CIENCIAS DE LA TIERRA, ECOLOGÍA Y BIOLOGÍA MEDIOAMBIENTAL

Distribución de genes de resistencia a arsénico en bacterias aisladas de sedimentos con concentraciones variables del metaloide

Distribution of arsenic-resistant genes in bacteria from sediments with different concentrations of arsenic

Carolina Mellado¹, Víctor Campos^1,2 & María A. Mondaca¹*

¹Departamento. de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción, Casilla 160-C. Concepción, Chile.

²Centro de Ciencias Ambientales EULA-Chile, Universidad de Concepción, Casilla 160-C, Concepción, Chile. *E-mail: mmondaca@udec.cl

RESUMEN

Palabras claves: arseniato, bacterias arseniato-reductoras, genes arsCBA.

ABSTRACT

Arsenic is a toxic element, widely distributed in terrestrial and aquatic environments. Microbial biotransformation processes play a key role in the biogeochemical cycle of arsenic and can be involved in the mobility, distribution and bioavailability of the arsenic species in the environment. The objective of this study was to relate the presence of the arsCBA genes of arsenate-reducing bacteria isolated from sediments coming from different sectors of the Camarones River (Arica y Parinacota region, Chile) showing different arsenic concentrations. We isolated 34 arsenate-resistant bacteria for which tolerance levels to As (III) and As (V) were determined as the arsenate reducing activity by semi-quantitative technique with AgNO3 and the presence of the ars genes, by PCR. All strains were tolerant to As (III) and As (V) and showed the arsC gene, which is capable of reducing As (V) to As (III). The arsB gene was detected in 86% of the strains present in the sediments with higher concentrations of arsenic (Illapata sector) while and the the arsA gene was detected in 71%. The strains isolated from sediments with lower arsenic concentrations showed the presence of the arsB and arsA genes in the 80% and 40% of isolates from the "Esquiña" sector and in 50% and 25% of isolates from the "Desembocadura" sector. According to this, we can conclude that detection frequency of ars genes of the strains under study increase in those river sections having higher arsenic concentrations, but the resistance to arsenic does not increase concomitantly.

Keywords: arsenate, arsenate-reducing bacteria, arsCBA genes.

INTRODUCCIÓN

El arsénico es un metaloide tóxico y ampliamente distribuido en ambientes terrestres y acuáticos. En éstos, predominan las formas inorgánicas, principalmente como arsenito [As(III)] y arseniato [As(V)], siendo la primera la especie más tóxica y móvil. La transformación bacteriana juega un importante rol en el ciclo biogeoquímico del arsénico, interviniendo en la movilidad, distribución y biodisponibilidad de las distintas especies de arsénico en el ambiente (Mukhopadhyay et al. 2002). En lugares contaminados con el metaloide, se han aislado microorganismos que presentan diversos mecanismos de resistencia que les permite tolerar las concentraciones de arsénico que mantiene su hábitat. Los principales mecanismos de resistencia bacteriana, se encuentran asociados a determinantes genéticos, que les otorgan la capacidad de realizar transformaciones de oxidación y/o reducción del metaloide (Silver & Phung 2005). En el caso de las bacterias arseniato-reductoras Gram-negativas, el sistema más estudiado corresponde al operón ars el cual puede ser de origen plasmidial o cromosomal y funcionar bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas (Silver & Phung 2005). En el plásmido R733, de E. coli, se han encontrado cinco genes: arsA, arsB, arsC, arsD y arsR, mientras que a nivel cromosomal solo tres: arsB, arsC, y arsR. El gen arsC, codifica para una proteína encargada de mediar la reducción de arseniato a arsenito en el citoplasma, para luego ser eliminado hacia el exterior de la célula a través de una bomba específica de eflujo (ATPasa) asociada a una subunidad integral en la membrana, formando el complejo arsAB, codificado por los genes arsA y arsB, respectivamente. Los genes arsD y arsR codifican para proteínas responsables de la regulación del operón (Rosen 2002).

La contaminación por arsénico en el norte de Chile es principalmente de origen geológico y los niveles de éste en el río Camarones (XV región) supera 100 veces el límite permitido por la Organización Mundial de la Salud, EPA y la Norma Chilena 409, para el consumo de agua potable (Yañez et al. 2005). Estudios realizados por Escalante et al. (2009) demuestran que los sedimentos del río Camarones poseen una actividad biológica responsable de la transformación de arsénico mediante bacterias reductoras del metaloide. De acuerdo a ello, el objetivo de este trabajo fue relacionar la frecuencia de aparición de los genes arsCBA con distintas concentraciones de arsénico presente en los sedimentos de diferentes sectores del río Camarones (Región Arica y Parinacota, Chile).

MATERIALES Y MÉTODOS

Las cepas bacterianas fueron aisladas desde sedimentos de los sectores Illapata, Esquiña y Desembocadura del río Camarones y del río Lauca (Region Arica y Parinacota, Chile). Estos sectores presentan 1,3; 1; 0,5 y 0,09 mg arsénico L^-1 total, respectivamente.

Determinación de niveles de tolerancia

Los niveles de tolerancia a arsénico se determinaron mediante la técnica de dilución seriada en placa (NCCL 1992). Se utilizó agar Luria (Difco), al cual se añadió concentraciones líquidas variables de arseniato y arsenito de sodio, entre 1 y 100 mM y 1 y 50 mM, respectivamente (La concentración aumenta el doble para cada concentración de la serie; Escalante et al. 2009). Cada una de las placas fue inoculada con diluciones apropiadas de cultivos bacterianos de 24 h de incubación. Como control, se inocularon placas con agar Luria (Difco) sin arsénico. Las placas se incubaron a 25°C durante 24 a 48 h y se observó la presencia de desarrollo bacteriano (Muller et al. 2003). Las cepas bacterianas fueron seleccionadas de acuerdo a los descrito por Rokbani et al. (2007)

Actividad reductora de arseniato Las cepas bacterianas se cultivaron en caldo Luria y se incubaron a 25°C por 24-48 h. Cuando el cultivo alcanzó una densidad óptica entre 0.4-0.6_abs a 600 nm, se tomó 1mL del cultivo, se traspasó a un tubo Eppendorf y se centrifugó a 1500 rpm durante 10 min. El pellet obtenido fue lavado dos veces con medio mínimo descrito por Macur et al. (2004), adicionado con lactato, para luego resuspenderlo en 1 mL del mismo medio. Cien microlitros de la suspensión celular se agregó a un tubo Eppendorf con 400μ! de medio mínimo (pH 7.0) adicionado con As(V) 2mM. Luego, se incubaron a 25°C durante 24-48 h. Posteriormente se agregaron 100μ! de AgNO₃, 0.1 M. Los resultados obtenidos fueron comparados con un estándar descrito por Simeonova et al. (2004).

Detección de los genes arsABC, mediante PCR

Las cepas bacterianas fueron cultivadas en caldo Luria por 24 h a 25°C. El ADN total se obtuvo a partir de un cultivo de cada una de las cepas en caldo Luria de 18 a 24 h de incubación a 25°C, utilizando el kit Instagene^TM Matrix (BioRad), de acuerdo a las instrucciones de los proveedores. La presencia de los genes arsABC, se detectó mediante PCR utilizando como partidores los mencionados en la Tabla 1. El análisis de PCR se realizó en un termociclador Px2 Thermal cycler (Thermo, electron Corporation). La mezcla de reacción estuvo compuesta por buffer Tris-HCl (pH 8.3) 10 mM, 50 mM KCl, 2.0 Mm MgCl2, 200 nM de cada partidor, 0.625 U de Taq polimerasa (Roche) por 25 jjl, y 50 ng ADN (templado). Se utilizó un protocolo de amplificación diferente para cada set de primer, como se muestra a continuación: Paso inicial de denaturación (94°C por 3 min) seguido por 30 a 35 ciclos de 94°C por 30 s, 58°C por 30 s y 72°C por 30 s (arsA) o 30 a 35 ciclos de 94°C por 30 s, 59°C por 30 s, y 72°C por 30 s (arsBy arsC) y 30 a 35 ciclos de 94°C por 30 s, 42°C por 30 s y 72°C por 30 s (arsC). La extensión final se realizó por 7 min a 72°C. Enterobacter aerogenes fue utilizada como control positivo (Escalante et al. 2009). Agua DEPC con grado biología molecular (MoBio, Inc) fue utilizada como control negativo. Los productos de amplificación (alícuotas de 5- a 10-μΓ) fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (0,5 μg de bromuro de etidio por mL). Las bandas fueron visualizadas en un transiluminador UV (Saltikov & Olson 2002).

Análisis estadísticos

Los resultados de la detección de genes arsABC, se sometieron a análisis estadísticos de escalamiento multidimensional no paramétrico. Para comparar las diferentes zonas de muestreos, una matriz binaria fue construida en base al número de bacterias con genes arsABC, para cada sector de muestreo. Los analisis de clusters y MDS fueron realizados mediante Primer 5 software package (Clarke & Gorley 2001).

RESULTADOS

Al estudiar la capacidad reductora de las cepas bacterianas ensayadas, mediante la técnica semi-cuantitativa con AgNO₃, se encontró que el 42,8% de las bacterias aisladas

desde sedimentos del sector Illapata fueron capaces de reducir entre 25-50% el arseniato del medio, mientras que el 57% de ellas biotransformó a arsenito entre 75 y 90% del arseniato total. El 70% de las cepas provenientes del sector Esquiña fueron capaces de reducir entre 25-50% y el 30% redujo entre 75-70% del arseniato del medio a arsenito. En las cepas pertenecientes al sector Desembocadura, esta relación corresponde a un 85% de las cepas con capacidad de reducir entre 75-90% y un 25% lo redujo entre 25-50%. Mientras que el 100% de las bacterias provenientes del río Lauca solo fueron capaces de reducir hasta un 50% del arseniato del medio (Tablas 2 y 3).

Detección de los genes arsABC, mediante PCR Los resultados muestran la existencia de cepas bacterianas capaces de tolerar elevados niveles de arsenito y arseniato, motivo por el cual se investigó la presencia de los genes involucrados en la reducción de arseniato a arsenito en el citoplasma y en el eflujo de arsenito al exterior. Al realizar una PCR, utilizado los partidores diseñados para el operón ars de E. coli, se obtuvo un producto de amplificación de 370 pb aproximadamente (Fig. 1), que correspondió al gen arsC, en 22 de las 34 cepas ensayadas, de acuerdo a lo descrito por Saltikov & Olson (2002). A las cepas arsC negativas se les realizó una nueva PCR, utilizando los partidores diseñados para el operón ars de Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas putida, resultando todas las cepas positivas, con un producto de amplificación de 450 pb. Para la amplificación de los genes arsA y arsB se utilizaron partidores diseñados para el operón ars de E. coli, en este ensayo 24 cepas dieron resultados positivos para el gen arsB (producto de amplificación de 219 pb) y 13 cepas para el gen arsA (producto de amplificación de 186 pb) (Tabla 2).

Tabla 1. Partidores utilizados para amplificar los genes arsCBA de las cepas bacterianas en estudio.
Table 1. Primers used to amplify arsCBA genes of the bacterial strains studied.

Tabla 2. Caracterización de 34 cepas bacterianas aisladas desde los distintos sectores del río Camarones y Lauca.
Table 2. Characterization of 34 bacterial strains isolated from different sites of the Camarones and Lauca river.

Análisis estadísticos

Para determinar la similitud genética de las cepas bacterianas en estudio, respecto de la presencia de los genes de resistencia a arseniato (operón ars), se utilizó el análisis de Escalamiento Multidimensional no paramétrico (MDS), el cual se basa en el cálculo de coeficientes de similitud/disimilitud entre muestras, en este caso el coeficiente de similitud de Bray-Curtis (Bray & Curtis 1957). El análisis resulta en un diagrama de puntos, en el que cada punto representa una muestra y la distancia entre ellos, sigue el mismo orden de rango que la similitud de composición de especies entre pares de muestras (Clarke & Warwick 1994). De acuerdo a ello, la Figura 2 muestra la presencia de dos grupos, que corresponden a las cepas bacterianas aisladas desde sedimentos del río Camarones (M1, M2, M3) y otro a las provenientes de los sedimentos del río Lauca (M4). Dentro del primer grupo es posible distinguir 3 subgrupos que corresponden a los sectores Illapata, Esquiña y Desembocadura y a su vez, se observa que Illapata y Esquiña, presentan mayor similitud entre las cepas bacterianas que componen la muestra (95%) que éstas con las obtenidas del sector Desembocadura (80%).

Tabla 3. Porcentajes de reducción bacteriana por sectores del río Camarones y Lauca.

Table 3. Bacterial reduction rate by sectors of the Camarones and Lauca river.

DISCUSIÓN

Existen evidencias que indican que los microorganismos presentes en ambientes enriquecidos con arsénico tienen un rol importante en la especiación química del mismo, por esta razón es interesante conocer las estrategias que éstos utilizan para transformar el metaloide y detoxificarlo, como mecanismos de supervivencia.

Los ensayos realizados para detectar la capacidad reductora de las cepas en estudio, indicaron que las cepas bacterianas provenientes de sedimentos del río Camarones presentan porcentajes de reducción entre un 25-90%, para el sector de Illapata; entre un 25-75% para el sector Esquiña y Desembocadura, mientras las cepas aisladas desde sedimentos del río Lauca arrojaron porcentajes de reducción que varían entre 10-25%. Indicando que los sectores contaminados con mayores concentraciones de arsénico muestran mayores porcentajes de reducción (Tabla 3). Patel et al. (2007), utilizando la cepa Pseudomonas sp. As-1 (aislada desde electroplacas de efluentes industriales), capaz de tolerar concentraciones de hasta 65 mM de As(V), demostraron mediante espectroscopía de absorción de rayos

X, que ésta cepa puede transformar hasta un 92% de areniato a arsenito, al adicionar 5mM de As(V) al medio de cultivo. Sugiriendo que los cultivos bacterianos fueron capaces de captar e incorporar As(V) al citoplasma, reducirlo a As(III) y expulsarlo de la célula, como mecanismo de detoxificación.

Los enfoques moleculares más frecuentemente utilizados para estudiar comunidades microbianas o estrategias de supervivencia bacteriana, aisladas desde ambientes contaminados con arsénico son la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sondas genéticas (Wobus et al. 2003). Las ventajas en la utilización de este tipo de métodos incluyen una mejor evaluación de la respuesta de las células bacterias frente a la contaminación ambiental (Saltikov & Olson 2002).

Al determinar la presencia del gen arsC, utilizando partidores diseñados para el gen arsC de E. coli, el 65% de las cepas en estudio dio resultados positivos. A las cepas arsC negativas, se les realizó una nueva amplificación utilizando los partidores diseñados para el gen en Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas putida, y en este caso, el 35% restante amplificó positivamente. El gen arsB, se detectó en el 71%, 80%, 50% y 44% de las cepas aisladas desde los sedimentos de los sectores Illapata, Esquiña, Desembocadura y río Lauca, respectivamente. Mientras el gen arsA se encontró en el 71%, 40%, 38% y 25% de las cepas aisladas desde los sedimentos de los sectores Illapata, Esquiña, Desembocadura y río Lauca, respectivamente. En cuanto a la aparición de genes arsAB, esta frecuencia es mayor en aquellos sectores donde la contaminación por arsénico mantiene también mayores niveles del metaloide (Illapata 1,3 mg arsénico L^-1 y Esquiña, 1 mg arsénico L^-1), respecto de las cepas provenientes del sector Desembocadura (0,5 mg arsénico L^-1) o a las pertenecientes al río Lauca (0,009 mg arsénico L^-1). La ausencia de los genes arsAB, puede deberse a que las cepas negativas, presenten el gen, pero que su secuencia sea lo suficientemente diferente a la secuencia de los partidores utilizados y por ende no sean detectables (Saltikov & Olson, 2002). Por otro lado la ausencia del gen arsB, podría explicarse como la presencia del operón ars en un transposón de tipo Tn-21, donde Tuffin et al. (2004) reportaron la aparición de un nuevo operón que carece del gen arsB, pero que sin embargo, es capaz de tolerar elevadas concentraciones de arseniato. Sin embargo, este nuevo modelo, aún no tiene explicación de cómo es bombeado el As(III) al exterior de la célula bacteriana.

Los resultados de la presencia o ausencia de genes arsABC fueron analizados mediante métodos estadísticos con el objeto de establecer una relación entre las diferentes concentraciones de arsénico correspondientes a los distintos sectores del río Camarones y Lauca y los determinantes

genéticos que presentaron las cepas aisladas de dichos sedimentos. Esto se confirma con los resultados del análisis por MDS (análisis de escalamiento multidimensional), que mostraron que la frecuencia de los genes arsCBA de Illapata y Esquiña sería similar, los que a su vez serían diferentes de los detectados en Desembocadura y ambos grupos, estarían distantes de los detectados en el río Lauca. Además, como medida informativa de la fidelidad del modelo, se utiliza el stress, el cual indica que mientras mayor sea la diferencia entre las disparidades y las distancias, mayor será el stress y por lo tanto menos confiable será el modelo. De esta forma su valor mínimo es cero y se considera un modelo bueno desde un valor de stress igual o inferior a 0,025 (Kruskal 1964). En el caso del análisis de ordenamiento de los datos en estudio, este arrojó un valor de stress inferior a 0,025, demostrando que existe un buen ordenamiento de la matriz de similaridad entre las cepas bacterianas analizadas generando un mapa de interpretación con bajo riesgo de error.

De acuerdo esta investigación, se puede concluir que, si bien la presencia de genes ars en las cepas bacterianas en estudio, es independiente de la concentración de arsénico del medio del que fue aislada, presenta una directa relación con la frecuencia de aparición y con la expresión de los mecanismos de supervivencia frente a la exposición a metaloide.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por el proyecto FONDECYT N° 1050088 y proyecto DIUC N°2008.036.035-1.0.

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Recibido: 02.08.10