Estudio de tres loci hipervariables en población mixta chilena Study of three hypervariable loci in a mixed Chilean population M del Rosario Novoa C1, Carolina Labbé C1, Hugo Jorquera G, Fabián Moreno Ch, M Eugenia Aguirre M, Lucía Cifuentes O.

Background: Genetic markers are useful to study evolution parameters in populations and to determine kinship. Aim: To characterize three short tandem repeat loci in a sample of Chilean subjects and compare them with Caucasian and Hispanic populations. Material and methods: Three hundred ninety three unrelated subjects that were sent for genetic studies from courts of justice, were studied. The loci FESFPS, F13A01 and vWA in blood samples, were typified amplifying DNA by polymerase chain reactions. Results: The three studied loci were highly polymorphic. F13A01 and FESFPS were in Hardy-Weinberg genetic equilibrium. A significant excess of heterozygotes was detected for vWA locus. There were no differences in allele frequencies, according to ethnic origins of last names. Allele frequencies for F13A01 and vWA loci were similar to those of Hispanic populations of Unites States and FESFPS loci was different. Conclusions: All three loci had a high efficiency for genetic identification tests according to the estimated a priory exclusion probability (Rev Méd Chile 2001; 129: 75-79).
(Key-Words: Gene identity; Genetic markers; Genetic screening)

Recibido el 20 de marzo, 2000. Aceptado en versión corregida el 21 de noviembre, 2000.
Unidad de Biología Molecular, Departamento de Laboratorios, Servicio Médico Legal y
Programa de Genética Humana, ICBM, Facultad de Medicina de la Universidad de Chile
¹ Alumnas de Medicina, Universidad de los Andes

Los marcadores genéticos constituyen una importante herramienta para el genetista humano, tanto desde el punto de vista de estudios genético poblacionales de microevolución o como un instrumento útil en identificación genética y análisis de parentesco¹. Durante las últimas décadas, gracias a los avances de las técnicas de biología molecular ha sido posible estudiar polimorfismos genéticos a partir de la molécula de DNA directamente. Entre éstos se destacan por su gran variabilidad poblacional, los microsatélites o STR (short tandem repeat) cuya variación obedece al distinto número de veces que se repite una misma secuencia corta (menos de 6 pares de bases) de DNA en un locus específico². El conocimiento de las frecuencias alélicas de estos loci en la población es indispensable para llevar a cabo pruebas de identificación genética y de parentesco, así como también es un conocimiento importante para el genetista poblacional, desde el punto de vista de la formación y caracterización genética de la población, con sus posibles implicancias microevolutivas y como base de datos referencial para estudios de asociación entre patologías humanas y marcadores genéticos. Es importante, por esto, caracterizar a la población chilena respecto de estos loci, debemos recordar que la población mixta chilena se formó a consecuencia de la mezcla entre la población aborigen que residía en nuestro territorio, de origen mongoloide y la población española conquistadora, de origen caucásico3. Numerosos estudios genéticos de la población chilena, demuestran que ésta presenta 30 a 40% de mezcla aborigen y entre 60 a 70% de mezcla caucásica (española)³.

El objetivo del presente trabajo es caracterizar una muestra de la población chilena respecto de tres loci, y compararla con datos provenientes de poblaciones caucásicas e hispánicas. Los STR estudiados aparecen descritos en la Tabla 1.

POBLACIÓN Y MÉTODO

Se estudiaron 393 individuos que concurrieron al Servicio Médico Legal de Santiago durante 1998, derivados desde los Tribunales de Justicia para ser estudiados como parte de un proceso judicial.

Se obtuvo una muestra de sangre, a partir de la cual de extrajo DNA a través del método orgánico descrito por Comey et al⁴. El DNA fue amplificado en un termociclador Perkin Elmer 9600, mediante el programa de amplificación descrito por el proveedor. Todos los loci se analizaron utilizando el kit GenePrint Triplex FFv de Promega Corp. Para resolver los fragmentos de DNA amplificados se utilizó electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con sales de plata.

Las frecuencias alélicas se estimaron por conteo directo, por tratarse de alelos codominantes⁵. Se estimó la heterocigocidad de cada locus y se comparó con la heterocigocidad esperada de acuerdo al equilibrio genético de Hardy y Weinberg⁶ utilizando la prueba de c2. Se compararon las frecuencias alélicas de la muestra chilena con datos de poblaciones hispánicas residentes en USA y poblaciones caucásicas. La muestra chilena se subdividió de acuerdo a la razón por la cual se solicitó el análisis (causas criminales o de filiación) y de acuerdo a los apellidos de los individuos (ambos apellidos chilenos, algún apellido mapuche o algún apellido extranjero). Las comparaciones entre las muestras y submuestras se hicieron con prueba de c2 o prueba exacta de Fisher en el caso de muestras pequeñas⁷.

RESULTADOS

Las frecuencias alélicas y las heterocigocidades observadas se exponen en la Tabla 2. Los loci F13A01 y FESFPS se encuentran en equilibrio genético de Hardy-Weinberg, no así el locus vWA para el cual se detectó un exceso significativo de heterocigotos (c2=10,43; p<0,01).

Al subdividir la muestra de acuerdo al motivo del estudio (causas criminales o análisis de paternidad) y de acuerdo al origen de los apellidos, no se encontraron diferencias significativas entre las frecuencias alélicas de estos tres loci, en las submuestras analizadas (p>0,05).

En la Figura 1 se observan las frecuencias alélicas de la muestra chilena analizada y se comparan con frecuencias descritas para poblaciones caucásicas, afroamericana e hispanoamericana, residentes en USA⁸. Las frecuencias alélicas de la muestra chilena estudiada difieren significativamente de las frecuencias de poblaciones caucásicas y afroamericanas (p<0,05). Las frecuencias génicas encontradas en la población chilena son similares a aquellas descritas para la población hispánica residente en EEUU. en los loci F13A01 y vWA, pero difieren significativamente de ésta en lo que se refiere al locus FESFPS (c2=17,06; p=0,009). Estas diferencias obedecen a una menor frecuencia del alelo 13 y a una mayor frecuencia del alelo 10 en la población chilena, comparativamente con la población hispánica residente en EEUU.

FIGURA 1. Frecuencias alélicas de los loci F13A01, FESFPS y vWA en poblaciones mixta chilena, caucásica, afroamericana e hispánica, residentes en USA.

En relación a la eficiencia de estos tres loci en pruebas de identificación genética y análisis de paternidad se estimó la probabilidad de exclusión a priori⁹ y la probabilidad de exclusión de culpabilidad en análisis forense¹ (Tabla 3).

DISCUSIÓN

Los loci analizados demuestran gran heterocigocidad en la población estudiada. Al subdividir la muestra de acuerdo a apellidos y motivo del estudio, no se encontraron diferencias entre las submuestras, lo que indica que las estimaciones de frecuencias génicas obtenidas pueden reflejar bastante bien las frecuencias alélicas para la población mixta chilena. Este hecho sumado al alto polimorfismo de estos loci los hace recomendables para estudios de identificación genética y análisis de paternidad; lo cual se ve corroborado por las altas probabilidades de exclusión que estos loci ofrecen.

Llama la atención la ausencia de equilibrio genético de Hardy-Weinberg en el locus vWA, debido a un exceso aparente de heterocigotos. Una posible explicación para este hecho es un error técnico en la lectura de los alelos en el gel, ya que con frecuencia se observan bandas "fantasmas" que no corresponden a un alelo distinto en un heterocigoto sino que son reflejo de una misma banda; este hecho hace que se interpreten como heterocigotos, individuos que realmente son homocigotos. Para verificar la validez de esta explicación, se realizó un análisis de este locus mediante electroforesis capilar en algunos de los individuos previamente calificados como heterocigotos y comprobamos que algunos de ellos eran homocigotos.

Al comparar la población mixta chilena con otras poblaciones de distinto origen étnico se encuentran diferencias significativas en las frecuencias alélicas, como es de esperar. Llama la atención que las frecuencias alélicas de la población mixta chilena difieran de las frecuencias publicadas para población hispánica residente en USA, en el locus FESFPS; este hecho puede ser consecuencia de pequeñas diferencias en las frecuencias de las poblaciones ancestrales de origen, a las que se agrega un efecto fundador que amplifica estas diferencias en las futuras generaciones de las poblaciones mezcladas. Este hecho demuestra que es necesario contar con bases de datos propios para cada población, al momento de usar estos estimadores en pruebas de identificación genética y análisis de parentesco, ya que poblaciones de origen étnico similar pueden diferir.

Las probabilidades de exclusión estimadas para nuestra población demuestran la eficiencia de estos marcadores en pruebas de individualización genética y análisis de parentesco. El presente trabajo ofrece un perfil de las frecuencias alélicas, característico para la población chilena, el cual permitirá utilizar estos marcadores polimórficos en peritajes de identificación genética en nuestra población, sin tener que recurrir a estimaciones de otras poblaciones que no siempre reflejan nuestra idiosincrasia genética.

Correspondencia a: Dra. Lucía Cifuentes O. Programa de Genética Humana, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. Casilla 70061, Santiago 7, Chile. Fax 7373158. E-mail: lcifuent@machi.med.uchile.cl

REFERENCIAS

1. Cifuentes L. Fundamentos de identificación genética. En: Identificación genética y pruebas de paternidad, L. Cifuentes (ed.) Editorial Universitaria. Santiago de Chile, 1996.

2. Tautz D. Notes on the definition and nomenclature of tandemly repetitive DNA sequences. En: DNA fingerprinting: State of the Science, Pena SDJ, Chakraborty R, Epplen JT, Jeffreys AJ.(eds) Birkhauser Verlag, Switzerland 1993.

3. Valenzuela C. On sociogenetics clines. Ethology and Sociobiology 1988; 9: 259-68.

4. Comey C, Koons B, Preseley K, Smerik J, Sobieraski C, Stanley D. DNA extraction strategies for amplified fragment lenght polymorphism analysis. J Frensic Sci 1994; 39: 1254-69.

5. Cavalli-Sforza LL, Bodmer L. The genetics of human population, WH Freeman. San Francisco, 1971.

6. Nei M. Molecular Evolutionary Genetics. Columbia University Press, New York, 1987.

7. Taucher E. (ed.) Bioestadística. Editorial Universitaria, Santiago de Chile, 1997.

8. Geneprint STR Systems. Promega Technical Manual. Promega Corporation, Madison, 1997.

9. Wiener A. Chances of proving nonpaternity with a system determined by triple allelic codominant genes. Am J Hum Genetics 1968; 20: 279-82.