media de 10%. En indígenas de Sudamérica la frecuencia media para el alelo DRD4.7 (61%), es superior a la correspondiente al alelo DRD4.4 (29%).
Las frecuencias del alelo DRD4.7 oscilan entre 23% y 78% en las poblaciones indígenas sudamericanas, y entre 6% y 26% en las poblaciones europeas. En el caso del receptor DRD4.4, las frecuencias publicadas varían entre 15% y 52% para indígenas sudamericanos y entre 57% y 71% para europeos (Tabla 1).
En el caso de DAT1, los estudios muestran que el alelo DAT1*10 es el más frecuente en las poblaciones europeas (52%), seguido del alelo DAT1*9 (38%). Sin embargo, en una población indígena, Mitchell et al, encontraron que el alelo DAT1*10 era posiblemente universal (100%)58 (Tabla 2).
En la población chilena, encontramos que el alelo DRD4.4 posee una frecuencia cercana a 59%, y el alelo DRD4.7, una frecuencia cercana a 27% (Tabla 1). En cuanto a DAT1, el alelo DAT1*10 posee una frecuencia cercana a 74%, seguido del alelo DAT1*9, con una frecuencia de 23% (Tabla 2). Estos resultados indican claramente que en la población chilena las frecuencias exhiben valores intermedios entre aquellos presentes en las poblaciones europeas y las indígenas.
Discusión
Si bien las frecuencias alélicas para DRD4 obtenidas por nosotros, ocupan un lugar intermedio entre las frecuencias indígenas y las europeas, se asemejan, sin embargo, mucho más a las frecuencias europeas (Tabla 1).
Hemos señalado repetidas veces que los estratos socioeconómicos bajos poseen en Chile una mayor frecuencia de genes indígenas y los altos de genes europeos. Esta tendencia es sin lugar a dudas consecuencia de la discriminación social de que fueron objeto tanto los indígenas como los mestizos durante la colonia53.
De acuerdo a estudios previos efectuados por nosotros hace tres décadas, los donantes de sangre del hospital José Joaquín Aguirre, que a la sazón constituían una buena muestra de la población del área norte de Santiago, tenían 40% de mezcla indígena. Este porcentaje habría bajado actualmente a 33%, si consideramos para el cálculo las frecuencias descritas para DRD4.4 en europeos e indígenas y desde luego, las frecuencias obtenidas por nosotros para los donantes de sangre de este hospital. Los donantes de sangre del hospital Roberto del Río aparecen con menos mezcla. El análisis efectuado con otros marcadores, como los sistemas ABO y Rh, confirma estos resultados.
Existe evidencia que apoya una determinación genética del TDAH. Son ejemplos: la segregación en familias, la correlación de ocurrencia de esta condición entre hermanos biológicos (en comparación a hermanos adoptivos) y entre gemelos y la asociación con problemas de aprendizaje60-63. Además, se han postulado diversos tipos de asociaciones genéticas, tales como la concentración del factor C4B del complemento64, la fenilquetonuria y el síndrome de fragilidad del cromosoma X65. Este trastorno también ha sido asociado a trastornos psiquiátricos bipolares66-67 y por último, al síndrome de Gilles de la Tourette68-69. Aparentemente el síndrome de Gilles de la Tourette muestra un tipo de transmisión en que si el carácter es heredado por vía materna, predominan los tics complejos; mientras que si se hereda por línea paterna, se asocia a tics verbales y a TDAH70.
Sin embargo, como se ha mencionado, las asociaciones genéticas con TDAH más importantes se relacionan a genes involucrados en la neurotransmisión dopaminérgica. En un principio se sugirió que el TDAH se asociaba a un alelo particular (A1) del receptor DRD2 de dopamina, el cual también se relacionaría a conductas adictivas y el síndrome de Gilles de la Tourette6,71-73. Sin embargo, estudios más recientes han refutado dicha asociación y han puesto énfasis en las asociaciones entre el TDAH y los polimorfismos del transportador de dopamina DAT110,32-34,63,18, y del receptor DRD4 de dopamina10,17,20,40,74,75. Es del mayor interés que dichos marcadores genéticos también se asocian a conductas adictivas10, lo que proporciona una motivación adicional para un análisis genético del TDAH.
La asociación del TDAH con el alelo DRD4.7 en poblaciones europeas abre interesantes posibilidades de estudios de asociación con este trastorno en la población chilena, puesto que el alelo en cuestión, se encuentra en frecuencias relativamente bajas (27%) (Tabla 1).
Con respecto al transportador DAT1 se manifiestan tendencias semejantes a las descritas para DRD4. Las frecuencias con que se presentan los alelos es prácticamente europea (Tabla 2). Los alelos DAT1*10 y DAT1*9 se encuentran en frecuencias apreciables siendo DAT1*10 el más frecuente. Este sistema ofrece menos perspectivas favorables para estudios de asociación debido a que el gen candidato (DAT1*10), que en Europa estaría asociado al TDAH34, presenta frecuencias demasiado altas.
No obstante esta situación, no podría descartarse a priori la existencia de alguna asociación en la población chilena, debido al desconocimiento que aún existe sobre la distribución de los alelos de este gen. Por otro lado, existe la posibilidad que el TDAH sea en realidad mucho más común en poblaciones chilenas y sudamericanas, pero que pasa inadvertido debido a falencias educacionales caracterizadas por niveles de analfabetismo, educación escolar incompleta y sistemas de evaluación menos estrictos. No cabe duda que existe al respecto un amplio campo de posibilidades de investigación que bien valdría la pena explorar.
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Agradecimientos
Este trabajo fue parcialmente financiado a través de fondos otorgados por el Instituto Milenio CBB (Estudios Avanzados en Biología Celular y Biotecnología) y el Proyecto Fondecyt # 1010816.
Agradecemos a los profesionales de Banco de Sangre de los Hospitales Roberto del Río y José Joaquín Aguirre.
Correspondencia a: Prof. Dr. Francisco Rothhammer E. Instituto Ciencias Biomédicas. Facultad de Medicina, Universidad de Chile. Independencia 1027, Santiago, Chile.
