Background: Sperm functional tests as an addition to semen analysis have been used to study the fertilization ability of spermatozoa. Besides the usual variability of the seminal analysis an individual variability in the results of functional tests has been recently found. Aim: to evaluate in a three months period, the individual variability of sperm parameters and sperm maturation using the chromatin condensation test and epidydime a-glucosidase (that allows to discriminate obstructive processes). Material and method: The evaluation was carried out in two donors (12 samples) apparently in good health. One of them presented evident semen analysis alterations (donor 1) and the other was considered normal under the WHO standards (donor 2). Results: The averages for donor 1 were: Sperm count 24x106 sperm/ml (range 10-58x106 sperm/ml), morphology 31.8% (range 30-35%), total motility 33% (range 20-42%), sperm maturation 38% (range 28-78%), a-glucosidase 8.65 (U/ml (range 5-10 (U/ml). The averages for donor 2 were: Sperm count 96x106 sperm/ml (range 50-140x106 sperm/ml), morphology 32.2% (range 30-35%), total motility 69% (range 58-78%), sperm maturation 17% (range 7-30%), a-glucosidase 36.9 (U/ml (range 20-82 (U/ml). Conclusions: These results show that significant variations can be found in the sperm parameters and in seminal plasma a-glucosidase; however these variations are generally maintained at the normal or abnormal ranges for each individual, except the sperm morphology that was constant and with low variation in both donors. The determination of the chromatin condensation in the semen analysis gives an additional information about the grade of sperm maturation and would be of great value for differentiating between sperm samples that show similar morphology values. (Rev Méd Chile 2000; 128: 483-9).
(Key-words: Semen; Spermatozoa; Sperm count; Sperm maturation)

Recibido el 18 de noviembre 1999. Aceptado en versión corregida el 18 de enero 2000.
Departamentos de Ciencias Preclínicas y Ciencias Básicas. Centro de Biotecnología en
Reproducción, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera Temuco, Chile .
Departamento de Dermatología y Andrología. Justus-Liebig Universidad de Giesen, Alemania.
Trabajo financiado por Programa MECE-SUP 98, Proyecto: Fortalecimiento de la capacidad
Científica Tecnológica y Productiva Regional; y Dirección de Investigación, Proyecto 9820,
Universidad de La Frontera, Temuco.
¹ Tecnólogo Médico

En el espermiograma existe una gran variabilidad de los parámetros clásicos, como movilidad, recuento y morfología del espermatozoide, sin embargo si sus resultados se repiten en dos o tres espermiogramas consecutivos se puede deducir que esos son los valores permanentes del paciente. Estos tres parámetros están relacionados con la capacidad reproductora del varón, de ahí que la Organización Mundial de la Salud (OMS) haya definido valores para considerar a un paciente no fértil¹.

Diferentes pruebas de función espermática son utilizados como complemento al espermiograma para obtener una mayor información sobre la capacidad de fecundación in vivo de los pacientes andrológicos². A la variación normal de los parámetros del espermiograma, recientemente se ha demostrado que existe variabilidad intraindividual en las pruebas de evaluación de función espermática, específicamente la prueba de reacción de acrosoma³ e igualmente que existe una variación relacionada con las estaciones del año en el caso de la determinación de la condensación de la cromatina, evaluada por la prueba de tinción con anilina⁴.

Esto ha puesto en controversia la utilidad de algunos tests de función espermática, ya que la mayoría de ellos está correlacionado con los porcentajes de fecundación in vitro y no con lo que puede ocurrir in vivo, existiendo escasa información sobre la variabilidad individual durante un ciclo espermatogénico (74 días en la especie humana)⁵, incluyendo el período de maduración de los espermatozoides en el epidídimo (16 días)⁶. Este estudio fue diseñado para evaluar en forma prospectiva y por un período de 3 meses, que comprende el ciclo espermatogénico humano, la variación intraindividual que pueden experimentar los parámetros espermáticos del espermiograma (recuento, movilidad y morfología) y la maduración espermática nuclear a través de la prueba de condensación de la cromatina. Asimismo, para determinar si esta variación compromete otros parámetros no relacionados al espermatozoide, se evaluó la producción de a-glucosidasa epididimaria, cuya presencia en el eyaculado permite descartar procesos obstructivos epididimarios. La evaluación se realizó en dos donantes sanos, uno de ellos con alteraciones evidentes del espermiograma y otro con niveles considerados como normales para la OMS.

MATERIAL Y MÉTODO

Previa consulta y aprobación por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina, mediante consentimiento informado se seleccionó entre estudiantes de nuestra Universidad los donantes para este estudio, excluyéndose de él los sujetos que tuvieran historia de enfermedades previas y enfermedades de transmisión sexual.

Obtención y preparación de muestras de semen. El semen se obtuvo de dos donantes adultos jóvenes con examen andrológico normal y sin patología preexistente en un período de tres meses. Las muestras se obtuvieron por masturbación en forma semanal con una abstinencia sexual mínima de dos días. Luego de la obtención, las muestras se dejaron a 37ºC en estufa de cultivo por 30 a 60 min hasta su licuefacción. Cada muestra se separó en dos alícuotas de 1 ml, con una se realizó el espermiograma según las recomendaciones de la OMS (1992)¹ y determinación de a-glucosidasa y la alícuota restante se utilizó para determinar la condensación de la cromatina.

Determinación de condensación de la cromatina. A 1 ml de semen se le agregó 3 ml de medio de cultivo HTF⁷, se mezcló y centrifugó a 1500 r.p.m. por 5 min, luego se eliminó el sobrenadante y el pellet fue resuspendido en 500 µl de HTF, se tomaron alícuotas de 20 µl con las cuales se realizaron extendidos para determinar la condensación de la cromatina. Los extendidos fueron fijados en 3% glutaraldehido in 0,2 M de buffer fosfato por 30 min. Posteriormente fueron teñidos con 1,5 ml de 5% de azul de anilina ácida a pH 3,5 por 5 min8. Los espermatozoides con normal condensación de la cromatina no son teñidos con este método. El porcentaje de espermatozoides con cabeza teñida, que representa las formas inmaduras tanto en espermatozoides con morfología normal o anormal fue calculado de la observación de 100 espermatozoides por preparación. El valor normal es <20% de formas teñidas.

Determinación de a-glucosidasa en plasma seminal. La actividad de a-glucosidasa fue determinada por espectrofotometría según lo descrito por Chapdelaine y col⁹; y con docecylsulfato de sodio para eliminar la isoforma ácida secretada por la glándula prostática10. La absorbancia de la reacción final fue medida a 405 nm en un espectofotómetro Zeiss PM2D2. La actividad enzimática fue calculada de la curva estándar de p-nitrofenol (PNP) el cual es liberado del substrato sintético p-nitrofenol-a-D-glucopyranoside (PNPG). 1 unidad de a-glucosidasa= 1 µMol de PNP producido por min a 37ºC. El coeficiente de variación interensayo fue de 6,1% y el coeficiente de variación intraensayo de 4,4%. Los resultados fueron expresados en µU/ml. Se consideró como valor normal mas de 20 µU/ml semen.

RESULTADOS

Morfología espermática. La determinación de las formas normales en los extendidos de espermatozoides de las 12 muestras de ambos donantes demostró en todas ellas >30% de formas normales, valor considerado el mínimo normal por la OMS. Este fue el parámetro más constante del espermiograma con valores promedios para el donante 1 de 31,8% (rango: 30 a 35%) y para el donante 2 de 32% (rango: 30 a 35%) (Figura 1).

FIGURA 1. Distribución en el porcentaje de espermatozoides con formas normales en el semen de dos donantes por un período 12 semanas.

Recuento espermático. Este parámetro permitió separar a los donantes, el donante 1 presentó valores que oscilaron mayormente en el rango de subfertilidad con recuentos que fluctuaron en todas las muestras entre los 10 y 40 mill/ml, presentando en una sola ocasión un valor mayor de 50 mill/ml. En cambio el donante 2 presentó siempre valores considerados como normales para la OMS (> de 20 mill/ml) con una mayor fluctuación de sus valores entre 50 y 140 mill/ml (Figura 2).

FIGURA 2. Distribución en la concentración de espermatozoides en el semen de dos donantes por un período de 12 semanas.

Movilidad espermática total. Este parámetro también permitió separar a los donantes. Aunque presentó variaciones en el tiempo, no lo hizo en forma significativa, ya que el donante 1 siempre estuvo en el rango inferior al normal, con la suma de la movilidad tipo A + tipo B <50% (rango 20 - 42%). Asimismo, el donante 2 siempre se mantuvo dentro de los valores normales, con un promedio en la movilidad progresiva total de 69% (rango 58 - 78%) (Figura 3).

FIGURA 3. Distribución del porcentaje promedio de la movilidad espermática total (OMS Tipo A + Tipo B) en el semen de dos donantes por un período de 12 semanas.

Determinación de a-glucosidasa. Este examen, considerado un marcador de la función epididimaria, presentó importantes variaciones entre las muestras sin seguir una correlación con el recuento espermático. El donante 2 que presenta un perfil del espermiograma considerado en el rango para pacientes fértiles, la variación fue muy importante desde 18 a 90 (U/ml con un promedio de 37 µU/ml, sin embargo siempre sus valores permanecieron en rangos considerados como normales. En cambio el donante 1 estimado como subfértil en una sola ocasión obtuvo el valor mínimo para considerar este parámetro normal (> 20 µU/ml), presentando el resto de las muestras valores considerados como de sub-obstrucción epidimaria con valores entre 4 y 10 µU/ml, con un promedio de 8 µU/ml (Figura 4).

FIGURA 4. Distribución en la concentración de a-glucosidasa en el semen de dos donantes por un período de 12 semanas.

Condensación de la cromatina. Este método permitió en poblaciones espermáticas con similar morfología, diferenciarlas por el grado de madurez del espermatozoide. El donante 1 presentó una gran fluctuación de los valores entre las diferentes muestras con un promedio de 38% de espermatozoides con alteración en la condensación de la cromatina, con un rango del 23 al 78%. El donante 2 presentó una menor fluctuación entre sus valores, con un promedio de 17%, considerado un valor normal para este examen, y con un rango entre el 7 y 30% (Figura 5).

FIGURA 5. Distribución del porcentaje promedio de la madurez espermática evaluada por la tinción con azul de anilina en espermatozoides de dos donantes por un período de 12 semanas.

DISCUSIÓN

La evaluación de los parámetros del semen permite una aproximación de la capacidad fecundante de éste. Estudios retrospectivos del análisis del espermiograma han comprobado la eficacia de estos resultados en predecir la capacidad fecundante del semen, especialmente en lo relacionado a recuento, movilidad y morfología de los espermatozoides¹¹. Esto ha permitido a la OMS tener valores que permiten delimitar los rangos de probable fertilidad, sin embargo el análisis del semen no determina la capacidad de función de los espermatozoides. Por tanto, continúa siendo de importancia la evaluación de otros factores que impliquen una información adicional sobre la función del espermatozoide, para esto se han diseñado múltiples exámenes, como es la determinación de la inducción de reacción de acrosoma¹², la capacidad de fusión de las membranas espermáticas, evaluada por el ovocito de hámster denudado de zona pelúcida¹³ o la prueba de hemizona pelúcida realizado con ovocitos humanos¹⁴, el cual tiene la mayor correlación con los resultados de fecundación in vitro. Todos estos exámenes requieren de tiempo y de un costo adicional; luego para integrar a la rutina diagnóstica un examen de función espermática, se requiere que éste sea rápido y de bajo costo. Por ello nosotros elegimos la prueba de condensación de la cromatina, ya que en los pacientes con factor masculino se encuentra el mayor porcentaje de alteraciones en la condensación de la cromatina, y los más bajos valores de la fecundación in vitro convencional^15,16. Esta prueba permite evaluar el cambio de histonas a protaminas en el proceso de espermatogénesis, que implica una adecuada maduración espermática⁸. Actualmente nuevos estudios prospectivos para evaluar parámetros de función espermática con las tasas de fecundación in vitro son difíciles de realizar, debido a que el tratamiento actual de fecundación asistida para el factor masculino se realiza con técnicas de microinyección intracitoplasmática de espermatozoides, cuyos resultados son excelentes en comparación con la fecundación in vitro convencional¹⁷. Además de esta prueba, fueron evaluados otros parámetros seminales en un período correspondiente a un ciclo de la espermatogénesis humana. El parámetro que demostró ser más constante fue la morfología espermática que varió muy discretamente tanto en el donante con espermiograma normal como en el donante con espermiograma alterado. Sin embargo los valores de espermatozoides con alteraciones en la cromatina fueron marcadamente diferentes entre los dos donantes, demostrando que no existe correlación entre morfología espermática y maduración nuclear de los espermatozoides. En el paciente con espermiograma normal se observó una variabilidad en las muestras, pero siempre los valores se encontraron dentro de los valores aceptados como normales para este parámetro, existiendo sólo en dos muestras pequeñas variaciones fuera del rango normal, pero no en muestras consecutivas, en cambio en el paciente con espermiograma anormal se observaron valores de alteración de la condensación de la cromatina marcadamente aumentados, demostrando la existencia de alteración de la maduración espermática en las 12 muestras obtenidas.

Los valores de a-glucosidasa también presentaron variabilidad, similar a los observados en los parámetros convencionales del espermiograma, este hallazgo no descrito hasta ahora, permite sugerir que la evaluación de los exámenes obtenidos del plasma seminal debe de considerar este fenómeno. Sin embargo la variación de a-glucosidasa fue dentro de los limites aceptados como normales en el donante con espermiograma normal y valores bajos en el donante con disminución del recuento espermático, compatible con una suboclusión epididimaria.

Estos resultados nos permiten concluir que a pesar de que existe entre los parámetros seminales variación entre las muestras de cada individuo, estas variaciones se mantienen siempre dentro de rangos de normalidad o anormalidad a excepción de la morfología espermática que fue muy constante y con escasa variación en los dos donantes y que no reflejó la importante variación experimentada entre los donantes en los porcentajes de maduración espermática nuclear. La aplicación de la determinación de la condensación de la cromatina en el espermiograma rutinario otorga una información adicional del grado de madurez espermática y sería complementario para diferenciar entre poblaciones espermáticas que presentan similar valor de morfología. A su vez se valida el valor de la a-glucosidasa como examen predictivo de la obstrucción-no obstrucción del epidídimo y que en ambos casos dos determinaciones serían necesarias para conocer en forma más exacta como se encuentra la función del epidídimo humano.

Correspondencia a: Prof. Dr. Raúl Sánchez G. Departamento de Ciencias Preclínicas. Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Casilla 54-D,Temuco, Chile. Telefono: (45) 325000; FAX: (45)325777. rsanchez@ufro.cl

REFERENCIAS

1. WHO. Laboratory manual for examination of human semen and semen-cervical mucus interactions. Cambridge University Press, 1992.

2. LIU DY, BAKER HGW. Test of human sperm function and fertilization in vitro. Fertil Steril 1992; 58: 465-83.

3. KÖHN FM, ERDMANN I, RAWE K, TURLEY H, STALF T, GIPS H, SCHILL WB. Intraindividual variations in human sperm acrosome reaction: Clinical implications. Int J Androl 1997; 20: 50.

4. HENKEL R, KLEINHAPPL M, HANSCHKE A, SCHILL WB. Jahreszeitliche schwankungen der ejakulatqualität. Fertilität 1998; 13: 37-41.

5. CLERMONT Y. Dynamics of human spermatogenesis. En: E Rosemberg, CA Paulsen, eds. The human testis. New York. Plenum, 1970, 47-59.

6. HELLER CG, CLERMONT Y. Kinetics of the germinal epithelium in man. Recent Progr Horm Res 1964; 20: 545-58.

7. QUINN P, KERIN JF, WARMES GM. Improved pregnancy rate in human in in-vitro fertilization with the use of a medium based on the composition of human tubal fluid. Fertil Steril 1985; 44: 493-8.

8. TERQUEM A, DADOUNE JP. Aniline blue staining of human spermatozoon cromatin. Evaluation of nuclear maturation. En: J Andre, ed. The Sperm Cell. The Hague: Martinus Nijhoff Publishers 1983, 249-52.

9. CHAPDELAINE P, TREMBLAY RR, DUBÉ JY. P-nitro-phenol-alpha-D-glucopyranoside as substrate for measurement of maltase activity in human semen. Clin Chem 1978; 24: 208-11.

10. COOPER TG, YEUNG CH, NASHAN D, JOCKENHÓVEL F, NIESCHLAG E. Improvement in the assessment of human epididymal function by use of inhibitors in the assay of alpha-glucosidase in seminal plasma. Int J Androl 1990; 13: 297-305.

11. BARRAT CL, NAEENI M, CLEMENTS S, COOKE ID. Clinical value of sperm morphology for in -vivo fertility: comparison between World Health Organization criteria of 1987 and 1992. Hum Reprod 1995; 10: 587-93.

12. HENKEL R, MÚLLER C, MISKA W, GIPS H, SCHILL WB. Determination of the acrosome reaction in human spermatozoa is predictive of fertilization in vitro. Hum Reprod 1993; 8: 2128-32.

13. BARROS C, GONZÁLEZ J, HERRERA E, BUSTOS-OBREGÓN E. Human sperm penetration into zona free-hamster oocytes as a test to evaluate the sperm fertilizing ability. Andrologia 1979; 11: 197-210.

14. BURKMANN LJ, CODDINGTON CC, FRANKEN DR, KRUGER T, ROSENWAKS Z, HODGEN G. The hemizona assay (HZA): development of a diagnostic test for the binding of human spermatozoa to the human hemizone pellucida to predict fertilization potential. Fertil Steril 1988; 49: 688-97.

15. AUGER J, MESBAH M, HUBER C, DADOUNE JP. Aniline blue staining as a marker of sperm chromatin defects associated with different semen characteristics discriminates between proven fertile and suspected infertile men. Int J Androl 1990; 13: 452-62.

16. SÁNCHEZ R, VILLAGRÁN E, RISOPATRÓN J, CÉLIS R. Evaluation of nuclear maturity in human spernatozoa obtained by sperm-preparation methods. Andrologia 1993; 26: 173-76.

17. SÁNCHEZ R, STALF T, KHANAGA O, TURLEY H, GIPS H, SCHILL WB. Sperm selection methods for I.C.S.I. in andrological patients. J Ass Reprod Genetics 1996; 13: 110-15.