Detección de los genes de las
exotoxinas pirogénicas SpeA, SpeB
y SpeC en cepas chilenas de
Streptococcus pyogenes y su
asociación con la clínica

Detection of pyrogenic exotoxin
SpeA, SpeB and SpeC genes in
Chilean streptococci isolates and
their association with clinical
manifestations

María Teresa Ulloa F¹, María Soledad Giglio M²,
Lorena Porte T, Adriana Santa Cruz A³, Paul McNab M,
Alberto Fica C, María Eugenia Pinto C, Keyko Kawaguchi G⁴,
Alejandra Carmi K⁴

Background: The virulence of Streptococcus pyogenes is determined by a variety of structural molecules, toxins and complex enzymes. Pyrogenic exotoxins cause fever, erythematous reactions, cytotoxic and immunological effects. Aim: To assess the frequency of speA, speB and speC genes in Chilean Streptococcus pyogenes strains and their association with the invasiveness of infections. Material and methods: The genes for pyrogenic exotoxins SpeA, SpeB and SpeC were determined by polymerase chain reactions in 114 strains of group A Streptococcus pyogenes isolated from Chilean patients with invasive or non invasive infections. Results: The gene for SpeA was present in 30.7% of isolates, the gene for SpeB was present in 69.3% and the gen for SpeC in 44.7% of isolates. The gene for SpeA was present in 20 of 33 invasive infections and in 15 of 81 non invasive infections (p <0.0001). On the contrary, the gene for SpeC was present in 11 of 33 invasive infections and in 41 of 81 non invasive infections (p <0.05). The frequency of speB was similar in invasive and non invasive infections. Conclusions: There is a clear relationship between the presence of SpeA genes and the severity of infections caused by Streptococcus pyogenes. (Rev Méd Chile 2000; 128: 27-34)
(Key Words: Exotoxins; Gene frecuency; Polymerase chain reaction)

Recibido el 27 de enero, 1999. Aceptado en versión corregida el 23 de noviembre, 1999.
Programa de Microbiología y Micología, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de
Medicina, Universidad de Chile.
¹ Tecnólogo Médico M. Sc. Microbiología
² Tecnólogo Médico
³ Bioquímico Farmacéutico, M. Sc. Microbiología.
⁴ Ayudantes Alumnas, carrera de Medicina

En Europa, Estados Unidos, Canadá y Chile, a partir de la década de 1980, se ha observado un cambio en la presentación clínica de las enfermedades invasivas asociadas a Streptococcus pyogenes, en términos de frecuencia y severidad^1-4. En nuestro país, este incremento motivó su notificación obligatoria al Ministerio de Salud (MINSAL) desde 1994. Entre julio de ese año y mayo de 1995 se notificaron 138 casos desde 23 de los 26 Servicios de Salud (SS) con una tasa de ataque por 100.000 habitantes que osciló entre 0,16 (SS Metropolitano Norte) y 2,00 (SS Metropolitano Central). La letalidad global resultó ser de 28,2%, observándose porcentajes aún más altos en los > 60 años (45%), en los cuadros de shock tóxico (60%) y en pacientes con septicemia y compromiso de tejidos blandos (48,7%) (Cofré y cols, comunicación oral, XII Congreso Chileno de Infectología 1995). Entre 1997 y 1998 se observó una aparente disminución del número de infecciones invasivas por este agente alcanzando un promedio de 2,6 casos al mes (fuente MINSAL). Sin embargo, durante enero de 1999 se notificaron 22 casos de infección severa por S. pyogenes, correspondiendo a 14 adultos y a 8 niños, con una tasa de letalidad de 41% (Abarca y cols, comunicación oral, XVI Congreso Chileno de Infectología 1999).

La virulencia de S. pyogenes está determinada por una variedad de moléculas estructurales, toxinas y enzimas complejas⁵. Las exotoxinas pirogénicas se han asociado a pirogenicidad, reacciones eritematosas, efectos inmunológicos y citotóxicos y son consideradas parte de la familia de los superantígenos que incluye, además, a las enterotoxinas estafilocócicas y a la toxina de shock tóxico 1 (TSST1)^6-11. Actualmente se sabe que SpeA y SpeC están codificadas por fagos, constituyendo elementos genéticos móviles, mientras que el gen que codifica SpeB está ubicado en el cromosoma bacteriano¹².

En varios estudios internacionales se ha observado que existen complicaciones más serias en pacientes de los cuales se han aislado cepas de S. pyogenes productoras de exotoxina A, que en pacientes con cepas productoras de las exotoxinas B o C, determinándose que la mayoría de las cepas inductoras de síndrome de shock tóxico producen SpeA^13-16. Sin embargo, el análisis de la presencia de los genes spe en el extranjero muestra variación tanto en su frecuencia como en su distribución. En nuestro medio existe escasa información al respecto, contándose sólo con datos de un reducido número de cepas tipificadas en el extranjero⁴. El objetivo de este estudio fue determinar la frecuencia de presentación de los genes speA, speB y speC en cepas chilenas de Streptococcus pyogenes y su distribución según tipo de infección de origen (infecciones invasivas vs no invasivas).

MATERIAL Y MÉTODO

Cepas: Se analizó un total de 114 cepas de S. pyogenes, 45 de ellas fueron aisladas de pacientes hospitalizados (36, H San Juan de Dios; 9, H San Borja Arriarán) y 58 de pacientes ambulatorios (Consultorios Area Occidente y Centro RM) entre enero de 1995 y enero de 1998. Otras 11 cepas fueron recolectadas entre marzo y agosto de 1999 (4, H Clínico U de Chile; 2, H San Juan de Dios; 2, H Higueras Talcahuano; 1 H Del Salvador; 1, H San José; 1 H FUSAT), correspondiendo sólo a cepas provenientes de pacientes hospitalizados. Todas las cepas fueron conservadas a -70°C en BHI-10% glicerol hasta su análisis. De las 114 cepas, 33 (28,9%) fueron aisladas de cuadros invasivos y 81 (71,1%) de infecciones no invasivas. Se definió cuadro invasor como aquella infección sistémica documentada o el compromiso profundo de piel (tejido celular subcutáneo). Se consideró como cuadro no invasor al compromiso superficial de piel y a las faringoamigdalitis no complicadas.

Identificación: Las cepas se identificaron a nivel de especie en base a características microscópicas, macroscópicas, sensibilidad a discos de bacitracina e hidrólisis del PYR y su diagnóstico definitivo se confirmó mediante aglutinación con látex (Pathox)¹⁷.

Detección de los genes de toxinas eritrogénicas: speA , speB y speC: El estudio de estos 3 genes se realizó mediante la técnica de reacción de polimerasa en cadena (RPC). Como ADN blanco se utilizó una suspensión bacteriana de 1x10⁸ UFC/ml, la cual posteriormente fue sometida a ebullición por 15’ y luego mantenida en hielo seco por 5’. Para la amplificación de speA y speB, se emplearon los partidores descritos por Musser y cols¹⁸ que permiten obtener un segmento de 708 pares de bases (pb) para speA y uno de 1.484 pb para speB. Para el estudio de speC se utilizaron los partidores descritos por Tyler y cols⁹, que generan un fragmento de 130 pb. El volumen final de la reacción fue de 35 µl (buffer 10 x 4 µl, Mg 50 nM 1,2 µl; dNTPs 200 nM 1 µl; 1 µl de cada uno de los partidores; Taq polimerasa 1U, ADN blanco 3 µl y agua bidestilada csp 35 µl). Las reacciones de amplificación fueron realizadas en un termociclador MJ Research Modelo PT 150, USA. Los programas empleados para la amplificación de cada uno de los genes se detallan a continuación. Para speA: 94°C por 4’ y 40 ciclos de denaturación a 95°C por 25’’, apareamiento de los partidores a 50°C por 1’ y extensión a 72°C por 1’. En el caso de speB: 94°C por 4’ y 30 ciclos de denaturación a 94°C por 1’, apareamiento de los partidores a 55°C por 2’ y extensión a 72°C por 2,5’. Finalmente, para speC: 94°C por 4’ y 30 ciclos de denaturación a 94°C por 2’, apareamiento de los partidores a 45°C por 2’ y extensión a 72°C por 1’. La extensión final fue de 72°C por 7’ para los tres genes. Los productos amplificados fueron analizados por electroforesis empleando geles de agarosa al 0,8% para los genes A y B y al 2% para speC. El ADN fue visualizado utilizando un transiluminador de luz UV después de la tinción con bromuro de etidio. Para la implementación de la técnica y como controles positivos se emplearon las cepas de S. pyogenes 1084 y 438. Estas cepas fueron caracterizadas genéticamente en USA y facilitadas gentilmente por la Dra. Ximena Berríos de la Pontificia Universidad Católica de Chile. La especificidad de la técnica fue realizada en las condiciones antes mencionadas, empleando cepas de S. aureus, S. agalactiae, S. pneumoniae y Streptococcus ß hemolítico grupo C, G y F.

Análisis estadístico: Los datos fueron comparados utilizando las pruebas de diferencia de proporciones unilateral con el apoyo del paquete computacional Statistica (Statsoft, Inc).

RESULTADOS

Se analizó una cepa por paciente y se clasificaron según el cuadro clínico del que fueron aisladas en infecciones invasivas y no invasivas (Tabla 1). De éstas últimas, el 60% correspondió a casos de faringoamigdalitis. En cambio, los cuadros invasivos se distribuyeron uniformemente sin que se observara predominio de alguna patología en particular.

Tabla 1. Distribución de 114 cepas de S. pyogens según cuadro clínico. Santiago, 1195-1198
Infecciones invasivas	Nº	Infecciones no invasivas	Nº
Piel y tejidos blandos (celulitis y	12	Faringoamigdalitis	46
fasceítis necrotizante)
Septicemia y shock séptico	10	Piodermis	15
Líquidos y cavidades estériles	11	Heridas infectadas	14
		Otras	6
Total	33	Total	81

Mediante la técnica de RPC se investigó la presencia de los genes speA, speB y speC (Figura 1), en 114 cepas de S. pyogenes. En la mayoría de las cepas analizadas 100/114 (87,7%) se evidenció la presencia de uno o más genes codificantes de toxinas pirogénicas y sólo 14 cepas no amplificaron para ninguno de los tres genes estudiados. Estas últimas correspondieron a cepas aisladas de cuadros no invasivos (3 casos de impétigo y 9 de faringoamigdalitis) y sólo 2 a cepas provenientes de cuadros invasivos.

FIGURA 1.Electroforesis de aplicones speA, speB de S. pyogenes (agarosa 0,8%). 1= Control negativo; 2= Control speB; 3= S. pyogens speB (+) (tejido); 4= S. pyogens speB (+) (hemo); 5= DNA ladder 100pB: 6= Control speA; 7= S. pyogens speA +) (tejido); 8= S. pyogens speA (+) (hemo)

En relación a la frecuencia de presentación de los genes codificantes de las toxinas pirogénicas, el gen speA se presentó en 30,7% (35/114) de las cepas estudiadas. En cambio, speB se detectó en la mayoría de los aislamientos (69,3%; 79/114) y speC en aproximadamente la mitad de ellos (44,7%; 51/114) (Figura 2).

FIGURA 2. Frecuencia de presentación de los genes speA, speB y speC en 114 cepas de S. pyogens. Santiago, 1995-1999.

Con respecto a la distribución global de los tres genes analizados en relación al tipo de presentación clínica, speA se evidenció en 20/33 (60,6%) de las cepas aisladas de infecciones invasivas y sólo en 15/81 (18,5%) de cepas provenientes de infecciones no invasivas (p <0,0001). En cambio, speB se detectó en 26/33 (78,8%) y 63/81 (77,7%) de las cepas de cuadros invasivos y no invasivos, respectivamente. El gen speC se encontró en 11/33 (33,3%) de las cepas de S. pyogenes provenientes de cuadros invasivos y en 41/81 (50,6%) de las cepas aisladas de cuadros no invasivos (Figura 3), encontrándose diferencia significativa (p <0,05).

FIGURA 3. Distribución de los genes speA, speB y speC en 114 cepas de S. pyogens según tipo de infección (invasiva y no invasiva). Santiago, 1995-1999.

 

El análisis de la distribución de los genes speA, speB y speC en cada cepa, reveló la existencia de 7 genotipos. Los genotipos más frecuentemente identificados correspondieron a speB-C (27,2%), speA-B (20,2%) y speB (17,5%).

Los resultados en relación a la frecuencia de presentación de los distintos genotipos identificados y su distribución según tipo de infección, revelaron asociación entre la presencia del genotipo speA-B e infección invasiva (p <0,0001) y entre speB-C e infección no invasora (p= 0,01) (Tabla 2).

Tabla 2. Distribución de los genotipos de 114 cepas de S. pyogens según tipo de infección (invasiva, no invasiva). Santiago, 1995-1999.
Genotipos	I. invasiva		I. no invasiva		Total
	n	%	n	%	n	%
speA	1	3,0	5	6,2	6	5,2
speA + speB	15	45,5	8	9,9	23	20,2
speA + speB + speC	3	9,1	2	2,5	5	4,4
speA + speC	1	3,0	0	-	1	0,9
speB	4	12,1	16	19,7	20	17,5
speB + speC	4	12,1	27	33,3	31	27,2
speC	3	9,1	11	13,6	14	12,3
Ninguno	2	6,1	12	14,8	14	12,3
Total	33		81		114

DISCUSIÓN

La incidencia de infecciones invasivas asociadas a cepas de S. pyogenes ha aumentado en los últimos años sin que exista aún una explicación clara para este fenómeno. S. pyogenes produce varias toxinas que podrían, en parte, ser responsables de estas graves manifestaciones clínicas. Las exotoxinas pirogénicas A, B y C han sido implicadas en el desarrollo de cuadros graves al clasificarse como superantígenos5. Estas proteínas juegan un papel importante en la respuesta inmune aguda a través de la liberación de citoquinas proinflamatorias tales como interferón gama, interleuquina 6 y factor de necrosis tumoral alfa. Además, comparten la capacidad de inducir fiebre y de aumentar la susceptibilidad al shock endotóxico^5,11.

La tasa de mortalidad de las infecciones severas causadas por S. pyogenes descrita en la literatura fluctúa entre 20% para fasceítis necrotizante y 100% para miositis¹. Estudios de vigilancia epidemiológica realizados en nuestro país señalan que la letalidad según forma clínica es de 13,3% para infecciones severas de piel y tejidos blandos, 48,7% para septicemia y 60% en el caso de shock tóxico (Cofré y cols, comunicación oral, XII Congreso Chileno de Infectología 1995). El análisis de 40 casos notificados entre octubre de 1998 y julio de 1999, reveló una letalidad global de 32,5% para estas infecciones, siendo ésta de 60% en adultos y 16% en niños. Los factores predisponentes más frecuentes fueron varicela (42,5%) y traumatismos o heridas (12,5%). En 11 pacientes (27,5%) no se encontró ningún factor asociado apoyando el rol potencialmente patógeno de este agente aún en personas previamente sanas¹⁹.

Numerosas investigaciones realizadas en Estados Unidos y Europa^7,9,10,18,20, han demostrado asociación entre la presencia de la exotoxina pirogénica A y el síndrome de shock tóxico estreptocócico. Más aún, estudios recientes han evidenciado la existencia de distintos alelos del gen speA e incluso se ha relacionado la presencia de algunos de ellos, específicamente speA2 y speA3, en cepas responsables de los cuadros más severos^8,21.

Nuestros resultados apoyan la asociación entre la presencia del gen codificante de la exotoxina A y cuadros clínicos invasivos, sugiriendo indirectamente que este superantígeno contribuye a una mayor virulencia de S. pyogenes. Si bien la técnica de RPC demuestra la presencia y no la expresión de un gen, el poseer la información genética convierte a las bacterias portadoras en potenciales productoras de toxina. Estudios internacionales informan que hasta el 90% de las cepas productoras de síndrome de shock tóxico (SST), expresan la toxina^7,22.

La ausencia de speA en aislamientos de pacientes con enfermedad severa, hecho que también se ha observado en el extranjero, podría estar indicando la participación de otros superantígenos como el factor mitogénico y el superantígeno estreptocócico en el proceso infeccioso, otros factores de virulencia y/o la presencia de factores predisponentes del huésped²³.

Por el contrario, la detección del gen speA en cepas provenientes de cuadros no invasivos podrían indicar la existencia de diferencias genéticas entre las cepas, dadas por la presencia de alelos de speA distintos a los relacionados con cuadros severos^8,21. Este fenómeno podría también ser explicado por una deficiencia o defecto de la exotoxina A, puesto que en investigaciones anteriores se ha observado un bajo nivel de producción de esta proteína en episodios menos severos²².

En cuanto a los genes speB y speC, nuestros resultados concuerdan con lo descrito en la literatura internacional. El gen de la exotoxina pirogénica B se presentó en la mayoría de las cepas estudiadas, hecho probablemente asociado al carácter cromosomal de su origen. En cambio, speC se detectó en aproximadamente la mitad de los aislamientos. Al igual que speA, este gen no presenta un carácter universal posiblemente debido a que se encuentra codificado en un bacteriófago. A diferencia de los genes de las toxinas pirogénicas A y C, speB parece no asociarse a ninguna manifestación clínica en particular, haciendo difícil atribuirle algún rol dentro de la patogenicidad de S. pyogenes.

Sin embargo, el análisis de la distribución de los genotipos revela una asociación entre el genotipo speA + speB e infección invasiva y entre la combinación speB + speC e infección no invasiva en estos casos. La asociación del genotipo A-B con infecciones severas se relaciona con el predominio de A en cuadros invasivos, como se discutió anteriormente.

En cuanto a las 14 cepas en que no se demostró la presencia de ningún gen, doce de ellas correspondieron a aislamientos provenientes de cuadros no invasivos, predominantemente faringitis (75%). Este hecho sugiere que las cepas causantes de la infección faríngea en nuestro medio no constituyen el principal reservorio de cepas asociadas a cuadros severos de piel y tejidos blandos²⁴.

Los resultados del presente estudio indican una clara asociación entre la portación de los genes codificantes de la exotoxina pirogénica A y la severidad de los cuadros clínicos causados por S. pyogenes. La detección de estos genes y la caracterización de los alelos de speA, en conjunto con la determinación de los serotipos M predominantes, nos permitirán caracterizar mejor a este agente y aportar al conocimiento de la realidad epidemiológica local.

Correspondencia a: María Teresa Ulloa F. Independencia 1027. Santiago, Chile. Fono: 6786157. Fax: 7355855. E-mail: mtulloa@machi.med.uchile.cl

Agradecemos a los profesionales del Laboratorio de Microbiología de los siguientes hospitales: San Juan de Dios, Dr Félix Bulnes C, San Borja Arriarán, JJ Aguirre, Las Higueras, Del Salvador, San José y FUSAT por su valiosa cooperación en este estudio.

REFERENCIAS

1. WEISS KA, LAVARDIÈRE M. Group A streptococcus invasive infections: a review. Can J Surg 1997; 40: 18-25.

2. FIORENTINO TR, BEAL B, MSHAR P, BESSEN DE. A genetic-based evaluation of the principal tissue reservoir for group A streptococci isolated from normally sterile sites. J Infect Dis 1997; 176: 177-82.

3. LAGOS R, BRAVO S, HORWITZ I. Infecciones graves por Streptococcus beta hemolítico grupo A. Rev Chil Pediatr 1987; 58: 320-3.

4. BERRÍOS X, BEDREGAL P, RAMÍREZ G, RIEDEL J. Infección por estreptococo grupo A invasor, caracterización bacteriológica. Rev Chile Infect 1994; 11: 26-34.

5. SALYERS A and DIXIE WHITT. Scarlet fever, toxic shock syndrome and the return of severe invasive streptococcal disease. Bacterial Pathogens: a molecular approach. Washington, DC: ASM Press, 1994; 122-9.

6. KAUFHOLD A, PODBIELSKI A, JOHNSON DR, KAPLAN EL, LÜTTINCKEN R. M protein gene typing of Streptococcus pyogenes by nonradioactively labeled oligonucleotid probes. J Clin Microbiol 1992; 30: 2391-7.

7. UPTON M, CARTER PE, MORGAN M, EDWARDS GF, PENNINGTON TH. Clonal structure of invasive Streptococcus pyogenes in Northern Scotland. Epidemiol Infect 1995; 115: 231-41.

8. NELSON K, SCHLIEVERT PM, SELANDER RK, MUSSER JM. Characterization and clonal distribution of four alleles of the speA gene encoding pyrogenic exotoxin A (scarlet fever toxin) in Streptococcus pyogenes. J Exp Med 1991; 174: 1271-4.

9. TYLER SD, JOHNSON WM, HUANG JC, ASHTON FE, WANG G, LOW DE ET AL. Streptococcal erithrogenic toxin genes: detection by polimerase chain reaction and association with disease in strains isolated in Canada from 1940 to 1991. J Clin Microbiol 1992; 30: 3127-31.

10. FAGIN U, HAHN U, GRÔTZINGER J, FLEISCHER B, GERLACH D, BUCK F ET AL. Exclusion of bioactive contaminations in Streptococcus pyogenes erythrogenic toxin A preparations by recombinant expression in Escherichia coli. Infect Immun 1997; 65: 4725-33.

11. MURR C, WIDNER B, GERLACH D, WERNER FELMAYER G, DIERICH MP, WACHTER H ET AL. Streptococcal erythrogenic toxins induce tryptophan degradation in human peripheral blood mononuclear cells. Int Arch Allergy Immunol 1997; 114: 224-8.

12. NORRBY-TEGLUND A, HOLM SE, NORGREN M. Detection and nucleotide sequence analysis of the speC gene in Swedish clínical group A streptococcal isolates. J Clin Microbiol 1994; 32: 705-9.

13. MUSSER JM, HAUSER AR, KIM MH, SCHLIEVERT PM, NELSON K, SELANDER RK. Streptococcus pyogenes causing toxic shock-like syndrome and other invasive disease: clonal diversity and pyrogenic exotoxin expression. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 2668-72.

14. HAUSER AR, STEVENS DL, KAPLAN EL, SCHLIEVERT PM. Molecular analysis of pyrogenic exotoxins from Streptococcus pyogenes isolates associated with toxic shock-like syndrome. J Clin Microbiol 1991; 29: ???

15. KISHISHITA M, TAKEDA Y, MINAMIDE W, FUJITA K. Distribution of the genes of streptococcal pyrogenic exotoxins among clinical isolates of Streptococcus pyogenes from the pharynx. Kansenshogaku Zasshi 1995; 69: 568-71.

16. YU CE, FERRETI JJ. Frequency of the erythrogenic toxin B and C genes (speB and speC) among clinical isolates of group A streptococci. Infect Immun 1991; 59: 211-5.

17. RUOFF KL. Streptococcus. En: Murray PR, ed Manual of clinical microbiology. Washington, DC: ASM Press, 1995; 299-302.

18. MUSSER JM, KAPUR V, SZETO J, PAN X, SWANSON DS, MARTIN DR. Genetic diversity and relationships among Streptococcus pyogenes strains expressing serotype M1 protein: recent intercontinental spread of a subclone causing episodes of invasive disease. Infect Immun 1995; 63: 994-1003.

19. COMITÉ DE INFECCIONES EMERGENTES DE LA SOCIEDAD CHILENA DE INFECTOLOGÍA. Infecciones invasivas por Streptococcus beta hemolítico grupo A en Santiago. Boletín de la Sociedad Chilena de Infectología 1999; 7: 3.

20. BLACK CM, TALDINGTON DF, MESSMER TO, FACKLAM RR, HORNES E, OLSVIK O. Detection of streptococcal pyrogenic exotoxin genes by a nested polimerase chain reaction. Mol Cell Probes 1993; 7: 255-9.

21. MATSUMOTO M, MURAI T, ICHIYAMA S, SAITO M, ARAKAWA Y, OHTA M. Prevalence of the speA2 and speA3 alleles in Streptococcus pyogenes isolated from TSLS patients in Japan. FEMS Microbiol Lett 1997; 150: 233-7.

22. MUSSER JM, HAUSER AR, KIM MH, SCHLIEVERT PM, NELSON K, SELANDER RK. Streptococcus pyogenes causing toxic-shock-like syndrome and other invasive diseases: clonal diversity and pyrogenic exotoxin expression. Proc Natl Acad Sci 1991; 88: 2668-72.

23. NAKASHIMA K, ICHIYAMA S, INUNA Y, HASEGAWA Y, OHTA M, OOE K ET AL. A clinical and bacteriologic investigation of invasive streptococcal infections in Japan on the basis of serotypes, toxin production and genomic DNA fingerprints. Clin Infect Dis 1997; 25: 260-6.

24. BESSEN DE, SOTIR CM, READDY TL, HOLLINGSHEAD SK, BEALL B. Genetic correlates of throat and skin isolates of group A Streptococci. J Infect Dis 1999; 179: 627-36.