Rev Méd Chile 2002; 130: 1201-1208

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

(Key Words: Aldosterone; Hypertension; Renin-angiotensin system; 11ß-Hydroxysteroid dehydrogenases)

Recibido el 11 de marzo, 2002. Aceptado el 23 de julio, 2002.
Departamentos de Endocrinología y Medicina Interna. Centro de Investigaciones Médicas. Escuela de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile.
Financiado por Proyecto FONDECYT 1011035

La hipertensión arterial (HTA) constituye una de las patologías más relevantes y con mayor impacto en la salud de la población mundial¹. Sin embargo, en la mayor parte de los casos aún se desconoce la etiología, permaneciendo como HTA esencial. Un subtipo de HTA esencial es la HTA hiporreninémica que se estima correspondería a 20% de la población de hipertensos². En la HTA hiporreninémica se ha planteado que la supresión de renina y la elevación de la presión arterial podrían explicarse a través de una síntesis excesiva de mineralocorticoides. Esta hipótesis fue estudiada previamente por nuestro grupo, concluyendo que alrededor de 50% de ellos (equivalentes a 10% del total de hipertensos esenciales) presentan una excesiva producción de mineralocorticoides, debido a un hiperaldosteronismo primario no diagnosticado^3,4.

Dado que la HTA hiporreninémica se presenta con el doble de frecuencia que el hiperaldosteronismo primario, se desprende que deben existir otros cuadros que expliquen el 50% restante. En la literatura se han descrito una serie de entidades que podrían generar tal efecto entre las cuales figura el déficit de la enzima 11ß hidroxiesteroide dehidrogenasa tipo 2 (11ßHSD2), las alteraciones del canal renal de sodio (ENaC) o algunos defectos de la esteroidogénesis suprarrenal^5-7.

La enzima 11ßHSD2 es la encargada de convertir el cortisol a cortisona impidiendo que éste se una al receptor mineralocorticoideo. Estudios in vitro han demostrado que el cortisol tiene la misma afinidad que la aldosterona para unirse al receptor mineralocorticoideo^5-7. Debido a que el cortisol circula en concentraciones 100 a 1.000 veces más elevadas que aldosterona, basta que existan pequeños defectos en la actividad de la enzima para que el cortisol pueda ejercer su acción en el receptor mineralocorticoideo^8-10.

La deficiencia de 11ßHSD2 puede presentarse en forma congénita o adquirida. La forma congénita se describió hace más de 30 años y se conoció como el "Síndrome de Exceso Aparente de Mineralocorticoides" (SEAM) (Figura 1). Este síndrome es transmitido en forma autosómica recesiva y se caracteriza por una HTA con renina y aldosterona suprimida de comienzo temprano, resistencia a la terapia antihipertensiva, bajo peso de nacimiento, pobre desarrollo pondoestatural y nefrocalcinosis^11-14. Además existen formas adquiridas, dentro de las cuales las más conocidas son las secundarias a la ingestión de carbenexolona, licorice y al ACTH¹⁵.

En la forma congénita del síndrome (SEAM) se han descrito una serie de mutaciones para el gen 11ßHSD2 localizado en el cromosoma 16 que determinan una actividad disminuida o ausente de la 11ßHSD2^16-21. Esta actividad puede ser detectada clínicamente por la elevación de la relación cortisol y cortisona plasmática o de sus metabolitos urinarios^22,23.

El objetivo de este trabajo es evaluar la hipótesis que un déficit de actividad de la enzima 11ßHSD2 pudiera estar presente en pacientes portadores de una HTA hiporreninémica catalogada hasta el momento como esencial. El demostrarlo será de gran utilidad para el manejo específico de estos pacientes y para el consejo genético de familiares afectados.

Figura 1. Esquema que explica la fisiopatología del síndrome de exceso aparente de mineralocorticoides. Desplazamiento de aldosterona por cortisol en la unión al receptor mineralocorticoide.

PACIENTES Y MÉTODOS

Pacientes. Se evaluaron 28 pacientes provenientes de un estudio destinado a evaluar la incidencia de la HTA mineralocorticoidea (FONDECYT 1980999 y 1011035). Todos ellos presentaban niveles bajos de actividad de renina (ARP <0,5 ng/ml/h) y aldosterona plasmática (AP <5 ng/dl). Los pacientes fueron incorporados al estudio desde los programas de atención de pacientes hipertensos crónicos de tres consultorios de atención primaria del área de La Pintana (Consultorio El Roble), La Florida (Consultorio Los Quillayes) y Puente Alto (Consultorio Pirque).

Se excluyeron a aquellos pacientes que presentaron condiciones que pudieran afectar la medición de renina como diabetes mellitus, insuficiencia renal, insuficiencia cardiaca, daño hepático crónico, endocrinopatías o drogas que disminuyeran la actividad de renina plasmática. Como controles se incluyeron a 28 sujetos normotensos que presentaban valores de ARP y AP normales, los cuales provenían del mismo grupo poblacional. Las características clínicas de los pacientes hipertensos y el grupo control normotenso se muestra en la Tabla 1. A todos los pacientes se les solicitó el consentimiento informado para participar en el estudio de acuerdo a las normas de la declaración de Helsinki y el protocolo fue aprobado por el Comité de Investigación de la Pontificia Universidad Católica de Chile.

Métodos. Todos los pacientes ingresaron a nuestro estudio entre las 9 y 10 h, después de un ayuno de 12 h. Todos ellos se encontraban con una dieta con ingesta libre de sodio. Luego de reposo de 15 min en posición sentada, se extrajo muestra de sangre desde la vena antecubital para las determinaciones de aldosterona plasmática, actividad renina plasmática, cortisol y cortisona.

La determinación de aldosterona se hizo por radioinmunoanálisis (RIA) (Diagnostic Product Corporation, Los Angeles, CA, USA). El coeficiente de variación intra e inter ensayo fue 4,9% y 8,6%, respectivamente. La actividad renina plasmática se determinó de acuerdo al protocolo de radioinmunoensayo indirecto sensibilizado, desarrollado en la Unidad de Desarrollo del Centro de Diagnóstico de la Pontificia Universidad Católica de Chile, el cual tiene una sensibilidad de 0,1 ng/ml/h, basado en método descrito previamente por Menard y cols²⁴.

La determinación de cortisol (F) se hizo por un RIA desarrollado en nuestro laboratorio usando como trazador, cortisol marcado con tritio (actividad específica 80 Ci/mmol) (Amersham, UK) y un anticuerpo anti-cortisol desarrollado en conejo (gentilmente donado por el Dr. Paul Vecsei, Universidad de Heidelberg, Alemania). El coeficiente de variación interensayo fue 7,7%. Para la medición de cortisona (E) se desarrolló una técnica de ELISA mediante el anticuerpo anti-cortisona (donado por el Dr. Celso Gómez-Sánchez, Universidad de Mississippi, USA). Brevemente, esta técnica utiliza 50 µl de suero que se agrega sobre el primer anticuerpo IgG de conejo en cabra (0,25 µg por pocillo) adherido a placas de ELISA maxi-sorp (NUNC, USA). Se lavan las placas en lavador automático FlexiWash I Plus (Asystech, Austria) y se agrega el anticuerpo de cortisona para el ensayo de competencia, se deja incubando por 12 h con una solución que contiene avidina-peroxidasa y biotina. El complejo inmune se revela con TMB y se mide la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm en lector de ELISA Metertech å960. Los coeficientes de variación intra e interensayo observados fueron 7,1% y 10,4%, respectivamente.

La técnica de ELISA fue validada por cromatografía líquida (HPLC) de acuerdo al método descrito previamente²⁵. En breve, se utilizó un equipo HPLC Waters 441 asociado a una columna Waters µ-Bondpack C-18 de 30 cm fase reversa. Las mediciones se realizaron a una longitud de onda de 254 nm. La fase móvil del HPLC consistió en una gradiente isocrática metanol:agua (60:40) con 1% tetrahidrofurano (Fischer Chemicals, USA), a un flujo de 1,2 ml/min y 1500 psi de presión interna. Los tiempos de retención observados para cortisona, cortisol y 6a-metil prednisolona (6a-MP) (estándar interno) fueron 5,6, 6,7 y 9,2 min, respectivamente. La sensibilidad del método cromatográfico fue 0,5 µg/dl para cortisona y cortisol, en tanto que para 6a-MP la sensibilidad alcanzó 1,0 µg/dl. En todas las técnicas se contó con muestras de controles positivos para SEAM diagnosticados genéticamente.

Análisis estadístico. El análisis estadístico se realizó con el software MINITAB 13 (Minitab Inc USA). La significancia de los resultados en suero de Na⁺, K⁺, ARP, AP, cortisol, cortisona y Ln (cortisol/cortisona) en el grupo de pacientes hipertensos frente a su control normotenso se analizó mediante la prueba t de Student no-pareado de dos colas. La prueba estadística de Mann-Whitney se utilizó para determinar diferencias significativas en el caso de la razón cortisol/cortisona en suero, dado que en hipertensos hiporreninémicos esta razón no tuvo una distribución normal, tal como lo demuestra la prueba de normalidad de Anderson-Darling. Se consideraron pacientes hipertensos patológicos con una probable deficiencia de 11ßHSD2 a aquellos hipertensos que tenían el Ln (cortisol/cortisona) elevado (sobre promedio normotenso +2DE). La regresión lineal de Pearson^Ò fue utilizada para evaluar la correlación de valores de cortisol y cortisona por distintas técnicas.

RESULTADOS

En los pacientes hipertensos los niveles de cortisol fueron significativamente más altos que en normotensos (11,1±3,3 vs 9,2±2,8 µg/dl; p <0,05), mientras que la cortisona fue menor pero sin alcanzar significancia estadística (3,4±1,3 vs 3,7±1,2 µg/dl; p NS). La relación cortisol/cortisona fue más alta en hipertensos que en normotensos (3,2 vs 2,6; prueba Mann-Whitney, p <0,05) (Tabla 2).

En el grupo de hipertensos, 4 de los 28 pacientes presentaron una elevación significativa del Ln (cortisol/cortisona) (1,86, 1,73, 2,07 y 2,01; VN <1,61) a diferencia de los controles en que no hubo casos de relevancia estadística. Estos 4 casos daban cuenta de la elevación del promedio de los hipertensos ya que al excluirlos se pierde la diferencia detectada en Ln (cortisol/cortisona) entre ambos grupos (1,10±0,31 vs 0,92±0,34; p NS) (Tabla 3). En el grupo control no se detectaron sujetos con valores elevados del Ln (cortisol/cortisona) o con elevación de la relación cortisol/cortisona en suero. Los valores de sodio y potasio plasmático fueron normales en todos los sujetos estudiados (Tabla 1).

Los resultados obtenidos por radioinmunoensayo y ELISA en las determinaciones de cortisol y cortisona, respectivamente, fueron validados por la técnica de cromatografía líquida HPLC. Al comparar los resultados obtenidos por ambas metodologías, el coeficiente de correlación lineal de Pearson fue 0,92 para cortisol (Figura 2) y 0,77 para cortisona (Figura 3), ambos con un p <0,05.

Figura 2. Correlación entre los valores de cortisol RIA vs cortisol HPLC, en 20 muestras escogidas al azar (r=0,92; p <0,05).

Figura 3. Correlación entre los valores de cortisona ELISA vs cortisona HPLC, en 20 muestras escogidas al azar (r=0,77; p <0,05).

DISCUSIÓN

Los resultados de nuestro estudio demuestran que sujetos afectados por una HTA hiporreninémica e hipoaldosterónica presentan valores más altos de cortisol y de la relación cortisol/cortisona en suero que los del grupo normotenso, sugiriendo que un defecto en la actividad de la enzima 11ßHSD2 pudiera jugar un rol en este tipo de hipertensión. La elevación significativa de la relación cortisol/cortisona, constatada estadísticamente como una elevación del Ln (cortisol/cortisona), en 4/28 (14,3%) sujetos fue la responsable del incremento promedio del grupo en estudio. Estos cuatro sujetos podrían presentar defectos congénitos o adquiridos que afectan la actividad de la 11ßHSD2, que podrían explicar el cuadro hipertensivo a través de un efecto mediado por cortisol actuando en el receptor de mineralocorticoides^18,26.

En Chile, los casos confirmados de la forma completa de esta enfermedad son anecdóticos, pero no ausentes, Mune y cols describió la mutación R213C en una familia chilena^18,27. De la misma forma, nuestro grupo detectó recientemente la mutación homocigota Asp223Asn en un lactante que debutó con HTA hiporreninémica asociado a bajo peso de nacimiento, pobre desarrollo pondoestatural y nefrocalcinosis (datos no publicados).

En la actualidad, la prevalencia del déficit de 11ßHSD2 en hipertensos es desconocida, sin embargo existen evidencias que la enfermedad pudiera ser más frecuente de lo esperado. Recientemente se han descrito casos de deficiencias homocigotas de la enzima que se manifiestan fenotípicamente sólo por hipertensión arterial hiporreninémica sin la concomitante nefrocalcinosis ni pobre desarrollo pondoestatural que acompañan al síndrome clásico^15,28. Más aún se han comunicado casos de sujetos heterocigotos que pueden presentar sólo hipertensión leve²⁹. Por otra parte, observaciones clínicas y estudios in vitro han demostrado que existe una fuerte correlación genotipo-fenotipo en los casos detectados determinados fundamentalmente por mutantes de la enzima con actividad parcial^30-32.

En nuestra casuística, la prevalencia de la hipertensión arterial hiporreninémica no mediada por aldosterona alcanza alrededor de 7%³, de éstos, de confirmarse los casos comunicados en este trabajo, 14% podría corresponder a alteraciones de la enzima 11ßHSD2 (1% del total de los hipertensos). La respuesta a dexametasona, así como el estudio molecular del gen que codifica para esta enzima podrá definir si estos sujetos presentan realmente el defecto clínico y congénito.

La importancia de conocer la prevalencia de esta enfermedad radica en la posibilidad de instaurar tratamientos específicos para el cuadro hipertensivo en los sujetos afectados²⁷, es fundamental contar con métodos de screening eficientes y sencillos de realizar. De allí, la importancia de la técnica de ELISA desarrollada para la determinación de cortisona en este estudio (no publicada previamente), ya que permite trabajar con un gran número de mediciones en forma simultánea utilizando una cantidad mínima de suero de cada paciente. El anticuerpo desarrollado anti-cortisona permite la identificación de casi la totalidad de la cortisona de la muestra y la reacción cruzada con otros esteroides es mínima (0,1-0,2%). Las mediciones de cortisona con la técnica innovada en nuestro laboratorio fueron confirmadas por determinaciones en paralelo por cromatografía líquida HPLC, donde el coeficiente de correlación lineal de 0,77 señala una adecuada reproducibilidad y confiabilidad de la medición de cortisona por ELISA. La técnica de HPLC, por su parte, tiene la ventaja de medir los dos esteroides simultáneamente y goza de una gran reproducibilidad interensayo (CV 6%) a concentraciones superiores a 1 µg/dl, pero presenta el inconveniente de la laboriosa extracción de esteroides por solventes orgánicos.

En los pacientes hipertensos en los que no se demostró un defecto de la 11ßHSD2, es posible plantear otros cuadros que puedan explicar la supresión de renina y aldosterona. El Síndrome de Liddle es uno de ellos, en el cual se afecta el canal de sodio renal (ENaC), el cual puede sufrir mutaciones favorables en su gen que determinan una activación constitutiva del canal, permitiendo una mayor reabsorción de sodio y agua, y así favoreciendo el desarrollo de la hipertensión arterial³³. Por otra parte, las alteraciones en la esteroidogénesis suprarrenal secundaria a defectos en la 11ß y 17a-hidroxilasa también pueden determinar la aparición de HTA a través de un aumento de la síntesis de deoxicorticosterona, la cual ejerce su acción a nivel del receptor mineralocorticoideo gatillando la misma cascada de eventos descritos en el cuadro anterior.

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Agradecimientos

Los autores agradecen a la Srta. Doris Haack, del Departamento de Farmacología de la Universidad de Heidelberg Alemania, por su generosa donación de los anticuerpos utilizados en este trabajo.

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Correspondencia a: Dr. Carlos Fardella. Departamento de Endocrinología. Facultad de Medicina. Pontificia Universidad Católica de Chile. Lira 44 2° piso, Santiago, Chile. Teléfono: (562) 686-3095. E-mail: cfardella@med.puc.cl