Vigilancia sistemática de virus
influenza, respiratorio sincicial,
parainfluenza y adenovirus, en niños
ambulatorios con infecciones
respiratorias agudas

Systematic surveillance of influenza,
syncytial respiratory, parainfluenza and
adenovirus in children with acute
respiratory infections

Rosanna Lagos Z, Luis F Avendaño C, Myron M Levine

Background: The efficacy of influenza vaccination programs depends on the antigenic similitude between vaccine and the influenza virus circulating in the community. Therefore the surveillance of clinical activity and antigenic features of influenza virus is of utmost importance. Aim: To perform a systematic surveillance of clinical activity and antigenic characteristics of influenza virus. Material and methods: Since 1996 and during the cold months (May to September), 20 samples of upper respiratory secretions per week, were obtained from children with acute respiratory infections consulting to the emergency room of a public hospital. Using indirect immunofluorescence and cellular cultures, the presence of influenza, syncytial respiratory, parainfluenza and adenovirus was assessed. The weekly number of consultations in the emergency room and the number of hospital discharges due to acute respiratory infections, were registered. Results: Influenza and syncytial respiratory were the predominant virus detected since 1996. In 1996 and 1998, the weekly detection of influenza virus followed a single seasonal curve. The maximal weekly positively results reached 85 and 80% of the obtained samples, respectively. During 1997, two curves of influenza virus activity were observed, but none reached more than 50% of weekly positive samples. The demand for outpatient care evolved in parallel to the weekly detection of influenza virus. The hospital discharges due to acute respiratory infections paralleled the syncytial respiratory virus detection rates. Conclusions: This surveillance model is effective for the detection of influenza and other virus responsible for acute respiratory infections and their relationship with the demand for health care during the cold months.
(Key Words: Adenoviridae; Influenza; Parainfluenza virus type; Respiratory tract infections; Viruses)

Recibido el 21 de abril, 1999. Aceptado el 8 de junio, 1999.
Trabajo financiado con fondos de NIAID (VTEU-N01-AI-45251 y ICIDR-U01-AI-35948) de la
Fundación Fogarty (D43 TW 00907) y parcialmente por Proyecto FONDECYT #1980892.
CVD-Chile, Hospital Roberto del Río, Servicio de Salud Metropolitano Norte, Santiago, Chile. Departamento de Microbiología, Unidad de Virología, Facultad de Medicina Campus Norte,
Universidad de Chile. Center for Vaccine Development, University of Maryland
School of Medicine, Baltimore, MD, USA.

Los virus influenza, particularmente el virus influenza tipo A, se caracterizan por su capacidad para experimentar mutaciones y reorganizaciones genéticas que pueden determinar cambios antigénicos de mayor o menor magnitud en sus proteínas externas, y que resultan en la aparición de variantes virales que difieren parcial o totalmente de aquellas inmunológicamente conocidas por la población¹. Como consecuencia, la eficacia de los programas de vacunación contra esta enfermedad depende prioritariamente de la similitud antigénica entre la vacuna utilizada y los virus influenza circulantes en la comunidad. Con este propósito, la Organización Mundial de la Salud ha liderado la formación de una red mundial dedicada a vigilar la actividad clínica de la influenza y las características antigénicas de los virus responsables de la enfermedad². A fin de colaborar en este esfuerzo global, desde 1996 hemos venido desarrollando una rutina de vigilancia de casos sospechosos y de recolección de muestras de secreción respiratoria para aislamiento de virus influenza, a través de un muestreo semanal de pacientes ambulatorios con infecciones respiratorias agudas (IRA) atendidos en la Unidad de Emergencias del Hospital de Niños Roberto del Río, durante la temporada fría. La vigilancia se ha centrado en la población pediátrica por cuanto se sabe que este grupo etario juega un rol importantísimo en la diseminación de cepas epidémicas de virus influenza. Simultáneamente, y a fin de obtener una visión más completa de las etiologías de las IRAs prevalentes en la comunidad abierta, el análisis de las muestras recolectadas ha incluido también la búsqueda de virus respiratorio sincicial (VRS), parainfluenza y adenovirus.

Numerosas comunicaciones nacionales han dado cuenta de las etiologías virales de las IRA bajas en niños hospitalizados^3-13 y unas pocas han informado sobre la detección de ciertos virus respiratorios en pacientes provenientes del primer nivel de atención^11-13. A diferencia de lo publicado hasta ahora, el estudio aquí descrito constituye la primera investigación nacional destinada a identificar las principales etiologías virales de IRA mediante un muestro sistemático de pacientes ambulatorios, y a través de varios inviernos sucesivos. La ventaja de esta metodología de muestreo sistemático es que, además de informar acerca de la frecuencia relativa de los agentes virales en una determinada serie clínica, proporciona una visión en tiempo real de la circulación de los virus a lo largo de la estación de IRAs, a la vez que permite comparar sus patrones de comportamiento en diferentes años. De esta manera, el estudio virológico de un número discreto de casos contribuye de manera muy significativa y eficiente a comprender el perfil de morbilidad y los fenómenos de demanda asistencial generados por las IRAs durante la temporada fría.

MATERIAL Y MÉTODO

Diseño y criterios de muestreo. El protocolo clínico y el documento de consentimiento fueron aprobados por el Comité de Etica del Servicio de Salud Metropolitano Norte y por el Institutional Review Board de la Universidad de Maryland en Baltimore. La vigilancia se concentró en la temporada fría, entre los meses de mayo y septiembre de cada año, con ligeras variaciones en las fechas de inicio y término. Dos auxiliares de enfermería de CVD-Chile permanecieron en la Unidad de Emergencia del Hospital Roberto del Río, de lunes a viernes en horario diurno, para pesquisar pacientes que al momento de la consulta reunieran las siguientes condiciones: a) 3 a 9 años de edad, temperatura oral o rectal ³38,3°C, rinorrea, faringitis, tos, mialgias o compromiso del estado general; b) 0 a 2 años de edad, temperatura rectal ³38,3°C, sin signos clínicos que explicaran la fiebre; c) 0 a 2 años de edad, temperatura rectal ³38,3°C, rinorrea, faringitis, tos u otitis media; d) 0 a 2 años de edad y hallazgos compatibles con infección del tracto respiratorio bajo (laringitis, bronquitis, síndrome bronquial obstructivo, neumonía, neumonitis o bronconeumonía). Semanalmente se recolectaron hasta 10 muestras de secreción respiratoria de niños de 3 a 9 años y otras diez de pacientes de 0 a 2 años (máximo 20 en total), homogéneamente repartidas a lo largo de los días de trabajo. En cada caso, la madre o el cuidador responsable firmó un documento de consentimiento, autorizando la participación del menor y contestó un breve cuestionario sobre la sintomatología que motivó la visita a la posta. Paralelamente, las auxiliares registraron el número diario de niños con IRA atendidos en la Unidad de Emergencias y el número de pacientes con diagnóstico de IRA baja (bronquitis, síndrome bronquial obstructivo, neumonitis, neumonía, bronconeumonía, etc) egresados de las unidades de internación del Hospital de Niños Roberto del Río. Los resultados de los estudios virológicos y las estadísticas de morbilidad fueron agrupados por semanas epidemiológicas y expresados en números absolutos.

Procedimiento de obtención de las muestras de secreción respiratoria. El material para los análisis virológicos fue obtenido mediante una técnica de lavado nasal adaptada por personal de CVD-Chile. En breve: los pacientes se ubicaron en posición semi-sentada, sobre una camilla o sostenidos por la madre. Mediante una jeringa, un operador instiló 2,0 a 2,5 ml de suero salino estéril en una narina, mientras inmovilizaba la cabeza del niño ligeramente inclinada hacia atrás, sosteniéndola por la frente. Utilizando una punta de plástico roma conectada a un tubo de recolección y a una bomba de vacío, un segundo operador aspiró el fluido instilado, apoyando la punta de plástico sobre el labio superior, adyacente al borde de la abertura nasal, manteniendo el ala opuesta de la nariz suavemente presionada con un dedo. El mismo procedimiento se repitió en la narina opuesta. Una vez finalizado el lavado se retiraron el tapón de goma y las conecciones del tubo de recolección y se agregó 1 ml de un estabilizador viral que contiene amphotericina B, 2,5 µg/ml; penicillina G, 10.000 U/ml; sulfato de estreptomicina, 50.000 µg/ml, y albúmina bovina al 0,5%. Por último se cerró el tubo con una tapa rosca, se invirtió varias veces para mezclar la muestra con el estabilizador y se depositó en un recipiente con hielo hasta su recepción en el laboratorio.

Diagnóstico virológico. Las muestras de lavado nasal se mantuvieron en hielo y se transportaron al laboratorio de la Unidad de Virología (Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Campus Norte) antes de transcurridas 6 h a contar de su obtención. En todas ellas se investigó la presencia de virus influenza, virus parainfluenza, VRS y adenovirus con técnica de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos monoclonales (gentilmente proporcionados por los Drs. L Anderson, CDC, Atlanta y P Pothier, Dijon, Francia) y conjugados comerciales (Sigma, # F2012). Paralelamente se inocularon células MDCK para el aislamiento de virus influenza y parainfluenza, y HEp-2 para VRS, parainfluenza y adenovirus, según procedimientos previamente descritos^8,11. Los excedentes de las muestras de lavado nasal fueron congelados a -70°C y conservados como respaldo. Los cultivos fueron examinados a diario para detectar efecto citopático; cuando lo hubo, la identidad del virus fue confirmada mediante inmunofluorescencia. Los cultivos sin efecto citopático al cabo de siete días también fueron sometidos a una inmunofluorescencia indirecta antes de ser eliminados. El diagnóstico virológico consideró el resultado de la inmunofluorescencia indirecta practicada a la muestra clínica en conjunto con el resultado del cultivo. Así, una muestra fue informada positiva cuando se detectó un virus en la inmunofluorescencia, en el cultivo, o en ambos exámenes. Cuando se detectó la presencia de más de un virus se procedió a repetir el estudio; un caso fue considerado "infección mixta" sólo si la repetición volvió a demostrar positividad para más de un virus. El investigador responsable del diagnóstico virológico (LFA) actuó en desconocimiento de la identidad y la sintomatología de los sujetos.

Tipificación de virus influenza. Los cultivos positivos a virus influenza fueron congelados a -70°C y posteriormente enviados en hielo seco al laboratorio de referencia de Influenza de la Organización Mundial de la Salud, en el Centro para Control y Prevención de Enfermedades de Atlanta, para su tipificación antigénica mediante técnica de inhibición de la hemaglutinación con antisueros de referencia.

RESULTADOS

Tolerancia y practicabilidad del procedimiento de obtención de muestras de secreción respiratoria. La técnica de lavado nasal utilizada en este estudio es rápida, bien tolerada, y permitió recuperar muestras de lavado nasal superiores a 3 ml en la gran mayoría de los casos. En ninguno de los 1.199 participantes sometidos a esta técnica observamos epistaxis o coloración sanguinolenta de la muestra, complicaciones que son relativamente frecuentes cuando se practica aspiración nasofaríngea con sonda.

Rendimiento del estudio virológico en los tres períodos de vigilancia. En la parte superior de la Tabla 1 se muestra el total de muestras analizadas, el rendimiento del estudio virológico y el período cubierto por cada temporada de vigilancia. La positividad global de la investigación de virus fue bastante pareja en las tres temporadas, pese a que hubo algunas diferencias en el número total de muestras recolectadas y en las fechas de inicio y término de cada período. Los virus influenza y respiratorio sincicial predominaron ampliamente en las tres temporadas, con escasas variaciones de año a año. Por el contrario, la proporción de muestras positivas a adenovirus, virus parainfluenza y a dos agentes virales fue menos frecuente y más variable de una temporada a otra. La parte inferior de la Tabla 1 presenta los resultados de la identificación de virus en cifras absolutas, esto es, contabilizando separadamente los dos agentes detectados en los casos de infección mixta. Las asociaciones virales observadas en estos 33 casos se detallan en la Tabla 2.

Tabla 1. Rendimiento del estudio virológico en tres períodos de vigilancia (1996, 1997 y 1998)
		Años
		1996		1997		1998
Período de vigilancia		28/IV al 28/IX		16/VI al 1/XI		3/V al 3/10
Semanas epidemiológicas		18 a 39		25 a 44		18 a 39
Total muestras recolectadas		359		399		441
	Sin identificación viral: n, (%)	189	(52,6)%	258	(64,7)%	252	(57,1)%
	Con identificación de VRS: n, (%)	66	(18,4)%	75	(18,8)%	103	(23,4)%
	Con identificación de virus influenza: n, (%)	48	(13,4)%	60	(15,0)%	60	(13,6)%
	Con identificación de virus de parainfluenza: n, (%)	19	(5,3)%	3	(0,8)%	6	(1,4)%
	Con identificación de adenovirus :n, (%)	12	(3,3)%	1	(0,3)%	14	(3,2)%
	Con identificación de dos virus: n, (%)	25	(7,0)%	2	(0,5)%	6	(1,4)%
Total de virus detectados		195		143		195
	Respiratorio sincicial	85		77		108
	Influenza	63		61		63
	Parainfluenza	27		3		7
	Adenovirus	20		2		17

 

Tabla 2. Asociaciones virales detectadas en 33 muestras de lavado nasal, de niños con IRA
Asociaciones	Casos
	n
V respiratorio sincicial + influenza	13
V respiratorio sincicial + adenovirus	9
V respiratorio sincicial + parainfluenza	4
V Influenza + parainfluenza	4
V Influenza + adenovirus	2
V Parainfluenza + adenovirus	1

Analizados en conjunto, los resultados de los tres períodos de vigilancia mostraron que el aporte del cultivo a la positividad final de la investigación virológica fue diferente para cada uno de los cuatro virus estudiados. Así, del total de 244 muestras positivas para VRS, 222 (91%) fueron pesquisadas mediante la inmunofluorescencia indirecta practicada a la muestra clínica, en tanto que la inoculación de células HEp-2 agregó sólo 22 detecciones. Con adenovirus y virus parainfluenza ocurrió lo inverso: respectivamente, 20 de las 26 (77%) y 27 de las 28 (96%) detecciones derivaron exclusivamente del cultivo. En el caso de los virus influenza, 122 de las 168 muestras positivas fueron detectadas por la inmunofluorescencia inmediata y 46 (28%) por la inoculación de células MDCK.

Ciclos estacionales de virus influenza y respiratorio sincicial. La Figura 1 ilustra los números absolutos de muestras con identificación de VRS y virus influenza, por semanas epidemiológicas, en los años 1996 (Figura 1a), 1997 (Figura 1b) y 1998 (Figura 1c). Así presentados, los datos permiten derivar varias observaciones adicionales a las expuestas en el párrafo anterior. En los tres períodos, el número semanal de muestras positivas para VRS delineó una curva compuesta por una etapa de ascenso, una de máxima positividad y una fase de declinación. La amplitud y el momento de máxima positividad de estos ciclos fue variable pero su duración fue llamativamente homogénea; de hecho, en las tres curvas se reconoce un lapso de 8 a 9 semanas consecutivas durante las cuales se detectó VRS en al menos 25% de las muestras recolectadas (semanas 24 a 31; 26 a 33 y 22 a 30, en 1996, 1997 y 1998, respectivamente). La Figura 1 también ofrece información interesante respecto del comportamiento de los virus influenza. En 1b (1997), por ejemplo, se observan dos curvas de positividad, ambas de menor amplitud que las de los años 96 y 98. En 1c (1998), el momento de máxima identificación de virus influenza fue considerablemente más temprano que en los otros dos años, tanto así que la vigilancia no alcanzó a detectar una fase de ascenso.

 

Por último, la Figura 1 sugiere que la intensidad de circulación de VRS y de virus influenza fue mayor en los años 1996 y 1998 que en 1997, aun cuando en ambos casos las tasas globales de detección resultaron bastante similares en las tres temporadas (Tabla 1). Por ejemplo, en las semanas 24 de 1996 y 18 de 1998 se detectó virus influenza en más de 80% de las muestras recolectadas, de lo cual se infiere que durante estas semanas al menos 4 de cada 5 casos de IRA que motivaron una consulta al centro centinela fueron causados por virus influenza. Así mismo, en la semana 28 de 1996 y 26 de 1998 se identificó VRS en 80 y 85% de las muestras, respectivamente. En 1997, en cambio, ninguno de los virus alcanzó una positividad superior a 50%, en ninguna de las semanas de la vigilancia.

Relación entre la identificación de virus influenza y VRS los eventos de morbilidad. En la Figura 2 se presentan simultáneamente las cifras semanales de muestras con detección de virus influenza y el número absoluto de consultas ambulatorias por IRA atendidas en la Unidad de Emergencias del Hospital Roberto del Río. De manera análoga se muestran en la Figura 3 los datos de identificación de VRS y el número semanal de pacientes egresados con diagnóstico de IRA baja desde las unidades de internación del mismo hospital. De esta forma se aprecia una notable sincronía entre la positividad semanal de virus influenza y la demanda de atención ambulatoria por IRA, y la de VRS con los egresos por IRA baja. Más aún, examinando comparativamente las gráficas de los tres períodos se puede observar que los años con mayor incremento estacional de la morbilidad ambulatoria y hospitalaria coincidieron con aquellos en que la identificación de VRS y virus influenza alcanzaron tasas más altas (1996 y 1998).

 

DISCUSIÓN

En adultos y niños sanos las consecuencias de la infección por virus influenza se limitan a algunos días de fiebre, acompañada de síntomas respiratorios y molestias generales más o menos intensas, que obligan a un período similar de ausentismo laboral o escolar. Sin embargo, esta enfermedad representa una potencial amenaza vital para ciertos grupos de individuos como los ancianos, los inmunocomprometidos y los portadores de afecciones pulmonares, renales o cardíacas crónicas¹⁴. La piedra angular del control de este problema de salud pública, que afecta a todos los países, es la vacunación eficaz de los sujetos con alto riesgo de complicaciones¹⁴. Esto exige un monitoreo permanente, global y coordinado, que permita detectar precozmente la aparición de nuevos virus influenza capaces de producir brotes epidémicos y dar paso a la oportuna preparación de vacunas adecuadas para impedir su propagación. Nuestro trabajo cumplió eficientemente el propósito de contribuir a esta causa global, a la vez que aportó información de alto interés local acerca del comportamiento epidemiológico y las principales etiologías de IRA en pacientes ambulatorios. Nos parece importante destacar que estos resultados fueron posibles con una inversión relativamente modesta en recursos humanos y de laboratorio. A nuestro juicio, varios elementos metodológicos y prácticos determinaron la eficiencia de este modelo de vigilancia. Entre los primeros, identificamos la focalización de la actividad en sujetos de edad pediátrica (reconocidos como los principales transmisores de influenza y de otros virus causantes de IRA), y el carácter sistemático de los criterios clínicos de muestreo y del número de sujetos estudiados por unidad de tiempo. En lo práctico, estimamos que la técnica de lavado nasal utilizada para obtener las muestras y su transporte rápido y cuidadoso (en frío) al laboratorio, contribuyeron de manera significativa a optimizar el rendimiento de la investigación virológica.

En lo referente al rendimiento relativo de las técnicas utilizadas para el diagnóstico virológico, este trabajo reproduce lo comunicado en estudios anteriores^8,15 y reitera que, para los fines de la investigación clínica de rutina de los niños menores de dos años hospitalizados por IRA baja adquirida en la comunidad, en quienes la etiología más probable es el VRS^3,4,6,11,12, la inmunofluorescencia indirecta ofrece amplias ventajas con respecto al cultivo, considerando su alto rendimiento y rapidez, asociada a menor costo y complejidad técnica^8,11. No obstante, un resultado negativo debe ser interpretado con precaución, particularmente cuando existen elementos clínicos para sospechar infección por adenovirus.

El comportamiento estacional de las IRA en las zonas geográficas de clima templado es clásicamente entendido como una consecuencia de factores meteorológicos y de condiciones de mayor hacinamiento poblacional, que son inherentes a la temporada fría, y que facilitan la transmisión de estas enfermedades. Por otra parte, se sabe que el crecimiento urbano excesivo y el desarrollo industrial desorganizado acarrean fenómenos de contaminación del aire que pueden asociarse a mayor riesgo de IRAs complicadas, de bronconeumonías e incluso de muertes, particularmente en individuos con patologías predisponentes^16-23. Estas condiciones adversas naturales y artificiales coexisten en las principales ciudades de la zona centro-sur de Chile y se potencian mutuamente durante la estación fría, con especial intensidad en la Región Metropolitana. Si bien esto explica el ostensible aumento de la incidencia de enfermedades respiratorias durante el período otoño-invierno, hasta ahora no se han propuesto explicaciones concretas para la acumulación violenta de casos de IRA (ampliamente publicitadas por los medios nacionales de comunicación), que se observa en momentos puntuales de algunas temporadas, ni para la ocurrencia de estaciones en que la carga de morbilidad por IRA excede o no alcanza las fluctuaciones esperadas, aun cuando las mismas circunstancias meteorológicas y ambientales se repiten de año en año. Este estudio ofrece información etiológica que contribuye a comprender estos fenómenos. Específicamente, hemos documentado que la incidencia de infecciones respiratorias bajas (estimada a través de los egresos hospitalarios) varía a lo largo de la temporada fría en estrecha asociación temporal y en forma proporcional a la prevalencia de infección por VRS en sujetos provenientes de la comunidad abierta. Además, hemos demostrado que la demanda de atención ambulatoria por IRA sigue un curso paralelo a la prevalencia de infección por virus influenza. Aunque nuestra actividad de vigilancia estuvo concentrada en un sólo centro asistencial, estos resultados fueron consistentes con el perfil de morbilidad observado en toda la Región Metropolitana, en los tres períodos cubiertos por la vigilancia.

En cualquier época del año, las infecciones respiratorias agudas (IRA) ocupan la primera frecuencia entre las causas de hospitalización y consulta médica ambulatoria en niños chilenos²⁴. Debido a la magnitud de este problema de salud pública, desde 1990 el Ministerio de Salud ha venido desarrollando un Programa Nacional de Prevención y Control de IRA, cuyo propósito es optimizar el manejo de estas enfermedades en todos los niveles de la red asistencial. El Programa cuenta con un sistema de vigilancia epidemiológica basado en la observación de las consultas por morbilidad respiratoria en 16 centros centinelas; ocho de ellos se encuentran en la zona Metropolitana, cuatro en la V y 4 en la VIII región. Este sistema hace posible reconocer el momento de aparición de los brotes de IRA y gatillar la oportuna implementación de medidas para reforzar la capacidad de respuesta de los establecimientos de salud durante los períodos de mayor demanda asistencial. Además, la información reunida a lo largo de años sucesivos ha permitido delinear canales de comportamiento endémico de IRAs, y establecer si la carga de morbilidad observada en un determinado instante y localidad corresponde o sobrepasa los márgenes esperados²⁶. Hasta ahora, sin embargo, el Programa IRA no ha implementado un mecanismo de monitoreo sistemático de los virus respiratorios circulantes en la comunidad. En este trabajo documentamos que esta información etiológica contribuye de manera significativa a comprender la dinámica de la actividad clínica de las IRA en la población. El modelo de vigilancia sistemática aplicado en este estudio es fácilmente reproducible y altamente eficiente en relación a su costo. Su implementación en unos pocos centros sensores, estratégicamente distribuidos a lo largo del país, aportaría información de gran utilidad operativa para el Programa IRA.

Correspondencia a: Dra. Rosana Lagos. Centro para vacunas en desarrollo - Chile. Hospital Riberto del Río. Avda. Zañartu 1085 (4º piso). Independencia, Santiago. Fono: (65-2) 737 5022. Fax: (56-2) 777 5766. E-mail: cvdchile@netup.cl

Agradecimiento:
Agradecemos muy especialmente a la Dra. Regina Rabinobich (NIAID, NIH) por su valioso apoyo y asistencia.

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