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Revista médica de Chile

Print version ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile vol.130 no.10 Santiago Oct. 2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872002001000005 

Rev Méd Chile 2002; 130: 1113-1123

Frecuencia de la mutación 185delAG en el
gen BRCA1 en mujeres chilenas sanas con
antecedentes familiares de cáncer de mama

Lilian Jara S1*, Sandra Ampuero Ll2**,
Lorena Seccia T3***, Mario Bustamante P6*,
Rafael Blanco C5**, Eudocia Santibáñez V4*,
José Miguel Reyes V***, José Manuel Ojeda F4**.

Frequency of the 185delAG mutation in the
BRCA1 gene in Chilean healthy women with
family history of breast cancer

Background: Breast cancer is the most common malignancy among women, and is the second cause of cancer mortality among Chilean women. Female mortality due to breast cancer in Chile has shown a steady increase from 9.5 deaths per 100.000 women in 1985 to 12.8 deaths per 100.000 in 1995. A family history of breast cancer is one of the main risk factors for the development of the disease. BRCA1 and BRCA2 are two major hereditary breast cancer susceptibility genes. Mutations in these genes are associated to inherited breast cancer; 664 predisposing mutations have been described, but in specific populations only some of them, such as 185delAG have been found to be associated with susceptibility to breast cancer. Aim: To establish the frequency of the 185delAG mutation in the BRCA1 gene in Chilean healthy women with a family history of breast cancer. Patients and Methods: The 185delAG mutation was studied by mismatch polymerase chain (PCR) reaction in 382 Chilean healthy women with at least two relatives affected with breast cancer. The PCR products were digested with the restriction enzyme HinfI. Digestion of the normal allele (170 pb fragment) produces a 150 pb fragment; the PCR product for the mutant allele does not contain a site for HinfI and therefore remains as a 170 bp fragment after digestion. Results: One of the 382 healthy women presented the fragment of 170 pb after digestion with HinfI suggesting that she was heterozygous carrier for this mutation. The mutant patient had a mammography without suspicion of cancer. Conclusions: The frequency of the 185delAG mutation in BRCA1 was 0.26% (1/382) in Chilean healthy women with a family history of breast cancer (Rev Méd Chile 2002; 130: 1113-23).
(Key Words: Breast neoplasms; Genes, structural, neoplasm; Mutation; Mutation, analysis)

Recibido el 25 de febrero, 2002. Aceptado el 13 de agosto, 2002.
Trabajo financiado por: Proyecto Fondecyt 1010800 y Avon Breast Cancer Cruzade-CONAC.

*Programa de Genética Humana, Instituto de Ciencias Biomédicas,
Facultad de Medicina, Universidad de Chile.
**Centro de Prevención del Cáncer, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.
***Corporación Nacional del Cáncer (CONAC).
1 Doctor en Biología, Mención Genética
2 Bioquímico, Candidata a Doctor en Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile
3 Técnico en Microbiología
4 Bioquímico
5 Cirujano Dentista
6 Alumno de Biotecnología, Facultad de Medicina, Universidad de Chile

El cáncer de mama ocupa el tercer lugar en frecuencia del total de pacientes con cáncer en el mundo y más de seiscientos mil nuevos casos se informan cada año. En países en desarrollo es el segundo cáncer más común1. En Chile aún no se ha determinado su real incidencia, ya que no se ha establecido la notificación obligatoria de esta enfermedad. El artículo de Peralta et al, 19952 informa que el cáncer de mama representa la tercera tasa de mortalidad, luego del de vesícula biliar y del gástrico, sobrepasando la del cáncer de cuello uterino. La mortalidad debida a cáncer de mama ha ido aumentando, desde 9,5 muertes por 100.000 mujeres en 1985 a 12,8 por 100.000 mujeres en 19952. La sobrevida del cáncer de mama ha aumentado considerablemente en los últimos 30 años3, lo que se atribuye al diagnóstico precoz, gracias al uso de la mamografía. Aunque este examen es útil en el cáncer de mama ya establecido, no permite identificar la población en riesgo. En consecuencia, uno de los mayores desafíos de la investigación clínica actual es identificar las modalidades de prevención que permitan la reducción de la morbilidad y mortalidad asociadas a un alto riesgo a desarrollar cáncer de mama.

Son factores de riesgo para el desarrollo de este cáncer: edad, factores hormonales e historia familiar (predisposición genética), siendo este último uno de los más importantes. Existen informes que datan del año 1951 en los archivos médicos del Instituto Curie, que ejemplifican la relación entre historia familiar y desarrollo del cáncer de mama. Se ha estimado que la predisposición genética es responsable de 5-10% de todos los cánceres de mama y de aproximadamente 25% de los casos diagnosticados antes de los 30 años4-6. Una mujer con un pariente en primer grado con cáncer de mama, tiene un aumento en el riesgo de desarrollarlo. El riesgo es aún mayor si más de un pariente en primer grado ha presentado la enfermedad, o si el pariente la ha desarrollado a edad temprana, o si el cáncer ha sido bilateral. En consecuencia, es muy importante que se realice una estimación lo más exacta posible del riesgo, en mujeres con historia familiar de cáncer de mama6.

Las características de la predisposición genética incluyen herencia autosómica dominante, alta penetrancia (es decir el riesgo de cáncer de mama para una mujer portadora está en el rango de 67% a los 70 años y de 80% a los 80 años), frecuencia génica de 0,003 y frecuencia de portadoras de 0,0067,8. Considerando los datos anteriores 1 en 20 mujeres con cáncer de mama es portadora de predisposición genética y en la población general lo sería 1 de cada 200 mujeres. Estas frecuencias hacen que el cáncer de mama sea una de las patologías hereditarias de más amplia distribución.

Entre los genes, cuyas alteraciones se han asociado con alto riesgo para el desarrollo de cáncer de mama están los genes supresores de tumores BRCA1 y BRCA2, aproximadamente 90% de los cánceres de mama hereditarios presentan mutaciones en estos genes9. Las mutaciones en otros genes de susceptibilidad, tales como p53, ATM, PTEM o MSH2, MLH1, PMS1, PMS2, MSH3 y MSH6 también pueden conferir predisposición al desarrollo de la enfermedad10. Sin embargo, estos genes son responsables de sólo una pequeña proporción de los cánceres de mama no asociados a BRCA1 o BRCA211. Recientemente, se ha sugerido la existencia de un tercer gen de susceptibilidad para cáncer de mama, BRCA3, y se han realizado estudios de ligamiento con los locus 8p12-22 y 13q21. Los resultados obtenidos por el Breast Cancer Linkage Consorting (2002), en una gran serie de familias, no encontraron contribución significativa del locus 8p12-22, ni ligamiento con 13q2112. En consecuencia, BRCA3 aún no se ha identificado.

La localización cromosómica de BRCA1 y BRCA2 se logró mediante análisis de ligamiento en familias con múltiples casos de cáncer de mama. En 1994, Miki et al13, identificaron BRCA1 mediante clonamiento posicional en 17q12-21. En ese mismo año se ubicó BRCA2 en 13p12-1314. BRCA1 posee 22 exones en 89 kb de DNA genómico, los que transcriben un RNAm de 7,8 kb, el que traduce una proteína de 1863 aminoácidos. BRCA2 tiene 10.443 nucleótidos y 26 exones distribuidos en 70 kb de DNA genómico. El gen codifica por una proteína de 3.418 aminoácidos15,16.

En BRCA1 y BRCA2, se ha descrito un alto número de mutaciones asociadas a la enfermedad, las que dan cuenta de 45% y 35% respectivamente de los cánceres de mama heredados. En mayo de 2000 la base de datos del Breast Cancer Information Core (BIC), central de datos establecida por el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano (NHGRI, USA), incluía 1.070 variantes diferentes en BRCA1 y BRCA2 de las cuales 664 estaban asociadas con efectos deletéreos. En BRCA1 49% son mutaciones que producen cambios en el marco de lectura y 66% de éstas son causantes de cáncer. En BRCA2, las mutaciones que producen cambios en el marco de lectura corresponden a 35% y 43% de ellas son responsables de desarrollo de cáncer15.

La base de datos del BIC indica que las mutaciones con el mayor número de registros son: a) deleción de AG en el codón 185 del exón 2 del gen BRCA1 (185delAG) con 359 registros; b) la inserción de C en el codón 5382 del exón 20 del gen BRCA1 (5382insC) con 200 registros y c) la deleción de una timina en el codón 6174 del exón 11 del gen BRCA2 (6174delT) con 135 registros.

En Chile se han iniciado los estudios genético-moleculares para identificar las mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 asociadas a enfermedad en su población. Trincado et al (1999)17 realizaron un screening de la mutación 185delAG en 15 pacientes con cáncer de mama familiar y en 40 pacientes con cáncer de mama esporádico, sin lograr detectar dicha deleción en el grupo analizado.

El objetivo del presente trabajo fue determinar la prevalencia de la mutación 185delAG en 382 mujeres chilenas sanas, con al menos dos parientes con cáncer de mama.

PACIENTES Y MÉTODOS

Pacientes: La muestra incluyó 382 mujeres chilenas sanas que participaron en la primera campaña de prevención del cáncer de mama, organizada por la Corporación Nacional del Cáncer (CONAC). El rango etario de la muestra fluctuó entre 20 y 80 años (x=45,8). Los criterios de inclusión fueron: a) mujeres sanas sin diagnóstico de cáncer de mama; b) edad no inferior a 20 años; c) acreditar dos o más familiares afectados con cáncer de mama de un mismo linaje (misma línea familiar materna o paterna), lo que fue comprobado mediante certificado médico y/o de defunción. Todas las participantes firmaron un consentimiento informado, en el que se explicaban los objetivos del estudio y la confidencialidad de los resultados.

Extracción de DNA de sangre periférica: A cada mujer incorporada al estudio se le extrajeron 7 ml de sangre periférica utilizando tubos al vacío con EDTA como anticoagulante. El DNA genómico total se obtuvo utilizando el método de Chomczinsky et al (1997)18 con modificaciones, luego de lo cual se midió densidad óptica a 260/280 nm, para establecer la concentración de DNA y el grado de pureza.

Análisis de la mutación 185delAG: Para detectar la mutación 185delAG se utilizó la técnica de mismatch PCR que consiste en cambiar una base en uno de los partidores de modo de generar un fragmento que difiere en una base respecto del DNA templado. A consecuencia de lo anterior, el producto de PCR del alelo normal adquiere un sitio de restricción que no está presente en el alelo mutante. Las amplificaciones se realizaron en 50 µl de reacción conteniendo 200 ng de DNA genómico, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 40 pmoles de cada partidor, y 1,5 U de Taq polimerasa. Se utilizaron los partidores y las condiciones de amplificación descritas por Abeliovich et al, 199719. Los productos de PCR fueron digeridos con la endonucleasa de restricción HinfI durante dos horas a 37°C. Para detectar la presencia de la mutación se utilizó electroforesis en geles de agarosa al 2%, en los cuales se cargó una muestra del amplificado sin digerir y una segunda muestra del amplificado digerido con HinfI de cada individuo. Los geles se corrieron en tampón TBE a 5V/cm2; al finalizar la corrida se tiñeron con bromuro de etidio y se obtuvo registro fotográfico. La técnica usada genera dos bandas de 150 pb y de 20 pb para el alelo normal y sólo una de 170 pb para el alelo mutado, pues la enzima de restricción no corta el producto amplificado si está presente la mutación. La banda de 20 pb no la discrimina un gel de agarosa al 2%. Como control positivo se utilizó una muestra mutada gentilmente donada por la Dra. Sabine Pages, Instituto Curie, París, Francia. La Figura 1 muestra un esquema de la técnica de mismatch PCR, con los fragmentos que se obtienen al digerir con HinfI el amplificado por PCR del sector que incluye al exón 2 del gen BRCA1.

Figura 1. Esquema de la técnica de mismatch PCR aplicada a un sector genómico que incluye el exón 2 del gen BRCA1. a) partidores utilizados, *indica el sitio en que se cambió una base nitrogenada; b) tamaño del amplificado; c) fragmentos obtenidos al digerir una muestra normal con la endonucleasa HinfI; d) fragmento obtenido al digerir con HinfI una muestra con la mutación 185delAG.

La confirmación de la mutación 185delAG fue realizada por: a) amplificación del exón 2 del gen BRCA1 y separación de los productos de PCR en geles denaturantes de poliacrilamida, b) Hibridación Alelo Específica (ASO) y c) secuenciación directa.

Amplificación por PCR del Exon 2 del Gen BRCA1. Las amplificaciones se realizaron en 50 µl de reacción conteniendo 200 ng de DNA genómico, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 0,2 mM de cada dNTP, 50 pmol de partidores (5' GAA GTT GTC ATT TTA TAA ACC TTT, 5' TGT CTT TTC TTC CCT AGT ATG T) y 1,5 unidades de Taq polimerasa. Los ciclos termales se iniciaron con 3 min de denaturación a 94°C, seguidos por 30 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min a 55°C y 1 min a 72°C y 10 min extensión final a 72°C. Para comprobar que la amplificación fue exitosa, 10 µl del producto se sometieron a electroforesis en geles de agarosa 2,0%, utilizando Ladder 100 pb como marcador de peso molecular.

Electroforesis en geles denaturantes de acrilamida-bisacrilamida. Para detectar la mutación 185delAG, 2 µl del producto de amplificación del exón 2 del gen BRCA1 se sometieron a electroforesis en geles denaturantes de acrilamida-bisacrilamida al 5%, utilizando Ladder 25 pb como marcador de peso molecular. La corrida se efectuó a 1800 V por 120 min y los geles se tiñeron con plata para visualizar los amplificados.

Hibridación Alelo Específica (ASO). La técnica de hibridación alelo específica consta de las siguientes etapas:

a) Transferencia del DNA a soporte sólido mediante la técnica de Dot Blotting

Los productos de PCR fueron transferidos a membranas de nylon Z-probe GT, utilizando la técnica de DNA Dot Blotting. La transferencia se realizó en un aparato de Dot Blott de 96 pocillos, en el que se colocó una membrana de tamaño adecuado, previamente humedecida por inmersión durante 10 min en una solución 0,4 M Tris-HCl (pH 7,5). A cada pocillo se transfirieron 50 µl de una mezcla que contenía 5 µl del producto de PCR y 55 µl de 0,4 M NaOH, 25 mM EDTA pH 8,0 (Solución Denaturante), luego de lo cual se aplicó vacío para transferir las muestras al filtro. Una vez finalizada la transferencia, la membrana se envolvió en papel absorbente y se incubó a 80°C durante 30 min. Las membranas se pueden guardar en bolsas de hibridación, en oscuridad.

b) Marcación del oligonucleótido en el extremo 3'0H con digoxigenina-11-dd UTP

Para la identificación de la mutación 185delAG se utilizó el oligonucleótido AAAATCTTAGTGTCCCATC que tiene la deleción AG y que hibrida con la secuencia mutada. El oligonucleótido se marcó en el extremo 3'0H con digoxigenina-11-dd UTP de acuerdo al protocolo recomendado por los proveedores (Boehringer Mannheim). La marcación se realizó en 20 µl de reacción que contenían 5 pmol/ul de oligonucleótido, 5 mM CoCl2, 0,05 M de digoxigenina-11-dd UTP, 2,5 unidades de transferasa terminal y 1x de buffer de reacción (1M cacodilato de potasio, 125 mM Tris-HCl, 1,25 ng/ml de albúmina de suero de bovino, pH 6,6). La mezcla se incubó a 37°C por 15 min. Al término de la incubación, el tubo se colocó en hielo y se agregó 1 µl de 200 mM EDTA pH 8,0 para finalizar la reacción de marcación.

c) Hibridación de los filtros con el oligonucleótido marcado con digoxigenina-11-dd UTP

La membrana se colocó en una bolsa de hibridación y se agregaron 20 ml por cada 100 cm2 de membrana de 5x SSC, 0,1% de N-laurilsarcosina, 0,02% SDS y 1% de reactivo de bloqueo disuelto en ácido maleico (buffer de hibridación). La membrana se incubó a 40°C durante 1 hora para prehibridar. Luego se desechó la solución y se agregaron 20 ml de buffer de hibridación conteniendo 200 ng de oligonucleótido marcado con digoxigenina-11-dd UTP. Se eliminaron las burbujas de aire y se procedió a sellar la bolsa, la que se incubó a 40°C durante 15 horas. Al término de la incubación se desechó el líquido y se realizaron 4 lavados. Los 2 primeros con 0,3 M NaCl, 30 mM citrato de Na pH 7,0, cada uno durante 5 min a temperatura ambiente y los 2 últimos en 75 mM NaCl, 7,5 mM citrato de Na pH 7,0 cada uno durante 15 min a temperatura ambiente. Las membranas se secaron en papel absorbente.

d) Detección de la hibridación mediante quimioluminicencia

Los resultados de la hibridación se detectaron mediante quimioluminicencia utilizando CSPD como sustrato quimioluminicente y el protocolo recomendado por los proveedores (Boehringer Manheim). La membrana se incubó durante 1 min en 100 mM ácido maleico, 150 mM NaCl pH 7,5, 0,3% tween 20 (buffer de lavado). Luego se colocó en una bolsa de hibridación, se agregaron 20 ml de solución de bloqueo (1% p/v de reactivo de bloqueo disuelto en ácido maleico) y se incubó con agitación durante 30 min a temperatura ambiente. Al término de la incubación se desechó el líquido, se agregaron 20 ml de solución de bloqueo con anti-digoxigenina-AP (anticuerpo) 1:10,000, y se incubó con agitación durante 30 min a temperatura ambiente. Luego de descartar la solución de anticuerpo, la membrana se lavó dos veces en 20 ml de buffer de lavado por 15 min cada vez. Posteriormente, la membrana se colocó en 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl pH 9,5 (buffer de detección) durante 2 min para luego colocarla en una nueva bolsa de hibridación y agregar 0,5 ml de CSPD 1:100 en buffer de detección, esparciéndolo sobre toda la membrana y creando un sello líquido sobre ella. Luego se procedió a sellar la bolsa de hibridación. Para la detección de la señal quimioluminicente, la membrana se expuso a películas autorradiográficas (Kodak X-OMAT) con pantalla intensificadora, por períodos de tiempo variable, dependiendo de la intensidad de la señal. Luego del revelado, se determinó en cada individuo la presencia o ausencia de la mutación.

Secuenciación directa

La mutación fue confirmada luego de secuenciación directa del producto del PCR del exón 2, la que fue realizada en el Servicio de Secuenciación de la Universidad Católica de Chile.

RESULTADOS

Luego de realizado el análisis molecular a las 382 mujeres incorporadas al estudio, en 381 de ellas se obtuvo una banda de 170 pb en la muestra no digerida y dos bandas de 150 pb y de 20 pb en la muestra digerida con HinfI. Este resultado permitió clasificarlas como homocigotas normales. Una paciente presentó un perfil electroforético que permitió clasificarla como portadora de la deleción 185AG, obteniéndose una banda de 170 pb en el amplificado sin digerir y dos bandas en el amplificado diferido con HinfI, una de 170 pb y otra de 150 pb. La Figura 2 muestra una electroforesis en gel de agarosa (2%) de DNA genómico amplificado por mismatch PCR y digerido con HinfI, en la cual se observan las bandas presentes en la paciente portadora de la mutación en estudio. La frecuencia de la mutación 185delAG fue 0,26% para el grupo analizado.


Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa (2%) de DNA genómico amplificado por mismatch PCR y digerido con HinfI para detectar la mutación 185delAG (gen BRCA1, exón 2). a) Muestra normal sin digerir; b) muestra normal digerida; c) marcador de peso molecular (DNA Step Ladder 25 pb); d) muestra mutada digerida; e) control positivo digerido.

En relación con la probando portadora de la deleción 185AG, su estudio mamográfico fue informado con BIRADS 2, (BIRADS: Breast Imaging Reporting and Data System, clasificación establecida por el Colegio Americano de Radiología), hallazgo altamente benigno, patrón mamario denso moderado sin signos sospechosos con indicación de mamografía luego de un año.

La Figura 3, muestra la reconstitución genealógica de la familia del probando portador de la mutación. La familia presenta dos casos de cáncer de mama (II-1 y III-1), un caso de cáncer prostático (II-2) y un caso de cáncer uterino (I-2). La madre desarrolló cáncer de mama a los 62 años y tuvo 2 hijas, una de ellas corresponde al probando, que es sana pero portadora de la mutación y la otra (III-1) que desarrolló cáncer de mama a los 38 años efectuándose mastectomía de mama derecha. El estudio molecular realizado a la hermana del probando, también detectó la mutación 185delAG.


Figura 3. Genealogía de la familia del probando portador de la mutación 185delAG (exón 2, gen BRCA1).

La presencia de la mutación en ambas pacientes fue confirmada por a) amplificación del exón 2 del gen BRCA1 y detección de la mutación por electroforesis en geles de poliacrilamida denaturantes, b) Hibridación Alelo Específica (ASO) y c) secuenciación directa. La Figura 4 muestra los resultados obtenidos, utilizando la técnica señalada en el punto a, ambas pacientes son heterocigotas para la mutación observándose en cada caso un patrón electroforético con dos bandas, una de 256 pb, que corresponde al amplificado sin la deleción y otra banda de 254 pb que corresponde al amplificado con la deleción de 2 pb, el patrón electroforético de las pacientes es igual al observado en el control positivo. La Figura 5 muestra la confirmación de la mutación por ASO, en la que se observa que el oligonucleótido con la deleción AG hibrida con el DNA del amplificado del exón 2 de las pacientes y del control positivo, observándose las manchas que evidencian dicha hibridación, la que no se observa en los controles negativos. La Figura 6 muestra la secuenciación directa del producto de PCR del exón 2, en la que se observa la deleción de 2 pb (AG) en el exón 2 de BRCA1, de los nucleótidos 185-186, lo que produce la formación de TGA en el codón 39. Junto con la muestra se secuenció el producto de PCR del control positivo, cuyo perfil resultó idéntico al de la muestra.


Figura 4. Electroforesis en gel denaturante de acrilamida bisacrilamida (5%). El carril 1 muestra el marcador de peso molecular (DNA Ladder 25 pb). Los carriles 2 y 6 muestran individuos normales homocigotos que presentan una banda de 256 pb. Los carriles 3 y 4 muestran el DNA del probando (individuo III-2) y de su hermana (individuo III-1), las que son heterocigotas para la mutación 185delAG y presentan una banda de 256 pb que corresponden al cromosoma normal y otra de 254 pb que corresponde al cromosoma con la deleción de 2pb. El carril 5 muestra el DNA del control positivo.


Figura 5. Hibridación alelo específica (ASO) realizada con un oligonucleótido específico para la mutación 185delAG, marcado con digoxigenina-11-dd-UTP. La membrana se hibridó durante toda la noche a 41°C. Las manchas (spots) A5 a A8, D11 y D12 corresponden a controles positivos. Las manchas B1 a B3, C9, C10 y D1 a D6, corresponden a muestras de las pacientes estudiadas (III-1 y III-2 según genealogía Figura 3).


Figura 6. Perfil de secuenciación que muestra la deleción de 2pb (AG) en el exón 2 de BRCA1 en los nucleótidos 185-186, que produce la formación de TGA en el codón 39.
DISCUSIÓN

En la población chilena, la mutación 185 delAG no ha sido descrita hasta el momento. El trabajo realizado por Trincado et al, (1999)17, analizó la presencia de la deleción 185AG en mujeres chilenas con cáncer de mama, 15 de ellas con historia familiar positiva y otras 40 con cáncer de mama esporádico, la mutación no se detectó en ninguna de las mujeres estudiadas. En el presente estudio, realizado en 382 mujeres sanas con antecedentes familiares para cáncer de mama, la mutación 185delAG se detectó por primera vez en la población chilena en 1 de las 382 mujeres (0,26%).

La mutación 185delAG es una de las más estudiadas en diferentes poblaciones, siendo además una de las tres mutaciones con más alta prevalencia de acuerdo a los registros del BIC. En judíos Ashkenazi, la deleción 185AG es la alteración más frecuente y se la detecta en aproximadamente 15% de los pacientes afectados con cáncer de mama familiar. En mujeres judías con cáncer de mama bilateral 18,2% (10/55) presentaron la mutación y ésta se asoció con edad de inicio temprano y mostró asociación significativa con historia familiar20. El grupo de Van Der Looij et al. (2000)21 estudió la prevalencia de la mutación 185delAG en 500 mujeres húngaras con cáncer de mama, no seleccionadas por historia familiar ni edad de diagnóstico y en 350 mujeres controles. La mutación 185delAG sólo fue detectada en 1 de las 500 mujeres con cáncer de mama (0,2%) y en ninguna de las mujeres controles.

La población chilena contemporánea es el resultado de la mezcla de poblaciones amerindias (mongoloides) y españolas (europeos caucásicos), la que se inició en el siglo XVI. Migraciones posteriores (siglo XIX) de germanos, italianos, árabes y croatas, tuvieron un impacto menor en la población; además, se localizaron en regiones específicas del país. En Chile, las relaciones de etnicidad, mezcla amerindia, marcadores genéticos y estratos socioeconómicos se han estudiado en forma exhaustiva22-24.

La mutación 185delAG también ha sido estudiada en población española. El grupo de Osorio et al (1998)25 detectó la deleción 185AG en 2 de 87 familias con cáncer de mama y/u ovario, lo que permitió calcular una frecuencia de 2,3%. Los autores concluyeron que esta mutación no es recurrente en población española. El estudio de Diez et al (1999)26 realizado en 159 mujeres españolas con cáncer de mama diagnosticado antes de los 40 años, identificó 3 mutaciones germinales en BRCA1 y sólo una de ellas, la deleción 185AG, con una frecuencia de 0,63% correspondía a una mutación previamente descrita en otras poblaciones. Los autores plantean que la ausencia de mutaciones recurrentes o de mutaciones descritas en otras poblaciones, con excepción de la 185delAG, muestra la influencia del origen étnico y geográfico de la población estudiada. En otro estudio de Diez et al (1999)27 realizado en 298 mujeres españolas con cáncer de mama, la frecuencia de la mutación 185delAG fue 0,7% (2/298); una de las mujeres mutadas presentaba ancestros judíos, de origen sefardita. El artículo de Blesa et al (2000)28 informa los resultados del análisis de mutaciones en BRCA1 en 51 mujeres con cáncer de mama con historia familiar, el estudio detectó 7 mutaciones de corrimiento de marco de lectura (15%), de las cuales la más frecuente fue la 185delAG, la que se detectó en 4 de las 51 mujeres (7,8%). Los autores concluyen que las mutaciones en BRCA1 serían responsables del cáncer de mama familiar en una fracción de las familias españolas, en forma similar a lo observado en otros países. El trabajo de Llort et al (2002)29 analiza la frecuencia de 14 mutaciones recurrentes en BRCA1 y BRCA2 en 42 familias españolas con cáncer de mama/ovario. En estas familias se detectaron sólo dos mutaciones, una de ellas fue la deleción 185AG presente en 1 de las 42 familias (2,38%). Los autores concluyen que ninguna de las mutaciones analizadas correspondería a una mutación fundadora frecuente para esta población. En consecuencia, no hay acuerdo entre los autores respecto de si la mutación 185delAG es o no una mutación fundadora en población española.

Si se compara la frecuencia de la deleción 185AG en población española versus la encontrada en población mixta-chilena, en esta última, la frecuencia de esta mutación es baja, más aún si se considera que 382 individuos constituyen un tamaño muestral adecuado para obtener conclusiones con validación estadística. Por lo tanto, no correspondería a una mutación recurrente en población chilena, más aún considerando que no es claro que la deleción AG sea una mutación fundadora para la población española.

La única mujer que resultó portadora de la deleción 185AG presenta datos clínicos de individuo sano en relación con este cáncer y evaluación mamográfica con BIRADS 2, sin embargo, pertenece a una familia en la cual, la mutación 185delAG está segregando. En esta familia también se estudió a la única hermana del probando, quien tuvo un cáncer de mama diagnosticado a los 38 años y que también resultó portadora de la deleción 185AG. En consecuencia, a la paciente sana (probando) se le deberá diseñar un protocolo de prevención y realizar consejo genético a la familia.

El cáncer de mama hereditario puede presentarse en individuos que tienen historia familiar de cáncer de mama, o síndrome mama-ovario, los que se heredan en forma autosómica dominante30. Actualmente se están realizando grandes esfuerzos orientados a reducir la alta incidencia y mortalidad asociados a este cáncer mediante la identificación de mujeres de alto riesgo. Una vez identificadas, estas mujeres pueden ser sometidas a programas de prevención intensivos. El cáncer de mama en su inicio no es una enfermedad sistémica, pero es progresiva. El tamizaje puede detener su desarrollo, ya que el tratamiento del cáncer de mama avanzado es a menudo inútil y mutilante.

En Chile, en 1999, según antecedentes del Instituto Nacional de Estadística, 973 chilenas fallecieron por cáncer de mama. El 66,5% de ellas (647) eran beneficiarias del sistema público. En países en desarrollo la incidencia estimada de cáncer de mama es 2,5 por cada 1.000 mujeres. En consecuencia, el Programa Nacional de Cáncer de Mama del Ministerio de Salud debiera haber pesquisado 11.617 mujeres con cáncer de mama si se aplicara un sistema eficaz de detección precoz. CONAC es una institución que entre sus labores desarrolla prevención del cáncer y en este contexto inició en el año 2000 una campaña de prevención del cáncer de mama, la que se desarrollará durante 5 años (2000-2004). El objetivo de esta campaña es identificar mujeres de alto riesgo y someterlas a un programa de prevención del cáncer de mama. En consecuencia, esta campaña selecciona mujeres sanas, pero con historia familiar para cáncer de mama, a las que se les realiza: a) estudio genético de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2; b) examen clínico anual; c) mamografía anual durante cinco años y d) en los casos que existan imágenes mamográficas alteradas, se realiza ecografía mamaria y biopsia. A las mujeres BRCA1 o BRCA2 positivas se les reconstituye su genealogía, y se les ofrece realizar un estudio de cálculo de riesgo, el que establece la probabilidad para cada miembro de la familia de ser portador de mutaciones en BRCA1 o BRCA2 y la probabilidad de desarrollo de la enfermedad edad específica. A aquellos individuos con probabilidad igual o mayor a 10% se les ofrece estudio genético.

El desarrollo de esta campaña es de gran beneficio para las mujeres incorporadas y sus familias, ya que ingresan a un programa de prevención gratuita y puede permitir el diagnóstico temprano de la enfermedad, lo que disminuye los costos de tratamiento y potencialmente aumenta la sobrevida. Además contribuye al ahorro de recursos estatales y con la ciencia, ya que CONAC está financiando un estudio de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 en población chilena.

La campaña de prevención del cáncer de mama organizada por CONAC, se inició el año 2000 e incorporó 382 mujeres, el año 2001 incorporó un segundo grupo de 518 mujeres, el año 2002 se realiza el tercer año de campaña incorporándose ya 500 mujeres y durante las etapas a realizarse en los años 2003 y 2004 se incorporarán otras 1.000 mujeres (500 cada año). En consecuencia, el universo muestral de este estudio será aproximadamente de 2.400 mujeres, y cada una de ellas será controlada durante cinco años. Así, sin duda, este programa contribuirá a la prevención del cáncer de mama en Chile y al conocimiento genético de esta enfermedad en población chilena.

En relación con la técnica empleada, ésta resultó rápida de realizar, de fácil interpretación, y de bajo costo y por lo tanto, altamente adecuada y aplicable a screening molecular a gran escala.

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