Virus de la hepatitis C en un grupo de pacientes hematológicos y oncohematológicos Hepatitis C virus in a group of hematological and oncohematological patients Inés Vega R1, Alvaro León R, Paolina Zolezzi R, Humberto Ibarra V, Cecilia Faúndez V, Jorge Montecinos V1.

Background: Little information is available in Chile about hepatitis C virus (HCV) in hematological and oncohematological patients. Aim: To evaluate the prevalence of hepatitis C virus markers in a group of hematological and oncohematological pediatric patients seen at Valdivia Regional Hospital. Patients and methods: Antibodies against virus C, determined by ELISA and viral RNA, determined using RT-polymerase chain reaction, were measured in 54 blood samples from children with hematological diseases (34 with Acute Lymphoblastic Leukaemia, 4 with Hodgkin Diseases, 4 with Haemolytic Anemia, 5 with Sarcomas, 2 with Non-Hodgkin Lymphoma, 2 with Thrombocytopenic Purpura, 1 with an Ependimoma, one with a Wilms Tumor and 1 with a Von Willebrand Disease). Results: All samples were negative for antibodies against hepatitis C virus. Viral RNA was found in four children, all with a diagnosis of acute lymphoblastic leukemia and who received chemotherapy and multiple transfusions. Conclusions: The prevalence of Viral RNA for hepatitis C virus in oncohematological patients in our study is high and associated with the use of chemotherapy and multiple transfusions (Rev Méd Chile 2001; 129: 18-22).
(Key-Words: Hematologic diseases; Hepatitis C; Hepatitis C antibodies; Polymerase chain reaction)

Recibido el 28 de enero, 2000. Aceptado en versión corregida el 21 de noviembre, 2000.
Trabajo financiado por el Proyecto CHI-6-016 del Organismo Internacional de Energía
Atómica (OIEA). Institutos de Hematología y Medicina, Facultad de Medicina, Universidad
Austral de Chile, Valdivia.
¹Bioquímico

Los pacientes con enfermedades hematológicas y oncohematológicas presentan un riesgo mayor de adquirir infección por el virus de la hepatitis C (VHC), por la eventual necesidad de emplear como parte de su tratamiento de apoyo múltiples transfusiones¹. El riesgo de infección aumenta en los pacientes con cáncer sometidos a quimioterapia y/o radioterapia como consecuencia de la inmunodepresión secundaria a estos dos tratamientos².

Debido a que no hay antecedentes al respecto en la región Sur Austral de Chile, comunicamos en este trabajo los resultados del estudio de VHC en un grupo de pacientes hematológicos y onco-hematológicos que consultaron en el Policlínico de Hematología Infantil del Hospital Clínico Regional de Valdivia, que es a su vez Centro de Referencia Onco-Hematológico de las Regiones X, XI y XII.

MATERIAL Y MÉTODO

Pacientes. Previo consentimiento informado y con la aprobación del Comité de Ética local, se realizó el estudio de VHC en 54 pacientes pediátricos del Policlínico de Hematología del Hospital Clínico Regional de Valdivia, Centro de Referencia Onco-Hematológico de las regiones X, XI y XII, en los meses de mayo y diciembre de 1999.

Los pacientes analizados presentaban los siguientes diagnósticos: 34 Leucemia linfoblástica aguda, 5 Sarcoma de partes blandas, 4 Enfermedad de Hodgkin, 4 Anemia hemolítica, 2 Linfoma no Hodgkin, 2 Púrpura trombocitopénico, 1 Ependimoma, 1 Tumor de Wilms y 1 Enfermedad de Von Willebrand (Tabla 1).

Los pacientes antes mencionados, sin considerar el diagnóstico, fueron clasificados en: múltiple transfundidos con quimioterapia (27); múltiple transfundidos sin quimioterapia (4); monotransfundidos con quimioterapia (6); no transfundidos con quimioterapia (14); no transfundidos sin quimioterapia (3) (Tabla 2).

En ellos se recolectaron muestras de sangre periférica, conservándose los sueros a -70°C hasta la determinación de anti-VHC y ARN viral.

Detección de anti-VHC y ARN-VHC. Los sueros fueron analizados mediante ELISA Abbott de tercera generación y, las absorbancias fueron obtenidas en lector Quantum II.

Para la detección del ARN del VHC se realizó la extracción del ARN viral de las muestras y de los controles positivos y negativos, aplicando el método descrito por Chomczynski y Sacchi3. Como control positivo se utilizó el suero de dos pacientes con Hemofilia A actualmente de 22 y 25 años, diagnosticados en 1974 y 1976 respectivamente, los que hasta diciembre de 1999 habían sido múltiple transfundidos con glóbulos rojos desplasmatizados, plasma fresco congelado, crioprecipitado y liofilizado de factor VIII. En estos dos pacientes hemofílicos se detectaron anticuerpos anti-VHC por ELISA en controles sucesivos y además, se identificó el virus C por RT-PCR en 1998 y 1999. Como controles negativos se empleó suero de pacientes que no fueron expuestos a transfusiones, a los que no se les detectó anticuerpos contra VHC por ELISA y no se identificó el virus al realizar la RT-PCR. Para descartar la contaminación muestra-muestra se analizó cada muestra en forma independiente, con el resguardo de las normas de bioseguridad.

El ARN extraído se transformó en ADNc por RT-PCR utilizando el primer p209. El ADNc obtenido fue amplificado con los primers p209 y p939 y posteriormente se realizó una amplificación anidada con los primers p211 y p940^4,5.

El producto amplificado por esta reacción correspondió a la región 5’ no codificante (5’-NCR) del genoma viral, la que es altamente conservada en los distintos genotipos del virus. La detección del producto amplificado y de los controles positivos y negativos utilizados se realizó mediante una electroforesis en gel de agarosa al 2% con buffer Tris-Borato-EDTA (TBE), utilizando un marcador de pesos moleculares. La visualización de las bandas con bromuro de etidio se realizó sobre transiluminador UV.

RESULTADOS

Las características principales de los pacientes y sus diagnósticos aparecen en la Tabla 1.

Detección de anti-VHC en el grupo de estudio. En los cincuenta y cuatro sueros analizados no se detectó la presencia de anticuerpos para el VHC por ELISA (0%).

Identificación del ARN del VHC. La determinación de RT-PCR realizada en todas las muestras de suero de los pacientes estudiados, detectó la presencia de ARN-VHC en 4/54 (7,4%). Estos casos corresponden a 4/34 (11,8%) pacientes con diagnóstico de LLA clasificados en el grupo que recibió quimioterapia y múltiples transfusiones de productos sanguíneos (promedio: 12 transfusiones; rango: 2 a 18 transfusiones). En la Figuras 1 y 2 se muestran los geles de agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio, correspondientes a la electroforesis del ADN obtenido (250 bp) de los sueros de los pacientes con LLA en los que se detectó la presencia del ARN viral, muestras 3, 4 y 5 (Figura 1) y muestra 6 (Figura 2).

FIGURA 1. Detección de VHC. Los productos de la PCR anidada fueron corridos en gel de agarosa TBE 2%. De izquierda a derecha: Línea 1: marcador de pesos moleculares; línea 2: muestra 1 (paciente con LLA, PCR negativo); línea 3: muestra 2 (control positivo); línea 4: muestra 3 (paciente con LLA, PCR positivo); línea 5: muestra 4 (paciente con LLA, PCR positivo); línea 6: muestra 5 (psciente con LLA, PCR positivo); línea 7: muestra 11 (control positivo); y línea 8: muestra 7(control negativo).

FIGURA 2. Detección de VHC. Los productos de la PCR anidada fueron corridos en gel de agarosa TBE 2%. De izquierda a derecha: Línea 1: muestra 8 (paciente con linfoma no Hodking, PCR negativo); línea 2: muestra 9 (paciente con PTI, PCR negativo); línea 3: muestra 10 (control positivo); línea 4: marcador de pesos moleculares; línea 5: muestra 6 (paciente con LLA, PCR positivo); línea 6: muestra 12 (control positivo); y línea 7: muestra 13 (paciente con anemia hemilítica, PCR negativo); línea 8: muestra 14 (control negativo).

DISCUSIÓN

Se ha descrito que el 90% de los casos de hepatitis relacionados con transfusiones son causadas por el VHC, que es virus ARN perteneciente a la familia de los flavivirus de transmisión parenteral⁶. En Chile, la prevalencia de VHC es baja, reportándose en donantes de sangre de Santiago, 0,28% anti-VHC⁷. Otros estudios realizados para detectar la presencia de anticuerpos contra el VHC, por ELISA, en pacientes con diversos cuadros patológicos confieren para pacientes hemofílicos una prevalencia de VHC de 88 a 91%^8,9. Estudios anteriores de grupos de pacientes de riesgo en nuestra región no han detectado anticuerpos contra el VHC por ELISA^10,11.

En Chile no disponemos de información de estudios de ARN del VHC por RT-PCR en pacientes onco-hematológicos pediátricos. En nuestro estudio se detectó la presencia del ARN del VHC por RT-PCR en cuatro pacientes con leucemia linfoblástica aguda (11,8%) sometidos a poliquimioterapia, los que fueron transfundidos con glóbulos rojos desplasmatizados, plasma fresco congelado y concentrado de plaquetas entre abril de 1994 y febrero de 1996.

En pacientes hematológicos infantiles con LLA y leucemia mieloide crónica (LMC), sometidos a trasplante de médula ósea, se ha determinado una prevalencia de anti-VHC sérica de 12%^2,12 y en pacientes sobrevivientes tratados por leucemia y linfoma, se ha observado una seropositividad anti-VHC de 17,2%¹. Estos porcentajes se consideran altos en relación a la prevalencia conocida de 0,2% en donantes de sangre, pero a su vez, son relativamente bajos si se consideran otros grupos de riesgo que reciben transfusiones múltiples, como son los pacientes con hemofilia y talasemias, en los cuales la prevalencia observada se relaciona con el área geográfica, el año de la primera exposición al riesgo y con el número de transfusiones recibidas. Las prevalencias descritas, de 12 y 17%, podrían estar determinadas por las numerosas transfusiones que estos pacientes requirieron y por la quimioterapia utilizada de un mayor efecto inmunosupresor. Debemos considerar además, que la determinación de anticuerpos se realizó con un ELISA, de segunda generación, introducido el año ‘91, no informándose resultados de la identificación del VHC con RT-PCR.

La presencia del VHC en nuestros pacientes se puede relacionar principalmente, con las numerosas transfusiones recibidas. Los resultados negativos de la detección de anticuerpos en suero por ELISA de tercera generación, se pueden explicar por la inmunosupresión que presentan estos individuos, asociada con la patología de base, la que se acentúa con los tratamientos quimioterápicos utilizados según el Programa Nacional de Drogas Antineoplásicas (1992)¹³ los que incluyen uso de: prednisona, vincristina, daunorrubicina, L-asparraginasa, metotrexato, ciclofosfamida, citarabina, 6-mercaptopurina, doxorrubicina, dexametasona y tioguanina. En otros grupos de pacientes de riesgo como trasplantados renales, pacientes con SIDA e insuficiencia renal¹⁴ los que también presentan inmunosupresión, no se han detectado anticuerpos anti-VHC por ELISA en suero, pero no se han realizado estudios tendientes a identificar la presencia del virus por RT-PCR.

Los antecedentes anteriormente señalados nos permitirían recomendar, en pacientes hematológicos y onco-hematológicos de alto riesgo sometidos a múltiples transfusiones y a tratamientos quimioterápicos prolongados, realizar la identificación del virus de la hepatitis C por técnicas de biología molecular, como RT-PCR, empleadas en este estudio.

Correspondencia a: Inés Vega R. Laboratorio de Biología Molecular, Instituto de Hematología, Facultad de Medicina, Universidad Austral de Chile. Casilla 567, Valdivia. Fono-fax: 63-214157. E-mail: ivega@uach.cl

Agradecimientos

A Laboratorios Abbott de Chile por la facilitación del Kit de ELISA anti-VHC para la realización de este trabajo.

REFERENCIAS

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