Análisis de paternidad utilizando
cuatro marcadores de DNA
amplificados mediante la reacción
en cadena de polimerasa

Paternity analysis using four DNA
markers amplified by polymerase
chain reaction

Hugo Jorquera G, Mónica Acuña P, Lucía Cifuentes O,
Eugenia Aguirre M, Fabián Moreno Ch

Background: DNA typing in forensic analysis is a useful tool to analyze paternity due to its high discrimination power. Aim: To report the experience of Servicio Medico Legal in Santiago, resolving cases of dubious paternity. Subjects and methods: Four highly polymorphic loci, amplified by polymerase chain reactions, were analyzed in 153 cases of uncertain paternity. The paternity index was calculated for each case. Results: The four genetic markers analyzed provided an exclusion probability of 0.933 for the general population in Santiago. Thirty seven cases were excluded as parents. In 31 cases, the paternity index ranged from 19 to 100, considered as probable paternity and 77 cases had an index of over 100, considered as almost certain paternity. Eight cases had an index between 0.5 and 19, considered as inconclusive. All loci met Hardy-Weinberg expectations and their frequencies were similar to other data from people living in Santiago. Conclusions: The use of these genetic markers proved to be very useful, reliable and with a high exclusion power for paternity analysis.
(Key Words: DNA fingerprinting; Genetics, medical; Paternity; Polymerase chain reaction)

Recibido el 12 de enero, 1999. Aceptado en versión corregida el 21 de julio, 1999.
Trabajo financiado parcialmente por proyecto FONDECYT Nº 96-1960405.
Unidad de Biología Molecular, Departamento de Laboratorios, Servicio Médico Legal.
Programa de Genética Humana, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.

La introducción de las técnicas de análisis de los polimorfismos de DNA de loci multialélicos ha tenido un enorme impacto en el ámbito de los análisis forenses y las pruebas de paternidad. Es así como han sido utilizados ampliamente marcadores de loci polimórficos como los VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) abordados mediante técnicas de corte con enzimas de restricción e hibridación por sondas (Restriction Fragment Lenght Polimorpysm)^1,2. La aparición de la técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction)³ a finales de la década de los 80 ha permitido utilizar esta última exitosamente en el análisis de estos marcadores, como también ha hecho posible aplicarla al estudio de los loci STR (Short Tandem Repeats)⁴. Estas pruebas han resultado de gran éxito en el campo forense, permitiendo entre otros, resolver problemas de paternidad dudosa, ya que debido al alto poder informativo que ellas ofrecen, frecuentemente sus resultados son altamente concluyentes.

En general, para resolver este tipo de casos se recurre a la tipificación del DNA de las personas involucradas, es decir, al padre presunto, a la madre y al hijo. Sin embargo, debido a que en algunas situaciones es probable que uno de los progenitores se encuentre ausente, ya sea por su deceso u otra razón, es posible reconstituir el genotipo del familiar ausente⁵. Debe considerarse que para casos como el mencionado solamente son útiles los marcadores locus específico o monolocus, como los que han sido utilizados en este trabajo, ya que los sistemas multilocus como el DNA Fingerprinting, si bien pueden ser altamente informativos en estudios de paternidad convencionales, no permiten realizar la reconstitución de un genotipo.

El presente trabajo muestra un análisis de 153 casos de paternidad consultados en la Unidad de Biología Molecular del Servicio Médico Legal durante el año 1997, para ilustrar la utilidad de los marcadores moleculares en la investigación de la paternidad. En él se describen además las frecuencias génicas obtenidas para tres marcadores del tipo STR (D12S1090, D3S1744 y D18S849) y uno del tipo VNTR (D1S80) utilizados en la misma población.

MATERIAL Y MÉTODO

Población estudiada. Se analizaron 445 individuos consultantes por casos de paternidad, procedentes de 153 consultas realizadas por Tribunales de Menores y del Crimen de Chile, los cuales provenían, en su mayoría, de juicios por filiación y un reducido número por delitos de violación.

Preparación de las muestras. Las muestras de sangre fueron obtenidas por punción venosa en la Unidad de Sexología Forense del Servicio Médico Legal de Santiago. La extracción de DNA se llevó a cabo utilizando el método orgánico descrito por Budowle et al⁶.

El DNA fue cuantificado mediante electroforesis en geles de agarosa al 1%, teñidos con bromuro de etidio, utilizando como estándar cantidades conocidas de DNA de la línea celular K562.

Tipificación de polimorfismo en el locus D1S80. Las tipificación de DNA del locus D1S80 fue realizada mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)³, utilizando los partidores y programa de amplificación descritos por Kasai y cols⁷. La amplificación se llevó a cabo en un termociclador Perkin-Elmer 9600, utilizando entre 5 a 20 ng de DNA genómico como templado. Para resolver los fragmentos de DNA amplificados se utilizó electroforesis en geles de poliacrilamida verticales de 0,4 mm de grosor y los alelos fueron detectados utilizando tinción de plata⁸.

Tipificación de polimorfismo en los loci STR D12S1090, D3S1744 y D18S849. El análisis de polimorfismo en los loci STR (short tandem repeats) D12S1090, D3S1744 y D18S849 se realizó utilizando el kit Quick-Type Multiplex I de Lifecodes Corp.

La amplificación de DNA se realizó usando 5 ng de DNA como templado, utilizando un termociclador Perkin-Elmer 9600 mediante el programa de amplificación descrito por el proveedor. Para resolver los fragmentos de DNA amplificados se utilizaron geles de poliacrilamida al 6% en condiciones denaturantes (urea) de 0,4 mm de grosor. La detección de los alelos en el gel se realizó mediante tinción de plata.

Análisis genético poblacional. En los casos analizados se procedió a calcular el Indice de Paternidad⁹ y con él, a estimar la probabilidad a posteriori de que el padre presunto fuera el padre biológico del/los hijo/s atribuido/s de acuerdo a la siguiente igualdad:

L= Indice de paternidad=	frecuencia del genotipo del presunto
	padre entre los posibles padres
	frecuencia del genotipo del presunto
	padre en la población general

 

	L
Probabilidad a posteriori de ser el padre =
	L + 1

La frecuencia de cada alelo para cada locus fue calculada por conteo directo a partir de los genotipos de los padres y madres analizados, asegurándose previamente que no existía parentesco entre ambos.

Las posibles desviaciones del Equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) fueron analizadas comparando las frecuencias de homocigotos/heterocigotos esperadas con las observadas en la muestra, utilizando la prueba de c² como prueba de bondad de ajuste¹⁰.

RESULTADOS

Se estudiaron un total de 153 casos de paternidades correspondientes a consultas realizadas por los tribunales de justicia. La Figura 1 muestra los valores de probabilidad de exclusión a priori de cada marcador y la probabilidad de exclusión a priori acumulativa, al utilizar los cuatro marcadores en conjunto, basados en las frecuencias génicas obtenidas de una población de Santiago (no publicado). En él puede observarse que el locus D18S849 presenta la menor probabilidad de exclusión (0,588), a pesar de contar con 12 alelos detectados en la población analizada. Por otra parte el locus D12S1090 presenta el mayor valor individual (0,855), siendo consecuentemente aquel que presenta el mayor polimorfismo del grupo, contando con 25 alelos detectados en la población de Santiago. Al graficar la probabilidad de exclusión acumulativa puede observarse que el valor se incrementa a medida que se van agregando marcadores, alcanzando en su conjunto un poder de exclusión a priori de 0,993.

FIGURA 1. Probabilidad de exclusión individual y acumulativa de 4 loci.

 

 

 

 

 

 

Del total de casos de paternidad estudiados, 116 resultaron en la inclusión del presunto padre lo que corresponde al 75,82% de los casos y 37 fueron exclusiones de este último, representando al 24,18%.

La probabilidad de paternidad mínima obtenida en los casos de inclusión fue de 86,51%, con un índice de paternidad L= 6,41 y la mayor de 99,99% con un índice de paternidad L= 9.999. En promedio, la probabilidad de paternidad obtenida en los casos de inclusión fue de 98,57%.

La Figura 2 muestra los resultados obtenidos en los 153 casos referidos en términos de índices de paternidad (L). Se agrupan en 5 categorías de acuerdo al valor de dicho estimador. Es así como 37 casos resultan con un L= 0 (exclusión); ningún caso se encontró en el rango de 0 a 0,5 ("paternidad improbable"), 8 casos cayeron en el rango de 0,5 a 19 ("inconcluyente"), 31 casos en el rango de 19 a 100 ("paternidad probable") y 77 casos en el rango >100 ("paternidad prácticamente probada"). Por lo anterior, se desprende que de todos aquellos casos en que no hubo exclusión de paternidad sólo 6,9% resultó inconcluyente, en tanto que la paternidad se consideró probada en 66,4% de los casos y fue sugerida con alta probabilidad en el restante 26,7% de los casos.

FIGURA 2. Indices de paternidad en 153 casos.

En cuanto a los casos de exclusión del presunto padre, 4 casos resultaron excluidos por 1 locus, 15 por dos loci, 13 por tres y 5 por los cuatro marcadores utilizados. Cabe señalar que aquellos casos excluidos sólo por 1 locus, fueron reanalizados mediante otros marcadores para confirmar el resultado.

Como una forma de analizar si aquellas personas que fueron analizadas, por consultas de paternidad, comprenden un subgrupo especial dentro de la población general, ya sea por pertenecer a una determinada clase social y, por ende, poseer una determinada proporción de genes amerindios o por alguna otra razón, se estudiaron las frecuencias génicas para los cuatro loci analizados a partir de los genotipos de padres y madres de la muestra en cuestión (se hace presente que no se incluyeron casos con parentesco entre padre y madre). Como puede observarse en la Tabla 1, los cuatro loci analizados se encuentran en equilibrio de Hardy-Weinberg como se desprende de los valores de c² obtenidos. Además, al ser comparados los datos de este estudio con los obtenidos en un trabajo realizado en población general de Santiago (no publicado) no se observan diferencias significativas que den cuenta de una distribución diferente en la estructura genética de aquellos que consultaron por paternidad dudosa (D1S80 p= 0,3092; D12S1090 p= 0,5803; D3S1744 p= 0,6717; D18S849 p= 0,7857).

Tabla 1. Frecuencia genética de los loci D1S80, D12, D3 y D18 en individuos consultantes por paternidad
		LOCUS
	D1S80	D12	D3	D18
ALELO	N-281	N=284	N=280	N=283
9		0,099
10		0,010
11		0,035
12		0,042		0,002
13		0,032		0,005
14		0,014		0,044
15		0,004	0,100	0,269
16		0,007	0,109	0,385
17		0,009	0,132	0,194
18	0,242	0,012	0,377	0,081
19		0,044	0,168	0,019
20	0,004	0,077	0,1082
21	0,020	0,074	0,023
22	0,027	0,102	0,009
23	0,009	0,060
24	0,281	0,058
25	0,110	0,106
26	0,007	0,104
27	0,005	0,065
28	0,057	0,007
29	0,028	0,021
30	0,075	0,009
31	0,109
32	0,002	0,002
33	0,002
34	0,007
35	0,002
36	0,011
41	0,004
heterocigocidad	229	258	228	192
observada
c2 Homoc.	0,251	1,489	1,251	3,129
c2 Heteroc.	0,052	0,116	0,346	1,141

DISCUSIÓN

El trabajo expuesto representa la primera comunicación en Chile sobre la utilización de marcadores de ADN de loci polimórficos amplificados por PCR en problemas de paternidad. En este caso se han utilizado cuatro sistemas analíticos locus específicos o monolocus. Estos, si bien poseen un poder de exclusión a priori menor que los sistemas multilocus o fingerprinting¹¹, ofrecen la ventaja de poder tipificarse en mínimas cantidades de muestra (del orden de los nanogramos de DNA), posibilitando extraer material útil desde especímenes tan pequeños como una gota de sangre o saliva, raíz de pelo, etc, situación no despreciable al someter a estos exámenes a niños recién nacidos o a personas en las cuales la punción venosa resulta complicada. Por otra parte, el análisis locus específico permite determinar con exactitud el genotipo de los individuos analizados, permitiendo la reconstrucción de genotipos de personas ausentes a través de la tipificación de sus familiares directos⁵. Como muestran los resultados, el sistema de cuatro marcadores utilizado resulta con un poder de exclusión a priori del 99,3% en gran parte aportado por el poder de discriminación de los loci D1S80 y D12S1090, quienes en conjunto entregan un valor sobre el 95%, siendo los más polimórficos del grupo. Por ello no resulta sorprendente que sobre el 66% de los casos de inclusión analizados hayan sido concluidos con un índice de paternidad superior a 100, lo que otorga una probabilidad de paternidad a posteriori sobre el 99% de certeza, aportando un resultado concluyente con mucha mayor frecuencia que los sistemas serológicos tradicionales¹². Cabe señalar que los casos en que se obtuvo un índice de paternidad entre 0,5-19 (inconcluyente) fueron satisfactoriamente resueltos, agregando otro set de 3 marcadores STR (loci CSF1PO, TPOX y TH01). De igual forma se hizo en los casos en que la exclusión se observó tan sólo con uno de los loci descritos en este estudio. Se descartó la paternidad sólo en aquellos casos en que en hubo exclusión en a lo menos dos loci, ya que existe una mínima posibilidad que se observe una falsa exclusión como consecuencia de una mutación.

Al analizar las frecuencias génicas obtenidas de la población en estudio y compararlas con datos de población general de Santiago, no se obtuvieron diferencias significativas, indicando que la población que consulta por paternidad en el Servicio Médico Legal no representaría un grupo particularmente diferenciable genéticamente del resto de la población chilena en base a estos marcadores, lo que estaría en concordancia a lo encontrado en otros estudios poblacionales que muestran que estos loci no difieren significativamente dentro de un mismo grupo racial^8,13. La utilización de marcadores de DNA de loci polimórficos del tipo STR ha revolucionado la tipificación forense ya que se han desarrollado una serie de sistemas de amplificación de tipo "multiplex", los que permiten coamplificar en una sola reacción de PCR tres o más loci. Por otra parte, la elección de un conjunto de loci STR con alelos en un rango de peso molecular diferente, permite su separación simultánea, haciendo posible resolver hasta cuatro de ellos en una misma corrida electroforética. En la actualidad está teniendo gran relevancia la utilización de sets de hasta 8 loci STR coamplificables en una sola reacción de PCR y que pueden resolverse simultáneamente debido a que los primers son marcados con fluoróforos de colores diferentes que pueden ser analizados mediante detectores de fluorescencia inducida por láser¹⁴. Todo ello tiene la ventaja de poder obtener, en un mínimo de tiempo, un resultado altamente confiable ya que el poder de discriminación de varios loci STR permite alcanzar valores de probabilidad de exclusión de paternidad superiores a 0,9999. Vistas todas estas ventajas, la utilización de estos sistemas en problemas de paternidad los hace especialmente útiles y demuestran ser una herramienta versátil y confiable en la resolución de estos casos.

Correspondencia a: Hugo Jorquera G. Unidad de Biología Molecular, Departamento de Laboratorios, Servicio Médico Legal. Av. La Paz 1012. Fono: 737 03 89 anexo 342. Fax: 737 13 23. E-mail: ubionmol@ctcinternet.cl.

REFERENCIAS

1. WYMAN A, WHITE R. A highly polymorphic locus in human DNA. Proc Natl Acad Sci (USA) 1980; 77: 6754-8.

2. BUDOWLE B, GUISTI AM, JS BAECHTEL FS, FOURNEY RM, ADAMS DE, PRESLEY LA ET AL. Fixed-bin analysis for statistical evaluation of continuous distributions of allelic data from VNTR loci for use in forensic comparasions. Am J Hum Genet 1991; 48: 841-55.

3. MULLIS K, FALOONA F, SCHARF S, SAIKI R, HORN G, ERLICH H. Specific enzimatic amplification of DNA in vitro: The polymerase Chain Reaction. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 1986; 51: 263-73.

4. HAMMOND HA, JIN L, ZHONG Y, CASKEY CT, CHAKRABORTY R. Evaluation of 13 short tandem repeat loci for use in personal identification applications. Am J Hum Genet 1994; 55: 175-89.

5. JORQUERA H, CIFUENTES L, MORENO F, AGUIRRE E. Paternity analysis when the putative father is missing: First case in Chile. J Forensic Sci (en prensa).

6. COMEY C, KOONS B, PRESELEY K, SMERIK J, SOBIERASKI C, STANLEY D. DNA extraction strategies for amplifyed fragment lenght polymorphism analysis. J Forensic Sci 1994; 39: 1254-69.

7. KASAI K, NAKAMURA Y, WHITE R. Amplification of a variable number of tandem repeats (VNTR) locus (pMCT118) by the polymerase chain reaction. J Forensic Sci 1990; 35: 1196-200.

8. BUDOWLE B, BAETCHEL FS, SMERICK JB, PRESLEY KW, GIUSTI AM, PARSONS G ET AL. D1S80 population data in Africans, Americans, Caucasians, Southeastern Hispanics and Orientals. J Forensic Sci 1995; 40: 38-44.

9. WIENER AS. Chances of proving non paternity with a system determined by triple allelic codominant genes. Am J Hum Genet 1968; 20: 279-82.

10. NEI R. Estimation of average and genetic distance from a small number of individuals. Genetics 1978; 89: 583-90.

11. ARMANET L, AGUIRRE R, VARGAS J, LLOP E, CASTILLO S, CIFUENTES L. Estudio de paternidad aplicando el polimorfismo del DNA: evaluación en relación a los métodos convencionalmente usados en Chile. Rev Méd Chile 1995; 123: 560-6.

12. BRAVO M, CIFUENTES L. Análisis de paternidad: Experiencia en Colombia. Rev Méd Chile 1997; 125: 419-23.

13. JORQUERA H, BUDOWLE B. Chilean population data on ten PCR-based loci. J Forensic Sci 1998; 43: 171-3.

14. DEMERS D, KELLY C, SOZER A. Multiplex STR analysis by capillary electrophoresis. Profiles in DNA 1988; 1: 3-5.